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    合歡皮總皂苷抗腫瘤作用靶點鑒定與分子機制解析

    2017-10-28 06:39:27錢薏韓清華劉丹屠鵬飛曾克武梁鴻
    中國中藥雜志 2017年19期
    關(guān)鍵詞:抗腫瘤信號通路作用機制

    錢薏+韓清華+劉丹+屠鵬飛+曾克武+梁鴻

    [摘要] 合歡皮作為常用中藥,臨床常用于治療失眠、焦慮、腫瘤等?,F(xiàn)代藥理中針對合歡皮總皂苷(TSAJ)抗腫瘤活性多有報道,但由于單體成分分離困難,藥理機制難以開展。該研究采用MTT法和Hoechst 33258染色法,確認了TSAJ對肝癌細胞的生長抑制作用,構(gòu)建了表面修飾有TSAJ的固相親合微球,利用該固相微球特異性地從人肝癌細胞裂解液中富集靶點蛋白,再利用高分辨質(zhì)譜對富集到的靶點蛋白進行鑒定。采用MataboAnalyst 3.0處理數(shù)據(jù),篩選并確定了Exportin-2,Beta-actin-like protein 2,Myosin-9,Protein transport protein Sec61 subunit beta,Cytochrome c oxidase copper chaperone等5個靶點蛋白。這些蛋白分別具有調(diào)控細胞凋亡及細胞生長、分化、運動等功能,提示TSAJ的抗腫瘤機制可能與誘導(dǎo)細胞凋亡及抑制腫瘤血管生成有關(guān)。綜上所述,該研究利用TSAJ修飾的固相親和微球,特異性富集并鑒定了TSAJ的靶點蛋白,從靶點源頭上解釋了TSAJ抗腫瘤作用機制,同時也為中藥復(fù)雜體系的分子藥理機制研究提供了一種全新的思路。

    [關(guān)鍵詞] 合歡總皂苷; 抗腫瘤; 靶點鑒定; 信號通路; 作用機制

    [Abstract] Dried stem bark from Albizia julibrissin(AJ) is a common traditional Chinese herb with several therapy effects including insomnia, anxiety and anti-tumor. Recently, the anti-tumor effect and mechanism studies of AJ have drawn much attention; however, there are still some troubles in chemical composition separation, which leads to the difficulties in pharmacological research of AJ. In this study, we firstly confirmed the proliferation inhibitory effect of total saponins from AJ(TSAJ)on human hepatocarcinoma(HepG2) cells, and also tested the apoptosis induction effect of TSAJ. Then, we successfully captured the potential target proteins from HepG2 lysates by using TSAJ-modified solid beads, and identified the target proteins by LC-MS/MS. Finally, we confirmed 5 target proteins including Exportin-2, Beta-actin-like protein 2, Myosin-9, Protein transport protein Sec61 subunit beta,and Cytochrome c oxidase copper chaperone, which are responsible forcell apoptosis, proliferation, differentiation andmigration. In summary, our findings elucidate the potential anti-tumor mechanism of TSAJ from the direct target proteins, and provide a new insight for exploring the pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine.

    [Key words] total saponins from Albizia julibrissin; anti-tumor; target; pathway; mechanism

    合歡皮首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,是豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮,具有安神解郁,活血消腫的功效[1],常用于心神不安、憂郁失眠、肺癰瘡腫、跌撲傷痛等?,F(xiàn)代藥理研究表明,合歡具有鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、抗生育,抗菌等多種作用[2-5]。合歡皮總皂苷(TSAJ)是合歡皮的主要化學(xué)成分[6],近年來對其抗腫瘤作用多有報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TSAJ體內(nèi)體外抗腫瘤效果都十分顯著,體內(nèi)給藥荷瘤小鼠抑瘤率高達30% [7]。但由于皂苷類單體成分分離困難,合歡皮皂苷的抗腫瘤機制研究卻鮮有深入報道。

    藥物靶點的闡明是了解藥物作用機制的重要前提,對從源頭上揭示藥物的分子機制具有重要的指導(dǎo)意義[8]。作者通過把中藥活性成分與固相親和微球表面進行鍵合,利用中藥活性成分作為探針,直接從細胞中“鉤釣”直接作用靶點,進而對靶點蛋白的生物學(xué)功能進行分析并解釋其藥理機制。在本研究中,作者構(gòu)建了表面修飾TSAJ的固相微球,特異性地富集了人肝癌細胞裂解液中的靶點蛋白,然后進行高分辨質(zhì)譜分析和鑒定,最終采用MataboAnalysis 3.0篩選并確定靶點蛋白。通過對靶點蛋白生物學(xué)功能解析,闡釋了TSAJ的潛在分子藥理機制,為詮釋中藥多成分、多靶點的作用機制提供了新的思路。endprint

