電針對(duì)青春期慢性束縛應(yīng)激模型大鼠不同時(shí)段血清TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響*

俞秋云，孫 嵐，姜會(huì)梨，王 瑜，趙冰驄，楊昕婧，李 晶，梁星辰，孫 陽(yáng)，李 想，馮世醒，施 鵬，圖 婭△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院精神神經(jīng)疾患防治研究中心，北京100029;2.北京大學(xué)心理與認(rèn)知科學(xué)學(xué)院，北京100871)

實(shí)驗(yàn)研究

電針對(duì)青春期慢性束縛應(yīng)激模型大鼠不同時(shí)段血清TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響*

俞秋云1，孫 嵐2，姜會(huì)梨1，王 瑜1，趙冰驄1，楊昕婧1，李 晶1，梁星辰1，孫 陽(yáng)1，李 想1，馮世醒1，施 鵬1，圖 婭1△

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院精神神經(jīng)疾患防治研究中心，北京100029;2.北京大學(xué)心理與認(rèn)知科學(xué)學(xué)院，北京100871)

目的:觀察電針干預(yù)對(duì)青春期慢性束縛應(yīng)激模型(CRS)大鼠血清TNF-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、IL-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)表達(dá)的影響，探討與其相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制。方法:雄性5周齡SD大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和電針組，每組20只。對(duì)照組群養(yǎng);采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性束縛應(yīng)激造模，每日束縛6 h(9:00—15:00);電針組每日應(yīng)激前1 h給予電針刺激“百會(huì)”“印堂”穴，每天1次，每次20 min。以上3組同步平行干預(yù)28天，實(shí)驗(yàn)28天至35天，3組不作任何處理。以曠場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)價(jià)抑郁模型大鼠行為學(xué)。采用Bio-Plex技術(shù)檢測(cè)大鼠在第7、28和35天的血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平。結(jié)果:行為學(xué)檢測(cè):實(shí)驗(yàn)0天，各組大鼠曠場(chǎng)行為總分無(wú)顯著差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)28天，與模型組比較，電針組大鼠曠場(chǎng)行為總分有顯著增加(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)7天，與對(duì)照組比較，模型組TNF-α表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，IL-1β無(wú)顯著差異(P＞0.05);與模型組比較，電針組TNF-α表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)28天，與對(duì)照組比較，模型組TNF-α和IL-1β表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，電針組TNF-α和 IL-1β表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)35天，3組之間TNF-α和IL-1β表達(dá)均無(wú)顯著差異。結(jié)論:慢性束縛應(yīng)激可誘導(dǎo)青春期大鼠血清TNF-α、IL-1β相應(yīng)的表達(dá)升高和降低，而電針干預(yù)可顯著對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，這可能是電針發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制之一。

電針;青春期;慢性束縛應(yīng)激;抑郁癥;TNF-α;IL-1β

抑郁癥在全球范圍內(nèi)有著很高的發(fā)病率，且有研究表明有46.4%的終身患病率，青春期是抑郁癥高發(fā)的一個(gè)時(shí)段［1］。研究表明，抑郁癥的起病與慢性、低程度的炎性反應(yīng)有關(guān)［2］。炎癥干擾已被確認(rèn)為一個(gè)潛在的治療包括抑郁癥在內(nèi)的精神疾病的靶點(diǎn)。針刺治療抑郁癥是已經(jīng)被證實(shí)用于抑郁癥療效明確的一種治療手段［3-4］，實(shí)驗(yàn)研究證明針刺對(duì)抑郁模型大鼠血清和大腦中炎性細(xì)胞因子有調(diào)節(jié)作用［5］。

青春期是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)重要階段，生理、心理和社會(huì)環(huán)境發(fā)生著巨大的改變，也是抑郁癥高發(fā)的一個(gè)階段［6］，因抑郁癥自殺的青少年人群發(fā)病率也在逐年攀升。目前針對(duì)青春期抑郁癥主要集中在臨床流行病學(xué)觀察，針對(duì)青春期抑郁癥的機(jī)制研究很少。青春期抑郁癥有其生理的獨(dú)特性，有研究表明青少年抑郁癥患者治療中使用抗抑郁藥物有很高的轉(zhuǎn)躁狂的風(fēng)險(xiǎn)［7-8］，5-HT 再攝取抑制劑(SSRIS)類藥物容易提高青少年自殺的風(fēng)險(xiǎn)［9］。對(duì)于青春期的抑郁癥患者，在藥物治療之外，選擇一個(gè)更為安全有效的治療手段顯得尤為必要。

