人細(xì)小病毒B19基因組編碼蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

鐘亞迪，賈俊婷，范瑞，馬麗敏，馬玉媛，章金剛

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850

人細(xì)小病毒B19基因組編碼蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

鐘亞迪，賈俊婷，范瑞，馬麗敏，馬玉媛，章金剛

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 野戰(zhàn)輸血研究所，北京 100850

目的：構(gòu)建人細(xì)小病毒B19（B19V）基因組編碼蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行鑒定，為研究B19V蛋白功能提供支持。方法：設(shè)計(jì)并合成B19V基因組編碼蛋白VP1、VP2、NS1、11kDa、X、7.5kDa和VP1獨(dú)特區(qū)域（VP1u）的PCR擴(kuò)增引物，以B19V感染性克隆pB19-M20為模板，PCR擴(kuò)增基因組編碼蛋白的核苷酸序列，將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-HA-Flag，并進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定；將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡分別檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：構(gòu)建了B19V 7種蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，免疫印跡鑒定表明均可表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白。結(jié)論：構(gòu)建了B19V 7種蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，為深入研究B19V蛋白功能及其在致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

人細(xì)小病毒B19；病毒蛋白；真核表達(dá)質(zhì)粒

1975年，人細(xì)小病毒B19（Human parvovirusB19，B19V）首次發(fā)現(xiàn)于英國(guó)南倫敦輸血中心病毒參考實(shí)驗(yàn)室[1]，是無(wú)囊膜結(jié)構(gòu)的單鏈DNA病毒，呈正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑僅20.5～25.0 nm，屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae）、細(xì)小病毒亞科（Parvoviri?nae）、紅病毒屬（Erythrovirus）[2]。

B19V主要經(jīng)呼吸道傳播，也可經(jīng)母嬰垂直傳播，而經(jīng)血液及血液制品傳播具有更重要的臨床意義，一直倍受人們關(guān)注[3]。兒童感染B19V可引起最為常見(jiàn)的傳染性紅斑（也稱為“第五病”）[4]，健康成人感染多表現(xiàn)為輕型自限性疾病。特殊人群感染B19V之后則易出現(xiàn)嚴(yán)重后果：免疫功能缺陷人群感染可以引起慢性貧血；存在血液性疾病的病人感染可以引起暫時(shí)性再障危象等[5]；孕婦感染可能引起胎兒水腫、流產(chǎn)和死胎等[6]。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，B19V感染與肝炎、心肌炎、腦炎、急性橫慣性脊髓炎等[7-10]以及多種自身免疫性疾病也存在相關(guān)性[11]。

B19V基因組長(zhǎng)約5.6 kb，包含2個(gè)大的開(kāi)放讀框（open reading frame，ORF）。左側(cè)的ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，右側(cè)ORF編碼衣殼蛋白VP1和VP2，VP1的N端比VP2多226個(gè)氨基酸殘基，稱為 VP1獨(dú)特區(qū)域（VP1-unique region，VP1u）。B19V還有3個(gè)小的非結(jié)構(gòu)蛋白，即11kDa、X和7.5kDa[2]。了解B19V的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能，對(duì)于深入研究B19V和宿主細(xì)胞的相互作用，以及揭示B19V的致病機(jī)制具有重要意義。

本研究以B19V感染性克隆pB19-M20為模板，構(gòu)建B19V編碼的所有蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了鑒定，將為深入研究B19V蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T（HEK293T）細(xì)胞和真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-HA-Flag均為本實(shí)驗(yàn)室保存；B19V感染性克隆pB19-M20由美國(guó)NIH心肺血液研究所Susan Wong博士惠贈(zèng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；DMEM Basic培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；Phusion-HF DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ（NEB公司）；高純度質(zhì)粒小提試劑盒（Tiangen公司）；膠回收和去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（Qiagen公司）；RIPA裂解液（碧云天公司）；BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛公司）；蛋白酶抑制劑（Amresco公司）；鼠抗HA抗體（Cell Signaling公司）；鼠抗βactin抗體（Proteintech公司）；羊抗鼠熒光抗體（LI-COR公司）。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