    1 材料

    1.1 藥物 合歡皮藥材購于陜西,經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系尚明英副教授鑒定為豆科植物合歡的干燥樹皮。HepG2人肝癌細胞系購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞中心。

    1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Macgene,中國);胎牛血清(PAN Biotech,德國);Epoxy-activated SepharoseTM 6B(GE Healthcare,美國);溴化噻唑藍四氮唑(MTT)(Sigma,美國);Hoechst 33258染色液(碧云天生物技術(shù)有限公司,中國);Sunrise-Basic酶標儀(TECAN公司,美國);細胞培養(yǎng)箱(SANYO,日本);DXS-3臺式顯微鏡(上海締倫光學(xué)儀器,中國);CIX100顯微鏡(OLYMPUS,日本)。

    2 方法

    2.1 細胞培養(yǎng) 將細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS和100 U·L-1青霉素,100 μg·L-1鏈霉素)進行傳代培養(yǎng),每2~3 d傳代1次,保證實驗用細胞在對數(shù)生長期中。

    2.2 合歡皮總皂苷的制備 合歡皮(18 kg)經(jīng)粉碎后,依次用8~10倍量95%乙醇(提取3次)和50%乙醇(提取8次)滲漉法提取,合并提取液并減壓回收溶劑至無醇味,再加適量的去離子水混懸,然后用2~4倍量乙酸乙酯和正丁醇分別萃取4次。用大孔吸附樹脂(18 L)對水相(883.5 g)進行處理,依次以水,20%,40%,60%,95%乙醇-水進行洗脫,根據(jù)TLC和HPLC結(jié)果將其分成3個組分,將皂苷類的組分3與正丁醇萃取物合并后共1.2 kg樣品拌樣,分2次上樣于硅膠柱(100~200 目),采用二氯甲烷-甲醇-水(100∶0∶0,10∶1∶0.1,5∶1∶0.1,5∶1∶0.1,7∶3∶0.5,6∶4∶1)梯度洗脫,根據(jù)TLC檢測結(jié)果合并成13個流分(1~13),其中總皂苷為組分9[9]。

    2.3 MTT法檢測細胞存活率 將對數(shù)生長期的細胞以5×103個/L的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)12 h,將上清替換成含藥培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后,棄上清,加MTT(2.5 g·L-1)溫箱孵育2 h,棄上清,加入DMSO復(fù)溶顯色,用酶標儀在570 nm波長下檢測吸光度A。

    2.4 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 將細胞以3×104個/L接種于內(nèi)置無菌玻片的24孔板中,培養(yǎng)12 h至細胞貼壁,將上清換成含藥培養(yǎng)基。24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛固定30 min;將多聚甲醛吸走,加入PBS清洗,清洗3次;棄去PBS,加入Hoechst 33258染液,染色30 min;將染液吸走,加入PBS清洗,每次5 min,清洗3次。最后,在載玻片上滴加甘油,封片,用熒光顯微鏡(激發(fā)波長352 nm,發(fā)射波長461 nm)觀察(×200)細胞核形態(tài)。

    2.5 表面鍵合TSAJ的固相微球制備 使用環(huán)氧基瓊脂糖凝膠微球,微球表面用1,4-雙(2,3-環(huán)氧丙烯基-)丁基作為連接臂偶聯(lián)環(huán)氧基團。使用前,先將微球溶脹并清洗,取500 μL含水微球與500 μL TSAJ溶液混合,37 ℃孵育過夜即可。制備好的固相微球放置于4 ℃避光保存。

    2.6 TSAJ靶點群的富集 將表面鍵合了TSAJ的固相微球與HepG2人肝癌細胞裂解液混合,置于4 ℃孵育過夜,然后用含0.01%NP40的洗脫緩沖液(50 mmol·L-1Tris pH 7.5,100 mmol·L-1NaCl,5 mmol·L-1EDTA,1 mmol·L-1DTT,0.01% NP40)清洗微球6次,離心并收集固相微球。加入含6 mol·L-1尿素和10 mmol·L-1DTT的PBS溶液,65 ℃加熱15 min,然后加入25 mmol·L-1碘乙酰胺繼續(xù)振搖孵育30 min。加入酶解緩沖液(2 mol·L-1尿素,1 mmol·L-1CaCl2,2 mg胰酶),37 ℃孵育過夜[10]。

