三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究與展望

郝永紅+王梓如+侯毅鞠

摘 要：?jiǎn)螌蛹?xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞是在改變的體外環(huán)境下增值生長(zhǎng)，因此會(huì)喪失原有組織的性狀，不利于科學(xué)研究。而體外三維培養(yǎng)技術(shù)是將細(xì)胞、細(xì)胞基質(zhì)放到體外去培養(yǎng)，并且營(yíng)造與體內(nèi)相似的內(nèi)環(huán)境，使細(xì)胞能夠表達(dá)合理的基因及性狀，有觀(guān)察直觀(guān)和條件可控的優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在諸多生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，以及對(duì)此技術(shù)的未來(lái)發(fā)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；腫瘤治療；腫瘤血管形成；器官再造

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2017）17-0203-02

單層細(xì)胞培養(yǎng)于1885年以來(lái)首次從雞胚中分離出細(xì)胞建立體外培養(yǎng)[1]，距今有百年歷史，在此期間單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶了新的希望，但隨著科技的進(jìn)步，人類(lèi)對(duì)于健康不斷提出更高的要求，雖然人類(lèi)越來(lái)越多的疾病可以被治愈，同時(shí)也存在許多有待解決難題，比如器官移植存在的排斥反應(yīng)、移植器官來(lái)源少等問(wèn)題，在未來(lái)能很好解決這一問(wèn)題的技術(shù)即三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。這一技術(shù)的出現(xiàn)，給醫(yī)學(xué)界帶來(lái)了更大的進(jìn)步和希望。

1 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（three-dimensional cell culture， TDCC）是指將具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類(lèi)的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，利用各種方法及材料，使細(xì)胞在載體的三維立體空間結(jié)構(gòu)中遷移、生長(zhǎng)，構(gòu)成三維的細(xì)胞-載體復(fù)合物。更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)模式，形成類(lèi)似體內(nèi)組織的結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能。[2，3]三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在抗癌藥物的篩選、組織形成、血管發(fā)育等發(fā)育生物學(xué)的分支領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

2 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的分類(lèi)

2.1 基于scaffold的培養(yǎng)體系和無(wú)scaffold的培養(yǎng)體系

Scaffold則又有天然成分和人工合成成分之分?；趕caffold的培養(yǎng)體系是沒(méi)有供細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和擴(kuò)散的支撐結(jié)構(gòu)，使培養(yǎng)基中的細(xì)胞聚集成為類(lèi)似于組織的微組織球體（micro tissue spheroids）。無(wú)scaffold的培養(yǎng)體系可通過(guò)懸滴（hanging drops）讓細(xì)胞在重力的作用下通過(guò)自組裝形成微球體。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以通過(guò)控制懸滴而精準(zhǔn)的控制微組織球，使其具有高一致性，為后續(xù)研究提供好的微組織材料。而且通過(guò)懸滴法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型的共培養(yǎng)，保證共培養(yǎng)細(xì)胞間的信息交流。無(wú)scaffold的培養(yǎng)體系天然ECM作為支持材料的3D培養(yǎng)，這種方法以天然ECM作為支持材料，根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型，優(yōu)化3D培養(yǎng)基質(zhì)配方，以滿(mǎn)足不同組織細(xì)胞的培養(yǎng)需求。但天然基質(zhì)材料存在一定病原風(fēng)險(xiǎn)，且材料可能存在批次差別性等缺點(diǎn)。而人造基質(zhì)作為支持材料的3D培養(yǎng)方法，合成的人造基質(zhì)材料類(lèi)型相當(dāng)多，可使體外細(xì)胞培養(yǎng)更接近體內(nèi)的生理特征，是基礎(chǔ)研究、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想選擇。

2.2 靜止性三維細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)

靜止性三維細(xì)胞培養(yǎng)是把細(xì)胞直接種植在三維載體上，體外不施加任何物理方法下進(jìn)行的培養(yǎng)。采用靜止細(xì)胞培養(yǎng)方法不利于細(xì)胞向載體內(nèi)部生長(zhǎng)，培養(yǎng)液很難擴(kuò)散滲透到載體的中心，氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散和代謝物排出受限，從而影響載體內(nèi)部細(xì)胞的代謝活性。因此，需要改善培養(yǎng)條件或細(xì)胞種植方法來(lái)解決細(xì)胞活性降低、數(shù)量不足和分布不均勻的問(wèn)題。動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)就是根據(jù)細(xì)胞在自然條件下生長(zhǎng)受力情況，在培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)應(yīng)用物理方法。動(dòng)力性三維細(xì)胞培養(yǎng)不僅為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了適宜的生物性微環(huán)境和力學(xué)刺激，而且能更好地促進(jìn)細(xì)胞功能的發(fā)揮。由上可見(jiàn)，當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的完善，越來(lái)越趨向于模擬體內(nèi)正常的環(huán)境。

3 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與腫瘤醫(yī)學(xué)