從GenBank下載B19V J35毒株的核苷酸序列（登錄號(hào)：AY386330.1），用Primer Premier 5.0軟件，分別根據(jù)B19V基因組編碼蛋白VP1、VP2、NS1、11kDa、X、7.5kDa和VP1u的核苷酸序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物（表1），由北京中美泰和生物技術(shù)公司合成。

1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以B19V的感染性克隆pB19-M20為模板，PCR擴(kuò)增上述B19V所有蛋白的核苷酸序列。擴(kuò)增體系：1 ng感染性克隆pB19-M20為模板，5×Phusion 緩沖液10 μL，dNTPs 200 μmol/L，上、下游引物各0.5 μmol/L，Phusion-HF DNA聚合酶1 U，加無(wú)菌去離子水至50 μL。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性30 s，72℃退火（其中，NS1蛋白的退火溫度為67℃）30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。用膠回收試劑盒回收7種PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ切割pcDNA3.1（+）-HA-Flag載體和回收的PCR產(chǎn)物，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。

1.4 重組質(zhì)粒的鑒定

連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)氨芐西林抗性篩選后，分別挑選12個(gè)單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。挑選陽(yáng)性克隆單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和EcoRⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切，于37℃酶切反應(yīng)15 min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和生物公司行核苷酸序列測(cè)定。

1.5 蛋白表達(dá)的免疫印跡鑒定

用含10%胎牛血清的DMEM Basic培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞。將HEK293T細(xì)胞（6×105/孔）接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照PEI轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染前1 h把細(xì)胞培養(yǎng)液更換為無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液。將6 μg質(zhì)粒與500 μL Opti-MEM培養(yǎng)液混合并振蕩均勻，再將 18 μL PEI與 500 μL Opti-MEM培養(yǎng)液混合并振蕩均勻，室溫放置20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中。37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞，1 h后加入含10%胎牛血清的DMEM Ba?sic培養(yǎng)液2 mL。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液（含1×蛋白酶抑制劑）裂解細(xì)胞，14 000×g低溫離心5 min收集細(xì)胞總蛋白；用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量，加入5×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸10 min，稍離心，取80 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE；蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉1 h，加入1∶1000稀釋的鼠源HA標(biāo)簽抗體，4℃輕搖過(guò)夜；TBST洗膜3次，5 min/次，加入1∶10 000稀釋的羊抗鼠熒光抗體，室溫輕搖孵育2 h；TBST洗膜3次，5 min/次，用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)顯影。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以B19V感染性克隆pB19-M20為模板，PCR擴(kuò)增B19V所有蛋白的編碼區(qū)序列，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。擴(kuò)增VP1、VP2、VP1u和NS1編碼序列的電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期（依次為 2366、1685、701和 2035 bp），擴(kuò)增 11kDa、X和7.5kDa編碼序列的電泳結(jié)果顯示產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期（依次為304、265和244 bp）（圖1）。將各擴(kuò)增產(chǎn)物分別插入pcDNA3.1（+）-HA-Flag載體，獲得B19V所有蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別為pcDNA3.1（+）-HA-Flag-VP1、pcDNA3.1（+）-HAFlag-VP2、pcDNA3.1（+）-HA-Flag-VP1u、pcD?NA3.1（+）-HA-Flag-NS1、pcDNA3.1（+）-HAFlag-11kDa、pcDNA3.1（+）-HA-Flag-X 和 pcD?NA3.1（+）-HA-Flag-7.5kDa。

表1 B19V基因組編碼蛋白的編碼區(qū)序列擴(kuò)增引物

圖1 PCR擴(kuò)增B19V所有蛋白編碼序列的電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

將B19V各蛋白編碼區(qū)序列與pcDNA3.1（+）-HA-Flag載體的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)氨芐西林抗性篩選后，通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和EcoRⅠ分別進(jìn)行單、雙酶切鑒定，結(jié)果顯示構(gòu)建的B19V 7種蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒均能獲得預(yù)期的酶切結(jié)果（圖2）。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送中美泰和公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果表明構(gòu)建的B19V 7種蛋白真核表達(dá)重組質(zhì)粒的序列正確（序列略）。