本實(shí)驗(yàn)使用出生35天的雄性大鼠建立青春期慢性束縛應(yīng)激模型，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)行為學(xué)，Bio-Plex技術(shù)檢測(cè)血清中促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β，探討青春期抑郁模型大鼠體內(nèi)炎性細(xì)胞因子不同時(shí)段的表達(dá)及針刺對(duì)其表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，SPF級(jí)，5周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證編號(hào):NO.SCXK(京)2012-0001。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度:22℃ ～26℃，濕度:40% ±10%，自然晝夜節(jié)律。將60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control group，C)、模型組(CRS group，CRS)和電針組(EA group，EA)，每組20只。分別于實(shí)驗(yàn)第7天每組隨機(jī)處死6只，第28天對(duì)照組、模型組、電針組各隨機(jī)處死5、5、6只，第35天每組隨機(jī)處死6只。以上3組同步平行實(shí)驗(yàn)持續(xù)35天，第1到27天各組干預(yù)如前，實(shí)驗(yàn)28天至35天，3組不作任何處理，自由飼養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑

MILLIPLEX MAP Rat Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel試劑盒(RECYTMAG-65K-0.4，Millipore公司);Bio-plex 100 system懸液芯片系統(tǒng)(Bio-rad公司);Bio-plex pro II wash station洗板機(jī)(Bio-rad公司);96孔板振蕩器(Bio-rad公司);Shaking incubator振蕩培養(yǎng)箱(Bio-rad公司);離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R);水合氯醛(生產(chǎn)批號(hào):30037517，上海)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備和電針刺激方法

用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立抑郁大鼠模型［7］。將大鼠放入特制細(xì)鐵絲網(wǎng)內(nèi)，保持大鼠呼吸通暢，不壓迫大鼠，僅使其活動(dòng)受限，每天束縛6 h，束縛期間禁食禁水，造模結(jié)束后將被束縛的大鼠放回鼠籠，自由攝食攝水。電針組在每日應(yīng)激之前1 h給予電針干預(yù)，針刺穴位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［10］分別選取“百會(huì)”“印堂”穴，用30號(hào)1寸毫針(2.5 cm)平刺進(jìn)針，然后接華佗SDZ-V型電針針療儀，強(qiáng)度為1 mA，頻率為2 Hz，每次電針20 min，每日1次。

2.2 曠場(chǎng)行為總分

觀察各組大鼠在3 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總分，包括水平運(yùn)動(dòng)得分(為穿越格數(shù))和垂直運(yùn)動(dòng)得分(為后肢直立次數(shù))，在每只大鼠測(cè)試完成后，進(jìn)行酒精噴霧消毒處理，清除曠場(chǎng)內(nèi)大鼠殘留的氣味，打掃曠場(chǎng)內(nèi)排泄物。在實(shí)驗(yàn)前1天和實(shí)驗(yàn)第28天各測(cè)量1次。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

采用Bio-Plex檢測(cè)大鼠血清TNF-α、IL-1β的表達(dá)。以3.5 ml/Kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，于腹腔腹主動(dòng)脈采血，靜置后離心(4℃，3 000 rpm，15 min)，取上清，-80℃保存。檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照Bio-Plex試劑盒(Bio-rad公司)說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

3.1 電針對(duì)慢性束縛應(yīng)激模型大鼠行為學(xué)的影響

從表1、圖1可見(jiàn)大鼠的曠場(chǎng)行為總分在實(shí)驗(yàn)前1天，各組之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)28天，與模型組相比電針組大鼠的曠場(chǎng)行為總分有極顯著差異(P ＜0.01)。

表1 應(yīng)激0天、28天各組大鼠曠場(chǎng)行為總分的比較(M±Q)

圖1 各組大鼠曠場(chǎng)行為總分的比較

3.2 電針對(duì)慢性束縛應(yīng)激模型大鼠血清TNF-α表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)7天，與對(duì)照組比較，模型組TNF-α表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，電針組TNF-α表達(dá)顯著降低(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)28天，與對(duì)照組相比，模型組TNF-α表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，電針組TNF-α表達(dá)顯著降低(P＜0.01);35天，3組大鼠之間TNF-α表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