3.1.1 抗腫瘤治療

腫瘤是人類(lèi)的一大頑疾，伴隨醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，抗腫瘤藥物層出不窮，不斷更新，化療仍是治療腫瘤的重要手段，在抗癌藥物的研發(fā)過(guò)程中藥物篩選極其重要。而三維細(xì)胞可以高度模仿腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以提供腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)相似的酸堿度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生長(zhǎng)因子等內(nèi)環(huán)境，還可以充分展示細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，有利于抗癌藥物藥效的測(cè)定。Ong等[4]在觀(guān)察三維多細(xì)胞腫塊球形體藥透時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白可能是藥物滲透的屏障，該現(xiàn)象在體內(nèi)也常被發(fā)現(xiàn)，是腫瘤耐藥的較常見(jiàn)原因之一。Hkanson等[5]研究三維模型中環(huán)境參數(shù)對(duì)抗腫瘤藥物的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間連接、維度（dimensionality）、基質(zhì)組成的微環(huán)境均影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)抗腫瘤藥紫杉醇的反應(yīng)，尤其在纖維蛋白為基質(zhì)培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞，藥物敏感明顯降低，與體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白表達(dá)上調(diào)會(huì)增強(qiáng)乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相一致。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在抗腫瘤治療領(lǐng)域，較好的彌補(bǔ)了單純二維培養(yǎng)的不足，成為抗腫瘤治療的關(guān)鍵。

3.1.2 腫瘤耐藥機(jī)制研究

腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥，是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的常見(jiàn)因素。已有研究表明，乳腺癌干細(xì)胞會(huì)對(duì)乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生較大影響。通過(guò)模擬腫瘤微環(huán)境，可更好地對(duì)乳腺癌干細(xì)胞增殖與分化情況進(jìn)行分析。陳峻崧等[6]將普通二維養(yǎng)與卵巢癌腫瘤干細(xì)胞維比，探討符合體內(nèi)環(huán)境的三維培養(yǎng)條件，研究腫瘤生長(zhǎng)、耐藥等影響因素及機(jī)制。結(jié)果表明，與二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)卵巢癌HO8910細(xì)胞系中CD44+CD117+CSCs表現(xiàn)出明顯的耐藥性，表明BME基質(zhì)膠三維培養(yǎng)模型可作為靶向治療腫瘤與細(xì)胞藥物篩選的理想體外模型。

3.1.3 腫瘤血管形成

腫瘤的生長(zhǎng)利于血管新生，利用腫瘤血管生成的研究可以觀(guān)察腫瘤組織內(nèi)微血管的形態(tài)與功能，闡明腫瘤誘發(fā)血管新生的機(jī)制及血管生成與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。已經(jīng)研究證實(shí)血管組織再生需要細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、信號(hào)系統(tǒng)共同參與完成。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可使細(xì)胞立體生長(zhǎng)，在接近體內(nèi)微環(huán)境中，更好的模擬了體內(nèi)細(xì)胞三維的生長(zhǎng)環(huán)境，并在生長(zhǎng)因子的作用下內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、分化，最后出芽形成新的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[7]三維腫瘤模型更好地體現(xiàn)了體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)特性，并可通過(guò)特定的成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其可透見(jiàn)性，動(dòng)態(tài)追蹤細(xì)胞的生長(zhǎng)乃至發(fā)展形成腫瘤的整個(gè)過(guò)程，因而可對(duì)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程進(jìn)行長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀(guān)察。

3.2 三維細(xì)胞培養(yǎng)與骨及軟骨的創(chuàng)造

不同來(lái)源的骨細(xì)胞與不同材料的三維立體結(jié)構(gòu)載體在體外共同培養(yǎng)，構(gòu)成骨細(xì)胞載體復(fù)合物的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。[8]以此三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)再生出軟骨、骨、半月板等骨組織。該系統(tǒng)常在細(xì)胞外基質(zhì)領(lǐng)域運(yùn)用干細(xì)胞研究干細(xì)胞發(fā)育潛力；在聚合物生長(zhǎng)支架領(lǐng)域運(yùn)用軟骨細(xì)胞研究細(xì)胞分化；在復(fù)合組織培育領(lǐng)域運(yùn)用軟骨細(xì)胞和上皮細(xì)胞研究組織間相互作用；在模擬生物支架領(lǐng)域運(yùn)用成骨細(xì)胞研究生物材料研究；在氧氣供應(yīng)領(lǐng)域利用成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞研究骨血管化。[9]這一發(fā)現(xiàn)為各個(gè)領(lǐng)域在體外培養(yǎng)骨及軟骨提供依據(jù)。

3.3 三維細(xì)胞培養(yǎng)與肝臟修復(fù)

在一定的培養(yǎng)條件下，肝細(xì)胞在基質(zhì)孔隙中重組形成許多有功能的聚集體，這些聚集體中可能具有接近的細(xì)胞-細(xì)胞接觸[10]，為肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供類(lèi)似于體內(nèi)環(huán)境的結(jié)構(gòu)，可以表現(xiàn)出比單層貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞更好的生理功能。Schmelzer利用具有獨(dú)立中空纖維膜系統(tǒng)三維多室生物反應(yīng)器，培養(yǎng)人原代肝實(shí)質(zhì)和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞[11]該系統(tǒng)擁有的培養(yǎng)液循環(huán)系統(tǒng)可以增加細(xì)胞團(tuán)中心細(xì)胞攝入營(yíng)養(yǎng)和氧氣，幫助其排除代謝廢物和二氧化碳。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞團(tuán)塊內(nèi)可見(jiàn)復(fù)雜的膽管網(wǎng)絡(luò)和祖細(xì)胞樣的細(xì)胞集落，并檢測(cè)到血管樣結(jié)節(jié)部位的分裂細(xì)胞中含肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子[12]，這一發(fā)現(xiàn)為臨床上體外培養(yǎng)肝細(xì)胞，用于肝臟修復(fù)及移植提供依據(jù)。