圖2 用NotⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行單、雙酶切鑒定的電泳圖

2.3 蛋白表達(dá)的免疫印跡鑒定

將B19V基因組編碼蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示能檢測(cè)到各目的蛋白的特異性條帶，蛋白大小與預(yù)期相符（圖3）。表明構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒能夠在HEK293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白的免疫印跡

3 討論

B19V是可經(jīng)血液與血液制品傳播并導(dǎo)致人類疾病的病原體，長(zhǎng)期以來(lái)在輸血領(lǐng)域受到關(guān)注。隨著研究的深入，B19V表現(xiàn)出廣譜致病性和持續(xù)性感染的特征，可造成機(jī)體多個(gè)器官/系統(tǒng)受累，與多種血液病、炎癥性疾病甚至多種自身免疫性疾病相關(guān)，但B19V的致病機(jī)制仍不明確。加強(qiáng)對(duì)病毒蛋白的生物學(xué)功能研究，將有助于探討B(tài)19V致病機(jī)制和免疫逃逸機(jī)制。

B19V結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，僅編碼6種蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2組成病毒衣殼，其中VP2占95%，是主要蛋白，對(duì)于B19病毒樣顆粒（VLPs）的形成是必需的[12]；VP1只占5%，為次要蛋白，單獨(dú)VP1蛋白不能組裝成VLPs。VP1u區(qū)暴露于病毒衣殼的外部，其線性表位能夠被中和抗體所識(shí)別[13]。VP1u區(qū)具有磷脂酶A2（PLA2）基序，為病毒感染性所必需[14]。NS1是B19V最主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，具有核酸酶和解旋酶活性以及反式激活作用，在病毒復(fù)制過(guò)程中起關(guān)鍵作用[13]。另外，NS1蛋白還具有細(xì)胞毒性效應(yīng)，可通過(guò)TNF-α激活的死亡受體途徑（外源途徑）誘導(dǎo)紅系祖細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是B19V感染引發(fā)貧血、再生障礙危象、非免疫性胎兒水腫等多種臨床癥狀的誘因[15]。2010年，Chen等發(fā)現(xiàn)，在CD36+紅系祖細(xì)胞中，B19V的另一小非結(jié)構(gòu)蛋白11kDa起到了比NS1蛋白更主要的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[16]。但是，目前對(duì)于11kDa蛋白及另外2種小非結(jié)構(gòu)蛋白（X和7.5kDa蛋白）在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及其生活周期中的具體作用仍不明確。

綜上所述，目前對(duì)B19V蛋白尤其是3種主要蛋白（VP1、VP2和NS1）的功能研究已取得一定進(jìn)展，但3種小的非結(jié)構(gòu)蛋白的功能還未完全闡明，有關(guān)B19V與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理等仍有待進(jìn)一步探索。本研究構(gòu)建了B19V所有編碼蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)免疫印跡鑒定各蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中均能實(shí)現(xiàn)表達(dá)，為深入開(kāi)展B19V各蛋白功能及其在致病機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Cossart Y E,Field A M,Cant B,et al.Parvoviruslike particles in human sera[J].Lancet,1975,305(7898):72-73.

[2]King A M Q,Adams M J,Carstens E B,et al.Virus taxonomy,ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M].London:Elsevier Academ?ic Press,2011:412.

[3]馬玉媛,賈俊婷,章金剛.血液及血液制品中人細(xì)小病毒B19的檢測(cè)及其意義[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2016,18(3):201-203.

[4]Servey J T,Reamy B V,Hodge J.Clinical presenta?tions of parvovirus B19 infection[J].Am Fam Physi?cian,2007,75(3):373-376.

[5]Young N S,Brown K E.Parvovirus B19[J].N Engl J Med,2004,350(6):586-597.

[6]Zhou Y,Bian G,Zhou Q,et al.Detection of cytomeg?alovirus,human parvovirus B19,and herpes simplex virus-1/2 in women with first-trimesterspontaneous abortions[J].J Med Virol,2015,87(10):1749-1753.

