黃華春+曾緒東+孫長(zhǎng)勇
【摘要】 目的 比較3種方法提取牙齒DNA的效果。方法 20具尸體的20顆磨牙, 將每顆牙磨成粉共60份, 分成A組、B組及C組, 每組20份。分別用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA進(jìn)行提取, 比較3種方法提取牙齒DNA濃度水平、陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照(IPC)熒光域值循環(huán)數(shù)(CT值)和短片段重復(fù)序列(STR)分型結(jié)果。結(jié)果 用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA濃度水平分別為(5.24±2.81)、(5.66±2.33)、(8.23±3.54)ng/μl, AutoMate Express純化法高于其他兩種方法, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);上述3種方法提取牙齒DNA的IPC CT值分別為(27.16±0.28)、(26.96±0.36)、(27.12±0.22), 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法3種方法STR基因座檢出分型成功率分別為95%、95%和100%。結(jié)論 AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA的提取效果優(yōu)于M48純化法、QIAcube純化法。
【關(guān)鍵詞】 牙齒;M48純化法;QIAcube純化法;AutoMate Express純化法
DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.27.046
牙齒是DNA檢驗(yàn)中的常見檢材, 但牙齒的DNA提取是DNA檢驗(yàn)的一大難點(diǎn)。牙齒DNA提取的研究已有不少文獻(xiàn)報(bào)道[1-3]。本文通過(guò)比較M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA的效果, 以供同行參考。
1 材料與方法
1. 1 材料 牙齒樣本來(lái)自實(shí)驗(yàn)室2015年4月~2016年11月
受理的檢材。每具尸體1顆磨牙, 共20顆磨牙, 用刀片刮凈牙齒表面, 浸泡在5%次氯酸鈉溶液中5 min, 再用蒸餾水泡洗3次, 紫外燈照射6 h[4]。將每顆牙磨成粉, 稱取200 mg為1份, 共3份, 分為A、B、C三組, 置于3個(gè)1.5 ml離心管, 60份牙粉分別標(biāo)記為A1、A2……A20;B1、B2……B20;C1、C2……C20。同時(shí)提取尸體的肋軟骨作為對(duì)照物。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA提取
1. 2. 1. 1 M48純化法 A組牙粉加入MagAttract DNA Mini M48 Kit試劑盒G2 250 μl、蛋白酶(P)K(20 mg/ml)20 μl及二硫蘇糖醇(DTT)(1 mol/L)20 μl, 56℃裂解6 h, 離心后加入MTL 750 μl及30 μl硅珠, 吸附15 min后棄液體, 80%乙醇洗滌3次, 置65℃烘干, 洗脫體積50 μl。
1. 2. 1. 2 QIAcube純化法 B組牙粉加入QIAamp DNA Investigator試劑盒ATL 300 μl、PK(20 mg/m1)20 μl及DTT (1 mol/L) 20 μl, 56℃裂解6 h后置QIAcube核酸純化儀提取DNA, 洗脫體積50 μl。
1. 2. 1. 3 AutoMate Express純化法 C組牙粉加入PrepFiler Express BTA DNA試劑盒的裂解液300 μl、PK(20 mg/ml)
20 μl及DTT (1 mol/L) 20 μl, 56℃裂解6 h后置AutoMate Express DNA提取系統(tǒng)提取DNA, 洗脫體積50 μl。
1. 2. 2 DNA定量 采用Quantifiler Human DNA Quantification試劑盒, 用ABI 7500定量PCR儀對(duì)提取的樣本DNA濃度進(jìn)行定量, 按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。
1. 2. 3 PCR擴(kuò)增與檢測(cè) 采用Identifiler plus試劑盒進(jìn)行復(fù)核擴(kuò)增, 反應(yīng)體系10 μl, 模板DNA 1 μl, 循環(huán)29次, 擴(kuò)增產(chǎn)物用3130XL遺傳分析儀檢測(cè), GeneMapper ID 3.2分析, 相對(duì)熒光單位(RFU)的閾值為50, 以獲得性別及12個(gè)以上STR基因座明確分型判為成功分型[5]。