    2.7 高分辨質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)鑒定和半定量分析 微球經(jīng)蛋白酶解后獲得混合肽段樣品,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后利用二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)(nano-LC-MS/MS)對各肽段進行鑒定。nano-LC-MS/MS由EASY-nLC-Ⅱ液相色譜儀和LTQ-Orbitrap離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific,美國)組成。吸取10 μL樣品溶液加樣至Captrap Peptide柱,洗脫除雜后進入RP-C18AQ毛細管液相色譜柱(100 μm×15 cm,Michrom Bioresources,美國)進行梯度分離。流動相由0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈(B)組成,梯度洗脫條件為:0~105 min,2%~40%B;105~110 min,40%~95%B;110~120 min,95%B。洗脫流速為300 nL·min-1。采用正離子模式采集數(shù)據(jù),電噴霧電壓為1.8 kV,質(zhì)譜掃描模式為全掃描,掃描范圍設(shè)置為m/z 350~2 000。利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件平臺Thermo Proteome Discoverer(1.4)所含的SEQUEST檢索軟件對獲得的PMF或CIDMS/MS肽段數(shù)據(jù)進行檢索匹配,鑒定蛋白質(zhì)成分并記錄響應(yīng)值。

    2.8 潛在靶點篩選及蛋白功能解析 所有數(shù)據(jù)采用MataboAnalyst 3.0中的Biomarker Analysis模塊進行t檢驗(P<0.05)和倍數(shù)變化分析(Fold change≥2),篩選得到最終5個靶點蛋白。采用UniProt數(shù)據(jù)庫中的UniProtKB搜索功能(http://www.uniprot.org/,Update in 2017-06-22),通過輸入蛋白名稱并限定物種為人,將所有檢索得到的蛋白校正為其官方名稱(Official Symbol),經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作,獲取靶點蛋白功能信息。endprint

    3 結(jié)果與分析

    3.1 TSAJ對人肝癌細胞系HepG2的生長抑制作用 MTT法檢測了TSAJ對HepG2細胞的生長抑制作用,發(fā)現(xiàn)TSAJ在0.78~12.5 mg·L-1對HepG2細胞的生長抑制作用具有濃度依賴性,見圖1,IC50為7.93 mg·L-1。

    3.2 TSAJ顯著增加HepG2細胞凋亡率 為了進一步驗證TSAJ通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用,將不同濃度TSAJ給藥HepG2細胞,作用24 h后,通過Hoechst 33258法染色檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示,TSAJ處理細胞后,細胞核隨給藥濃度增大越來越小,出現(xiàn)染色質(zhì)固縮的現(xiàn)象;核發(fā)出的藍色熒光逐漸增強,出現(xiàn)如黃色箭頭所示的核凋亡現(xiàn)象,見圖2。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),TSAJ能顯著增加HepG2細胞的凋亡率。

    3.3 TSAJ作用靶點群的富集與鑒定 利用環(huán)氧基瓊脂糖凝膠固相微球作為載體,構(gòu)建了表面修飾了TSAJ的固相親和微球。TSAJ修飾后,固相微球顏色明顯加深。同時顯微鏡下發(fā)現(xiàn),微球形狀沒有發(fā)生明顯改變,但微球表面質(zhì)感發(fā)生變化,反光性增強,進一步確認TSAJ成功鍵合在了固相微球表面,見圖3。

    采用表面修飾了TSAJ的固相微球和HepG2人肝癌細胞裂解液進行孵育,特異性地對靶點蛋白進行富集。為了排除非特異性結(jié)合,實驗分別設(shè)置結(jié)合組和TSAJ競爭組,向裂解液中加入TSAJ與表面鍵合TSAJ微球進行競爭,通過比較2組微球上的結(jié)合蛋白來篩選TSAJ特異性結(jié)合靶點。每組設(shè)置3個重復(fù)。

    采用LC-MS/MS高分辨質(zhì)譜對各組樣品進行鑒定及半定量分析,并將數(shù)據(jù)用MataboAnalyst 3.0及UniProt數(shù)據(jù)庫篩選靶點蛋白,得到的靶點蛋白名稱及功能見表1。

    3.4 TSAJ作用靶點群的功能解析 通過UniProt搜索并發(fā)現(xiàn),Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均與細胞增殖、細胞凋亡相關(guān),其中Exportin-2為細胞核轉(zhuǎn)運通道受體蛋白,又稱細胞凋亡易感蛋白[11];Cytochrome c oxidase copper chaperone為細胞色素C氧化的銅配體,參與細胞呼吸作用,與細胞生長關(guān)系密切[12]。除此之外,Beta-actin-like protein 2與Myosin-9均為細胞的骨架蛋白,可能與腫瘤細胞分化、運動、分泌等活動相關(guān)[13]。而Protein transport protein Sec61 subunit beta則是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)合成及分泌轉(zhuǎn)運的重要蛋白。因此猜測,TSAJ發(fā)揮抗腫瘤活性的機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞血管生成有關(guān)。