3.4 三維細(xì)胞培養(yǎng)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在神經(jīng)系統(tǒng)領(lǐng)域也有涉及，近來(lái)有實(shí)驗(yàn)培植單一神經(jīng)元成為多細(xì)胞聚集體、海馬體活標(biāo)本切片后測(cè)試神經(jīng)元電勢(shì)、神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)治療老年癡呆癥、帕金森病等。在藥物測(cè)試中運(yùn)用神經(jīng)元細(xì)胞聚集體進(jìn)行毒理實(shí)驗(yàn)；在和生物材料的接觸效應(yīng)中運(yùn)用神經(jīng)元研究生物材料的體內(nèi)可降解性；在生長(zhǎng)支架中運(yùn)用神經(jīng)元和基質(zhì)研究再生過(guò)程；在信號(hào)識(shí)別中運(yùn)用神經(jīng)干細(xì)胞研究組織整合；在微質(zhì)量培養(yǎng)中運(yùn)用干細(xì)胞研究干細(xì)胞分化潛力。[13]這一發(fā)現(xiàn)為治療精神疾病及神經(jīng)系統(tǒng)研究提供寶貴依據(jù)。

4 展望

客觀(guān)來(lái)說(shuō)三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的誕生是令人矚目的，在器官再造、器官修復(fù)、抗腫瘤藥物的篩選等諸多領(lǐng)域取得里廣泛的應(yīng)用，除了這些醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，它也可在植物細(xì)胞領(lǐng)域中有所發(fā)展，以此研發(fā)出各種稀有中草藥。三維相對(duì)于二維細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)非常明顯，更接近細(xì)胞的體內(nèi)狀態(tài)；能夠提高細(xì)胞因子、抗體及其他生物分子等的產(chǎn)量；能夠改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)效率，細(xì)胞在三維環(huán)境中比在二維環(huán)境中生長(zhǎng)更健康；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更可靠。但三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與此同時(shí)也存在著許多問(wèn)題需要改進(jìn)，例如三維細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞不能永生化，同時(shí)分化能力也受到限制，使細(xì)胞處于亞佳狀態(tài)。對(duì)于相對(duì)復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，單靠三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是不足夠的。因此三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)需要不斷完善不斷進(jìn)步，與細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子免疫學(xué)、生物材料學(xué)等領(lǐng)域相結(jié)合，奠定好組織工程學(xué)的基礎(chǔ)，使其更好的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)

[1]VOYTIK- HARBINSL.Three-dimensional extracellular matrix substrates for cell culture[J] .MethodsCellBiol，2001，63：561-581.

[2]滕偉，郭志坤. 細(xì)胞三維培養(yǎng)的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，（12）：1767-1770.

[3]Cell survival in a three-dimensional matrix. ALAVI A，STUPACK D G. Methods in Enzymology.2007.

[4]OngSMZhaoZAroozTetal.Engineeringascaffld-free3Dtumormdelforivtrugpeetratnstdies.Bioaterials，2010，31：1180-1190.

[5]HkansonMTextorCharnleyM.Engineered3Denvironmentstoe-lucidatetheeffectofenvironmentalparametersondrugreponseincancer.IntegrBiol（Camb），2010，11：31-38.

[6]陳峻崧，王凈，陳登宇，等.三維培養(yǎng)評(píng)價(jià)人卵巢HO8910CD44～ +CD117～+CSCs耐藥性的研究[C].全國(guó)免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)，2012.

[7]Arrondeau J，Gan HK，Razak AR，et al. Development of anti-cancer drugs[J].Discov Med，2010，10（53）：355-362.

[8]Demir R，Kayisli UA，Cayli S，et al. Sequential steps during vasculogenesis and angiogenesis in the very early human placenta[J].Placenta，2006，27（6-7）：535-539.

[9]Ogawa R，Oki K，Hyakusoku H. Vascular tissue engineer ingand vascularized 3D tissue regeneration[J].Regen Med，2007，2（5）：831-837.

[10]王穎鈺，陸茵，張偉偉，孫志廣，鄭仕中，陳磊.三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2009，（12）：1545-1548.

[11]唐開(kāi)，黨耕町.三維細(xì)胞培養(yǎng)在骨組織工程中的應(yīng)用[J].中華骨科雜志，2003，（02）：60-62.

[12]程智清，劉景豐. 肝細(xì)胞體外三維培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2007，（14）：103-105.

[13]趙燕娜，許健，鄧同樂(lè).三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在再生醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].科技通報(bào)，2011，（04）：531-535.