表2 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

表2 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

注:與對(duì)照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，##P ＜0.01

組別 7天 28天 35天對(duì)照組(C)40.67 ±4.50 54.60 ±6.87 62.41 ±4.82模型組(CRS) 52.97 ±2.87＊＊ 71.70 ±10.15＊＊ 64.43 ±6.48電針組(EA) 43.65 ±4.70## 43.75 ±8.88## 57.60 ±2.40 F 14.667 14.004 3.126 P 0.000 0.001 0.073

圖2 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

3.3 電針對(duì)慢性束縛應(yīng)激模型大鼠血清IL-1β表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)7天，3組大鼠之間IL-1β表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)28天，與對(duì)照組相比，模型組IL-1β表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，電針組IL-1β表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05);與模型組相比，電針組IL-1β表達(dá)顯著降低(P＜0.01);35天，3組大鼠之間IL-1β表達(dá)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組大鼠血清IL-1β表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

表3 各組大鼠血清IL-1β表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

注:與對(duì)照組相比，＊＊P ＜0.01;與模型組相比，##P ＜0.01

組別 7天 28天 35天61.33 ±11.60 60.71 ±15.77 116.33 ±17.00模型組(CRS) 61.17 ±11.10 134.1 ±34.25＊＊ 103.50 ±9.50電針組(EA) 60.77 ±8.70 73.4 ±16.18## 114.32 ±21.36對(duì)照組(C)F 0.005 14.53 1.027 P 0.995 0.000 0.382

圖3 各組大鼠血清IL-1β表達(dá)的比較(±s，pg/ml)

4 討論

1999年Maes提出了“抑郁癥的炎性應(yīng)答系統(tǒng)模型”(inflammatory response model of depression)，并提出了“抑郁癥的細(xì)胞因子假說(shuō)”［11］。此后研究者們從多個(gè)角度闡明這一假說(shuō)。慢性束縛應(yīng)激模型是一種可靠的抑郁癥模型，現(xiàn)在被廣泛運(yùn)用于抑郁癥的研究中［12-14］。

行為學(xué)結(jié)果采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總分的評(píng)價(jià)，來(lái)反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自主行為［15-17］。在本實(shí)驗(yàn)中，青春期CRS大鼠經(jīng)過(guò)28天的實(shí)驗(yàn)后，曠場(chǎng)行為總分明顯減少，說(shuō)明青春期CRS大鼠運(yùn)動(dòng)活性降低、對(duì)新環(huán)境的探索行為減少。而電針可以逆轉(zhuǎn)這一行為學(xué)改變。實(shí)驗(yàn)中還觀察到，28天曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠排尿排便次數(shù)增多，理毛次數(shù)增加;電針組排尿排便和理毛次數(shù)都減少。

嚙齒類哺乳動(dòng)物在青春期的行為學(xué)表現(xiàn)和人類的青春期極為相似。SD雄鼠在正常的發(fā)育過(guò)程中，雄鼠出生以后23～25天睪丸開始下降，30～35日齡進(jìn)入陰囊，45～60天產(chǎn)生精子，60以后性成熟［18］。Laviola等人，將大鼠出生后21天到60天稱為青春期，21天到34天稱為青春期前或者少年期，35天到46天稱為青春期中期，47天到60天稱為青春期晚期［19-20］。本實(shí)驗(yàn)選用的是出生后35天的雄性大鼠，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到28天以后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)入成年階段。

本研究中發(fā)現(xiàn)，在青春期，大鼠血清中TNF-α呈緩慢上升的趨勢(shì)，這種上升趨勢(shì)持續(xù)到成年后;而IL-1β則呈現(xiàn)低水平的表達(dá)，當(dāng)大鼠成年后，IL-1β呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)。

抑郁癥的發(fā)生與細(xì)胞因子水平的變化關(guān)系密切。以往研究者認(rèn)為人腦是免疫豁免器官，然而，隨著研究的深入，研究者開始意識(shí)到細(xì)胞因子能作用于與抑郁癥病理生理相關(guān)的伏隔核、杏仁核、海馬及前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)，通過(guò)一系列途徑和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙及神經(jīng)可塑性異常等［21］。

炎性細(xì)胞因子中的TNF-α、IL-1β被稱為促炎性細(xì)胞因子，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子［22］。抑郁癥患者血清中TNF-α與IL-1β明顯高于正常人［23］，臨床研究表明抑郁癥患者血清TNF-α水平與漢密爾頓抑郁量表總分和焦慮/軀體化、絕望感因子正相關(guān)，并且TNF-α與阻滯因子顯著正相關(guān)［24］。研究表明TNF-α與IL-1β具有協(xié)同作用，并且低劑量的TNF-α 可以誘導(dǎo) IL-1β 的產(chǎn)生［25］。