1. 3 觀察指標(biāo) 觀察3種方法提取DNA濃度水平、IPC CT值及STR基因座檢出分型成功情況。
1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 多組間比較采用ANOVA方差分析, 兩兩比較采用LSD法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 3種方法提取牙齒的DNA濃度水平和IPC CT值比較 采用AutoMate Express純化法提取的牙齒DNA濃度水平高于M48純化法、QIAcube純化法, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);QIAcube純化法與M48純化法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。采用上述3種方法提取牙齒的IPC CT值均在
27左右, QIAcube純化法的IPC CT值最低, 但3種方法比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P>0.05)。見表1。
2. 2 3種方法STR基因座檢出分型成功率 3種方法提取牙齒DNA擴(kuò)增后檢測(cè), 與肋軟骨檢出的DNA分型進(jìn)行比較, AutoMate Express純化法提取牙齒的分型成功率為100%, M48純化法和QIAcube純化法均為95%。見表2。
3 討論
目前, 牙齒DNA的提取方法有很多, M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法是常用的牙齒DNA提取方法, 3種方法提取DNA的原理有所不同。M48純化法是一種硅珠法, 在高鹽濃度下DNA特異性吸附到二氧化硅上。QIAcube純化法是一種硅膜法, 離心柱上硅膠膜能特異性結(jié)合DNA。AutoMate Express純化法是一種磁珠法, 在高濃度鹽的條件下, 磁珠能特異性吸附DNA。endprint
本文通過(guò)對(duì)牙齒樣本用M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法提取牙齒DNA, 結(jié)果表明, AutoMate Express純化法獲得的DNA濃度水平最高, 顯著高于另外2種方法。本研究檢出的牙齒DNA濃度水平比其他的研究者[1-3]
檢出的都明顯增高, 究其原因應(yīng)該是所檢牙齒都是在死后
2個(gè)月內(nèi)尸體上提取的, 牙齒較為新鮮, 牙齒質(zhì)量好。3種方法提取的牙齒DNA相同條件擴(kuò)增和檢測(cè)后顯示, AutoMate Express純化法的STR分型成功率達(dá)到了100%, 高于M48純化法、QIAcube純化法。從牙齒DNA濃度水平和STR分型成功率比較, AutoMate Express純化法對(duì)牙齒DNA的提取效果優(yōu)于M48純化法、QIAcube純化法, 原因可能是PrepFiler Express BTA DNA試劑盒的磁珠是一種納米級(jí)磁珠, 平均粒徑小, 分散性好, 不容易聚團(tuán)和貼壁, 單位體積中的磁珠具有更大的用于吸附DNA的表面積, 吸附DNA能力更強(qiáng)[6]。
Quantifiler Human DNA Quantification試劑盒中, IPC與模板DNA同步擴(kuò)增, 熒光定量PCR技術(shù)能判斷模板中是否存在影響PCR的抑制物, IPC CT值的高低能夠反映抑制物量的多少[7-10]。本研究結(jié)果顯示, 3種方法提取牙齒DNA模板的抑制物均較少, IPC CT值均在27左右, 其中QIAcube純化法的IPC CT值最低, 但3種方法間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。QIAcube純化法在清除抑制物的能力稍優(yōu)于另外
2種方法, 分析其原因可能是與硅膠模有關(guān), 硅膠模的孔徑能有效的濾去大顆粒雜質(zhì)、小片段DNA和其他抑制成分。
綜上所述, M48純化法、QIAcube純化法和AutoMate Express純化法中的AutoMate Express純化法提取牙齒DNA效果最好, 提取牙齒DNA能免脫鈣, 裂解時(shí)間短, 又能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化提取, 在實(shí)際檢案中可以作為優(yōu)選方案。
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[收稿日期:2017-04-20]endprint