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    灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變選育研究

    2017-10-19 03:02:30全衛(wèi)豐鄭惠華劉廣建季宏更
    食用菌 2017年5期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)樹花菌絲

    全衛(wèi)豐 鄭惠華 劉廣建 蔣 益 薛 璟 季宏更 汪 潔

    (1江蘇省蘇微微生物研究有限公司,江蘇無錫,214063;2江蘇?。ㄌK微)菌物工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫,214063;3江蘇安惠生物科技有限公司,江蘇南通216009)

    灰樹花是一種大型珍稀食藥用菌,又名舞茸、貝葉多孔菌,隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、灰樹花屬,子實(shí)體肉質(zhì),質(zhì)感脆嫩,外形層疊似菊,具有清香氣味[1]?;覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ǖ闹饕δ芪镔|(zhì)之一,可以從灰樹花子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中提取。相關(guān)研究證實(shí)灰樹花多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-木糖、D-甘露糖、D-鹽藻糖、L-阿拉伯糖、龍膽二糖和半乳糖組成的一類異構(gòu)糖復(fù)合物,具有生物活性的灰樹花多糖的基本結(jié)構(gòu)為帶有β-(1-6)側(cè)鏈的β(1-3)-D-葡聚糖[2-4]?;覙浠ǘ嗵蔷哂薪笛?、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤以及抵抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用,有著廣泛的藥理作用和應(yīng)用開發(fā)前景[5]。

    有研究工作者利用自然選育、雜交技術(shù)進(jìn)行灰樹花新菌株的選育工作,如劉振偉等[6]利用多孢雜交技術(shù)對(duì)不同種的灰樹花品種進(jìn)行雜交,培育出了灰樹花優(yōu)良菌株,栽培生物轉(zhuǎn)化率達(dá)73.4%,比出發(fā)菌株提高了19.5%,且表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐雜、抗雜能力。黃春燕等[7]對(duì)野生灰樹花菌種進(jìn)行系統(tǒng)選育馴化培養(yǎng)出“梯灰1號(hào)”,該品種豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、商品性好,已在部分地區(qū)推廣種植。迄今為止,僅見的研究報(bào)告主要在灰樹花的栽培品種選育方面。試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)選育灰樹花優(yōu)良新菌株,旨在通過改良菌種來提高灰樹花菌株液體發(fā)酵的多糖產(chǎn)率,為工業(yè)化生產(chǎn)制備灰樹花多糖創(chuàng)造條件,試驗(yàn)也在灰樹花多糖高產(chǎn)優(yōu)良菌株的人工選育方面做了有益的嘗試。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料①菌株:灰樹花1號(hào),引自北京吉蕈園科技有限公司。②試驗(yàn)儀器設(shè)備:紫外誘變箱,倒置顯微鏡(澳浦光電DSZ2000),渦旋振蕩器(IKA),旋轉(zhuǎn)式搖床(HZ-81),隔水式培養(yǎng)箱(DHP-9162B),0.22um針頭濾器(MILLEX GP),循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA等。③試劑:溶壁酶,購(gòu)于廣東省微生物研究所。甘露醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、麥芽糖均為分析純。

    1.2 培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基:土豆200 g,葡萄糖20 g,磷酸二氫鉀1 g,硫酸鎂 0.5 g,pH 自然,瓊脂20 g,加水1000 mL。

    PD液體培養(yǎng)基:土豆200 g,葡萄糖20 g,磷酸二氫鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,pH自然,玻璃珠適量,加水1000 mL。

    RM再生培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,麥芽糖4 g,酵母浸膏4 g,瓊脂15 g,pH自然,0.6 mol/L甘露醇溶液1000 mL。

    液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,豆餅粉10 g,玉米粉 20 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,VB150 mg,pH自然,加水1000 mL。

    液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2.5%,玉米粉2.5%,豆餅粉0.75%,磷酸氫二鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,pH自然,加水1000 mL。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 灰樹花原生質(zhì)體制備及再生

    1.3.1.1 菌絲培養(yǎng) 灰樹花斜面菌塊接種于150 mL PD液體培養(yǎng)基中,靜置培養(yǎng)7~9 d,其間每日振搖1次。培養(yǎng)液過80目銅篩,去除瓊脂塊,收集菌絲,無菌水沖洗1遍,甘露醇溶液沖洗2遍,盡可能擠去水分,置于滅菌后的空試管中,稱重,計(jì)算出菌絲濕重。取菌絲約1 g。

