人ERK2基因對人視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1細胞生長的影響

韓笑，劉瑩，梁迎春，閆志風，徐小潔，梁九思，洪甜，尤文葉，陳思禹，黃俊，葉棋濃，劉丹

1.錦州醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；3.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

人ERK2基因對人視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1細胞生長的影響

韓笑1,3，劉瑩1，2，梁迎春3，閆志風2，徐小潔3，梁九思1，洪甜3，尤文葉2，陳思禹2，黃俊3，葉棋濃3，劉丹1

1.錦州醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；3.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

目的：構建攜帶Myc標簽的人細胞外信號調節(jié)激酶2（ERK2）的真核表達載體，表達Myc-ERK2融合蛋白，檢測其對人視網膜母細胞瘤細胞生長的影響。方法：采用PCR技術從乳腺文庫中擴增人ERK2基因序列，將其插入pXJ-40載體；將重組質粒與空載體轉染人視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1細胞系后，Western印跡檢測表達情況，并進行生長曲線實驗。結果：雙酶切和測序鑒定表明Myc-ERK2真核表達質粒構建成功；轉染WERI-Rb-1細胞后融合蛋白獲得表達，生長曲線實驗結果表明ERK2可促進腫瘤細胞的生長。結論：攜帶Myc標簽的人ERK2基因的真核表達載體能在人視網膜母細胞瘤WERI-Rb-1細胞中表達，且能促進該細胞的生長。本實驗為進一步研究ERK2在腫瘤尤其是眼惡性腫瘤中的功能奠定了基礎。

細胞外信號調節(jié)激酶2（ERK2）；真核表達；人視網膜母細胞瘤細胞

細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）成員之一[1-2]，其N端與C端相互卷曲形成一種典型的雙葉結構的多肽鏈[3]。ERK家族有5個亞族，即ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和 ERK5。對 ERK1和ERK2調節(jié)不同細胞內的減數(shù)分裂和有絲分裂等一系列生理活動的研究比較明確[4]。研究表明，血小板衍生生長因子（platelet derived growth fac?tor，PDGF）能通過ERK1/2信號通路影響視網膜色素上皮細胞的增殖和遷移[5]。ERK2還參與信號通路的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可通過磷酸化底物蛋白調節(jié)細胞的生理功能，調控細胞周期、增殖、轉錄、分化、凋亡、遷移和黏附等功能，在惡性腫瘤的發(fā)生、轉移和浸潤等方面起重要作用[4,6]。因此，我們擬構建ERK2的真核表達載體，以便進一步研究ERK2與視網膜母細胞瘤的調控。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、人乳腺文庫、真核表達載體pXJ-40為本實驗室保存；VigoFect轉染試劑、Western印跡發(fā)光檢測試劑盒購自Vigorous公司；限制性內切酶、T4DNA連接酶、PCR相關試劑購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒、PCR產物回收試劑盒、膠回收試劑盒購自Promega公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM購自Gibco公司；胰酶購自Amersco公司；引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成；測序由北京奧科鼎盛生物技術有限責任公司完成。

1.2 ERK2基因的擴增

以人乳腺文庫為模板，根據(jù)NCBI中的ERK2序列合成上游引物（5'-CCCAAGCTTATGGCGGC GGCGGCGGCGGC-3'）和下游引物（5'-CCGCTCG AGTTAAGATCTGTATCCTGGCTGGAATC-3'），PCR擴增ERK2序列（擴增條件：預變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸72℃ 50 s，30個循環(huán)；再延伸72℃ 7 min）。使用高保真PfuDNA聚合酶，擴增產物于4℃保存，用膠回收試劑盒回收。

1.3 重組表達質粒的構建與鑒定

用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切pXJ-40載體，37℃，4 h，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，暴露出酶切位點的粘性末端，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質粒，用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆送北京奧科鼎盛生物技術有限責任公司測序。

1.4 細胞轉染和Western印跡檢測

按常規(guī)實驗方法轉染。用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HEK293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達80%為宜，培養(yǎng)24 h后進行轉染，轉染前1 h換液。將4 μL VigoFeet與 200 μL NaCl混合，室溫靜置 5 min，再將總量為10 μg的重組質粒Myc-ERK2與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空載體作為對照，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h更換為正常DMEM培養(yǎng)液，24 h后收集細胞，加入RIPA裂解液冰浴30 min，加入等量的2×SDS緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液進行SDS-PAGE后，電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜，隨后用5%脫脂奶粉以1∶1000稀釋HRP標記的抗Myc標簽鼠單克隆抗體進行孵育，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 生長曲線實驗

將Myc-ERK2和空載體轉染WERI-Rb-1細胞，48 h后取處于對數(shù)生長期的細胞，計數(shù)后稀釋至2×104/L，分別接種于5個96孔板，各設3個重復孔，常規(guī)培養(yǎng)。每日取一塊96孔板，在接種孔內用排槍加入10 μL CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，在波長450 nm處測定樣品D值。

2 結果

2.1 人ERK2基因的克隆

以人乳腺文庫為模板擴增ERK2基因，獲得約1080 bp的PCR產物，與預期一致（圖1）。

圖1 ERK2基因的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Myc-ERK2重組質粒的構建與鑒定