    4 討論

    藥物靶點是新藥研發(fā)的源頭,藥物新靶點的揭示與闡明對創(chuàng)新藥物研究具有巨大的推動作用。中藥在我國有近千年的臨床使用歷史,療效穩(wěn)定、明確,但是中藥的成分復(fù)雜,從而導(dǎo)致了作用靶點的多樣性[14]。因此,關(guān)于中藥活性成分作用靶點的研究一直是中藥研究領(lǐng)域中極具挑戰(zhàn)性的問題。

    合歡皮作為一味常用中藥,臨床上常用于治療失眠、焦慮、腫瘤等癥[15]。近年來,合歡皮中主要成分TSAJ的抗腫瘤作用多有報道,然而由于皂苷類單體成分分離困難,具體抗腫瘤機制研究鮮有深入報道。本研究首先驗證了TSAJ的抗腫瘤作用,然后以TSAJ為探針,富集并尋找了與其特異結(jié)合的靶點蛋白,從源頭上深入闡釋了TSAJ的抗腫瘤作用分子機制,解決了中藥成分復(fù)雜帶來的靶點多、作用機制不明的問題。

    通過對篩選得到的靶點蛋白進行功能解析,發(fā)現(xiàn)TSAJ發(fā)揮抗腫瘤活性的機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞運動及血管生成有關(guān)。其中Exportin-2和Cytochrome c oxidase copper chaperone均與細胞增殖和細胞凋亡相關(guān),參與胞核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運及細胞色素C氧化;此外還有細胞骨架蛋白Beta-actin-like protein 2與Myosin-9,參與腫瘤細胞分化、運動、分泌等活動。然而,TSAJ與靶點蛋白作用機制及TSAJ誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的機制還需要進一步研究。

    綜上所述,本研究利用活性明確的中藥提取物作為探針,通過構(gòu)建了中藥提取物修飾的固相微球,富集并研究中藥提取物的直接作用靶點。這在中藥活性研究中尚不多見,有較高的新穎性,從源頭上解決了中藥因多成分多靶點所導(dǎo)致的分子機制不明的問題,為中藥活性研究提供了新的思路。

    [參考文獻]

    [1] 宋立人.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2001:876.

    [2] 俞琦,蔡琨,田維毅.合歡皮總皂苷對H22荷瘤小鼠細胞免疫功能的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016 (15): 143.

    [3] Cai W, Yue L I, Qing Y I, et al. Total saponins from Albizia julibrissin inhibit vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis in vitro and in vivo[J]. Mol Med Rep, 2015, 11(5): 3405.

    [4] Jung J W, Cho J H, Ahn N Y, et al. Effect of chronic Albizzia julibrissin, treatment on 5-hydroxytryptamine1A receptors in rat brain[J]. Pharmacol Biochem, 2005, 81(1):205.endprint

    [5] 馬錦媚,孫秀義,毛福祥,等.合歡總甙抗早孕作用的機理研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 1995, 30(2):111.

    [6] 蔚冬紅,喬善義,趙毅民.中藥合歡皮研究概況[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(7):619.

    [7] 馮磊,譚瑩,陳爽,等.合歡皮總皂苷對人微血管內(nèi)皮細胞增殖的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 36(8):1667.

    [8] Santos R, Ursu O, Gaulton A, et al. A comprehensive map of molecular drug targets[J]. Nat Rev Drug Discov, 2016, 16(1):19.

    [9] Han Q H, Qian Y, Wang X, et al. Cytotoxic oleanane triterpenoid saponins from Albizia julibrissin[J]. Fitoterapia, 2017, 121: 183.

    [10] Speers A E, Cravatt B F. Activity-based protein profiling (ABPP) and click chemistry (CC)-ABPP by MudPIT mass spectrometry[J]. Curr Protoc Chem Bio, 2009, 1(1):29.

    [11] Vaidyanathan S, Thangavelu P U, Duijf P H. Overexpression of ran GTPase components regulating nuclear export, but not mitotic spindle assembly, marks chromosome instability and poor prognosis in breast cancer[J]. Target Oncol, 2016, 11(5):1.

    [12] Jia H, Ma M, Zhai N, et al. Roles of a mitochondrial AccSCO2 gene from Apis cerana cerana in oxidative stress responses[J]. J Inorg Biochem, 2017, 175:9.

    [13] Carmeliet P, Jain R K. Angiogenesis in cancer and other diseases[J]. Nature, 2000, 407(6801):249.

    [14] 肖斌,王耘.中藥功能靶點的研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2010(12):1190.

    [15] 張萍芳.周奚鐘“益元抑瘤法”在惡性腫瘤中醫(yī)治療中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 20(6):715.

    [責(zé)任編輯 張寧寧]endprint

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