[7]Bihari C,Rastogi A,Rangegowda D,et al.Parvovirus B19 associated acute hepatitis and hepatosplenomegaly[J].Clin Res Hepatol Gastroenterol,2014,38(1):e9-10.

[8]Pankuweit S,Klingel K.Viral myocarditis:from experi?mental models to molecular diagnosis in patients[J].Heart Fail Rev,2013,18(6):683-702.

[9]Watanabe T,Kawashima H.Acute encephalitis and en?cephalopathy associated with human parvovirus B19 in?fection in children[J].World J Clin Pediatr,2015,4(4):126-134.

[10]Suzuki M,Yoto Y,Ishikawa A,et al.Acute trans?verse myelitis associated with human parvovirus B19 infection[J].J Child Neurol,2014,29(2):280-282.

[11]Kerr J R.The role of parvovirus B19 in the pathogen?esis of autoimmunity and autoimmune disease[J].J Clin Pathol,2016,69(4):279-291.

[12]Kajigaya S,Fujii H,Field A,et al.Self-assembled B19 parvovirus capsids,produced in a baculovirus sys?tem,are antigenically and immunogenically similar to native virions[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(11):4646-4650.

[13]Ozawa K,Young N.Characterization of capsid and noncapsid proteins of B19 parvovirus propagated in hu?man erythroid bone marrow cell cultures[J].J Virol,1987,61(8):2627-2630.

[14]Leisi R,Ruprecht N,Kempf C,et al.Parvovirus B19 uptake is a highly selective process controlled by VP1u,a novel determinant of viral tropism[J].J Virol,2013,87(24):13161-13167.

[15]Morita E,Nakashima A,Asao H,et al.Human parvo?virus B19 nonstructural protein(NS1)induces cell cy?cle arrest at G1 phase[J].J Virol,2003,77(5):2915-2921.

[16]Chen A Y,Zhang E Y,Guan W,et al.The small 11kDa nonstructural protein of human parvovirus B19 plays a key role in inducing apoptosis during B19 vi?rus infection of primary erythroid progenitor cells[J].Blood,2010,115(5):1070-1080.

Construction and Identification of Eukaryotic Expression Plasmids ofHuman parvovirusB19 Genome-Encoded Pro?teins

ZHONG Ya-Di,JIA Jun-Ting,FAN Rui,MA Li-Min,MA Yu-Yuan*,ZHANG Jin-Gang*
Institute of Transfusion Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China

Objective:To construct and identify eukaryotic expression plasmid ofHuman parvovirusB19（B19V）genome-encoded proteins to support the functional research of the proteins.Methods:First of all,the coding se?quences of B19V proteins were amplified from B19V infectious clone pB19-M20 by PCR method using specific primers.Secondly,the amplicons were cloned into the pcDNA3.1（+）-HA-Flag vector respectively,and then the positive clones were confirmed by restriction digestion and sequencing.Finally,the constructed recombinant plas?mids containing the target genes were transfected into HEK293T cells,followed by Western blot analysis for target proteins expression.Results:Recombinant eukaryotic expression plasmids of B19V genome-encoded proteins were constructed and their expression was confirmed in HEK293T cells.Conclusion:Our study has laid a foundation for further exploring the function of B19V proteins and their roles in the pathogenesis of B19V associated diseas?es.

Human parvovirusB19;virus proteins;eukaryotic expression plasmids

Q78

A

1009-0002（2017）05-0618-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,MA Yu-Yuan,E-mail:mayuyuan07@hotmail.com;ZHANG Jin-Gang,E-mail:zhangjg@bmi.ac.cn

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（81570169）；北京市自然科學(xué)基金（7162147）

鐘亞迪（1992- ），男，碩士研究生，（E-mail）zhongyadi101@sina.com；賈俊婷（1987- ），女，博士；二者為共同第一作者

馬玉媛，（E-mail）mayuyuan07@hotmail.com；章金剛，（E-mail）zhangjg@bmi.ac.cn