本研究發(fā)現(xiàn)CRS在大鼠青春期可以上調(diào)IL-1β、TNF-α的表達(dá)。而電針對(duì)其的作用是可以降低CRS青春期大鼠IL-1β、TNF-α的表達(dá)。7天的慢性束縛應(yīng)激對(duì)青春期大鼠血清IL-1β影響不明顯，但是顯著上調(diào)了TNF-α的表達(dá)水平;而28天的慢性束縛應(yīng)激對(duì)二者都產(chǎn)生顯著影響。電針都能對(duì)兩種細(xì)胞因子產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠性成熟后撤去對(duì)大鼠的一切干預(yù)手段，電針組和模型組的血清中TNF-α和IL-1β都逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。說(shuō)明青春期受到了應(yīng)激，在成年后會(huì)繼續(xù)受到其困擾，這種后續(xù)影響與TNF-α、IL-1β 無(wú)關(guān)。

本研究提示大鼠在青春期IL-1β表達(dá)水平和成年有顯著的差異，慢性束縛應(yīng)激模型可以使前炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β升高，抑郁癥的發(fā)生可能與細(xì)胞因子失衡有關(guān)，電針可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。青春期受到的刺激對(duì)成年后的影響不涉及TNF-α和IL-1β。

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Impact of Electro-acupuncture on Pubescent CRS Rats:Expressions of TNF-α and IL-1β at Different Time-points

YU Qiu-yun1，SUN Lan2，JIANG Hui-li1，WANG Yu1，ZHAO Bing-cong1，YANG Xin-jing1，LI Jing1，LIANG Xing-chen1，SUN Yang1，LI Xiang1，F(xiàn)ENG Shi-xing1，SHI Peng1，TU Ya1△
(1.Mental Disorder Control Center，School of Acupuncture and Tuina，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China;2.School of Psycology and Congnitive Science，Peking University，Beijing 100871，China)

Objective:To investigate the antidepressant effect of electro-acupuncture(EA)on the expressions of TNF-α and IL-1β in the pubescent rats with chronic restraint stress(CRS)，and to explore the relative immune mechanism.Methods:60 SD rats(male，five weeks)were randomized into the blank control group(group A，n=20)，the model group(group B，n=20)，and the electro-acupuncture group(group C，n=20).The rats in group A were bred in groups;CRS models were established by separate breeding combined with chronic restraint stress(immobilization for 6h daily from 9:00 to 15:00);in group C，electro-acupuncture intervention was applied on point GV20 and point GV29 for 20mins one hour before the restraint，once daily for 28 days.From the 28th day to 35th day，there was no treatment application in the three groups.Open-field test was used to assess the behavior of the CRS rats.Serum levels of TNF-α and IL-1β were detected with Bio-Plex method on 7th，28th and 35th day respectively.Results:In terms of scores of the open-filed test，there was no significant difference in the three groups before the experiment;on 28th day，the scores of group C were remarkably increased compared to those of group B(P ＜ 0.01).In terms of serum levels of TNF-α and IL-1β on 7th day，TNF-α level increased considerably in group B compared to that in group A(P ＜0.01)，but there was no significant differences in IL-1β level between the two groups(P ＞0.05);compared to group B，TNF-α expression was down-regulated significantly in group C(P ＜0.01).On 28th day，levels of TNF-α and IL-1β increased significantly in group B compared to those in group A(P ＜0.01);however，they decreased obviously in group C when compared to group B(P ＜0.01).On 35th day，there were no significant differences in serum levels of TNF-α and IL-1β among the three groups(P ＞0.05).Conclusion:CRS can raise TNF-α level and reduce IL-1β level in pubescent rats，and electro-acupuncture can regulate these changes，which may contribute to its antidepressant effect.

Electro-acupuncture;Puberty;Chronic restraint stress;Depression;TNF-α;IL-1β

R245.97

A

1005-0779(2017)10-0056-04

國(guó)家自然科學(xué)基金，編號(hào):81173334，81373729;北京中醫(yī)藥大學(xué)在讀研究生項(xiàng)目，編號(hào):2017-JYB-xs-047。

俞秋云(1992-)，女，2015級(jí)針灸推拿專業(yè)碩士研究生。

△通訊作者:圖婭(1955-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:針灸經(jīng)典理論的現(xiàn)代研究。

2017-04-18