將PCR產物雙酶切后與pXJ-40載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選陽性克隆提質粒進行雙酶切鑒定，凝膠電泳可見約1080 bp的條帶（圖2），表明ERK2序列已成功插入Myc標簽中。測序結果顯示與已知序列完全一致，從而證明重組質粒Myc-ERK2構建成功。

圖2 Myc-ERK2重組質粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 Western印跡檢測融合蛋白的表達

將構建的重組質粒Myc-ERK2和空載分別轉染HEK293T細胞，4～6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)液，24 h后提取細胞蛋白，進行SDS-PAGE，

圖3 Western印跡檢測融合蛋白Myc-ERK2的表達

2.4 生長曲線檢測ERK2表達對WERI-Rb-1細胞生長的影響

圖4 ERK2能促進WERI-Rb-1細胞的生長

為了探討WERI-Rb-1細胞中ERK2活性對其增殖是正調控還是負調控，用CCK8試劑盒檢測ERK2對WERI-Rb-1細胞生長的影響。結果證明ERK2能促進WERI-Rb-1細胞的生長（圖4）。Western印跡檢測Myc-ERK2蛋白的表達。結果顯示，轉染重組質粒Myc-ERK2后，在相對分子質量約43 000處可見明顯的特異性條帶，而轉染空載體后則無條帶，表明重組蛋白Myc-ERK2能在HEK293T細胞中正確表達（圖3）。

3 討論

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是一種起源于視網膜胚胎性的眼內惡性腫瘤，多發(fā)于嬰幼兒，發(fā)病率為1∶15 000，近年來仍有逐漸上升趨勢。血-視網膜屏障（blood-retina barrier，BRB）由內層BRB（inner BRB，IBRB）及外層BRB（outer BRB，OBRB）組成，在維持視網膜內環(huán)境穩(wěn)定方面起非常重要的作用[7-9]。ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶[10]，ERK通路在MAPK通路中起重要作用。MAPK通路由Ras/Raf/MEK/ERK通路組成，其信號的傳導遵循MAKP的三級聯(lián)體系，即MAPK、MAPK激酶（MAPK kinase，MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKK kinase，MAPKKK），激活順序依次為：MAPKKK激活MAPKK，MAPKK激活MAPK，活化后的MAPK進入細胞核，導致細胞核內轉錄的激活[11-12]。研究表明，阻斷小鼠體內ERK信號傳導通路，可以減少缺氧條件下OBRB的被破壞[13]。視網膜缺血和再灌注廣泛參與眼部疾病，引起視網膜神經節(jié)細胞（retinal ganglion cell，RGC）死亡，導致視覺障礙和失明[14]。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK蛋白抑制ERK活性上調對缺血性腦損傷和損傷RGC有明顯的保護作用[15]。同時，ERK通路的異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關。研究表明ERK2的活化可改變細胞病理性增殖，雌激素可通過對ERK2通路的影響來抑制動脈平滑肌細胞的增殖[16]。在腎臟中，ERK2通路參與急性腎衰竭的炎癥反應可導致腎小管上皮細胞凋亡增加和炎性標記物增加[17]。在乳腺癌中，ERK2的過表達促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[18]。在肝癌中，ERK2的活化和過表達可增強肝癌細胞的遷移能力[19]。因此，研究ERK2有助于明確腫瘤細胞的增殖和凋亡機制及對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，進而指導腫瘤的治療和新藥的研制。

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Effect of HumanERK2Gene on Growth of Human Retino?blastoma WERI-Rb-1 Cells

HAN Xiao1,3,LIU Ying1,2,LIANG Ying-Chun3,YAN Zhi-Feng2,XU Xiao-Jie3,LIANG Jiu-Si1,HONG Tian3,YOU Wen-Ye2,CHEN Si-Yu2,HUANG Jun3,YE Qi-Nong2*,LIU Dan1*
1.The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;2.Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of human extracellular signal regulated ki?nase 2（ERK2） labeled with Myc and detect its expression and activity in human retinoblastoma cells.Methods:Human ERK2 coding region was amplified from human mammary cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.The recombinant plasmid Myc-ERK2 was transfected into human WERI-Rb-1 cells and the expression was detected by Western blot.The proliferation of WERI-Rb-1 cells was examined by growth curve experiment.Results:Myc-ERK2 eukaryotic expression vector was constructed and verified by double enzyme digestion and nu?cleic acid sequencing.Human ERK2 protein was expressed in human WERI-Rb-1 cells as was shown by West?ern blot results and ERK2 protein promoted the proliferation of WERI-Rb-1 cells.Conclusion:The Myc-ERK2 was identified to promote WERI-Rb-1 cell proliferation,which is a fundamental study for ERK2's role in retinob?laastoma.

human extracellular signal regulated kinase 2（ERK2）;eukaryotic expression;human retinoblastoma cells

Q78

A

1009-0002（2017）05-0610-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Dan,E-mail:docliu61@163.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

2017-04-27

國家自然科學基金（81672602，81472589，81502264）；北京市科技新星計劃（Z141102001814055）；軍事醫(yī)學科學院創(chuàng)新基金轉化醫(yī)學項目（ZHYX003）

韓笑（1989- ），女，碩士研究生，（E-mail）hanxiao9910@sina.com；劉瑩（1981- ），女，博士研究生，（E-mail）liuying5322@163.com；梁迎春（1979- ），女，博士研究生，（E-mail）lyc.513@163.com；三者為共同第一作者

劉丹，（E-mail）docliu61@163.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com