    1.3.1.2 菌絲酶解 溶壁酶配置成2%濃度,30℃活化0.5 h,酶液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾后,按照每100 mg濕菌絲添加1 mL的酶液量加入酶液,渦旋振蕩混勻。選取酶解溫度和時(shí)間作為試驗(yàn)因素,設(shè)置不同的因素水平,基礎(chǔ)參數(shù):酶解溫度32℃;時(shí)間3 h[8]。鏡檢觀察原生質(zhì)體情況。

    1.3.1.3 原生質(zhì)體的精制 酶解液用滅菌后的8層擦鏡紙過濾,甘露醇溶液洗滌,3000 r/min離心15 min,重復(fù)處理兩次,加入甘露醇溶液定容至15 mL,渦旋振蕩混勻,得原生質(zhì)體懸液備用。

    1.3.1.4 原生質(zhì)體再生 將精制后的原生質(zhì)體懸液稀釋至107個(gè)/mL(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)),取0.1 mL涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上,26℃避光培養(yǎng)7~10 d,觀察原生質(zhì)體菌落再生情況,計(jì)數(shù)。計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。

    原生質(zhì)體再生率=再生的原生質(zhì)體菌落數(shù)/原生質(zhì)體數(shù)量×100%

    1.3.2 原生質(zhì)體紫外誘變 取精制的原生質(zhì)體懸液,稀釋至濃度107個(gè)/mL級(jí),渦旋混勻,取約15~20 mL,置于滅菌后的培養(yǎng)皿中,放置滅菌回形針兩個(gè)。

    紫外誘變箱中進(jìn)行紫外誘變處理,同時(shí)開啟磁力攪拌。紫外燈管15 W,距離20 cm,分別處理0 s,15 s,30 s,45 s,60 s,75 s,90 s,120 s。每個(gè)平皿取0.2 mL涂布于RM再生培養(yǎng)基上,26℃避光培養(yǎng)10~12 d,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),誘變過程中避免可見光,防止發(fā)生光修復(fù)。以紫外誘變0s作為對(duì)照,考察紫外誘變劑量(時(shí)間)對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響。致死率=1-(紫外誘變處理后原生質(zhì)體再生菌落的數(shù)量/對(duì)照原生質(zhì)體的再生菌落數(shù)量)×100%

    1.3.3 誘變菌株篩選 在RM再生培養(yǎng)基上挑選出經(jīng)誘變后再生的菌落,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上,與出發(fā)菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)、菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。

    1.3.3.1 拮抗試驗(yàn) 將誘變后菌株與出發(fā)菌株接種于同一PDA培養(yǎng)基平板上,26℃避光培養(yǎng),觀察菌絲相接處生長(zhǎng)情況。如菌絲相接處有明顯的相斥,菌絲在相接處何不生長(zhǎng)或向上拱起,從背面觀察相交處呈現(xiàn)細(xì)線,則可以認(rèn)定兩種菌絲有拮抗現(xiàn)象;如菌絲互相相交滲透生長(zhǎng),沒有明顯的相斥,則可以認(rèn)定這兩種菌絲不存在拮抗現(xiàn)象。

    1.3.3.2 菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn) 選擇適齡菌種,用打孔器(直徑為6 mm)接種于PDA培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)皿背面接種處劃“十”字交叉線標(biāo)記,26℃避光培養(yǎng)14 d左右。其間,等菌絲萌發(fā)后每隔兩天測(cè)量一次菌絲生長(zhǎng)邊緣至“十”字交叉點(diǎn)的距離,取四個(gè)值的平均值作為菌落的半徑。記錄不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的菌落半徑,計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

    1.3.3.3 液體搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) 在菌落外緣,取同樣菌齡的PDA平板培養(yǎng)基上的菌種,用打孔器接種15~20菌塊,接種于液體種子培養(yǎng)基中,26℃,140 r/min,旋轉(zhuǎn)式搖床,避光培養(yǎng)8~10 d。以8%接種量接液體種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件下培養(yǎng)5~7 d,抽濾,菌絲體65℃烘干至恒重,稱重,即為菌絲生物量。

    分別收集發(fā)酵菌絲體進(jìn)行菌絲體胞內(nèi)多糖的含量測(cè)定。測(cè)定方法為硫酸-蒽酮法[9]。搖瓶液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖產(chǎn)量=菌絲體生物量×胞內(nèi)多糖含量(單位:g/L)

    1.3.3.4 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 利用同工酶電泳試驗(yàn)對(duì)經(jīng)過篩選后的菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行比較驗(yàn)證,判別是否為遺傳性狀不同的菌株[10,11]。計(jì)算試驗(yàn)菌株酯酶同工酶電泳圖譜譜帶相似度T和關(guān)聯(lián)度S。T=nx1…n/(X1+X2+……+Xn),其中n表示試驗(yàn)菌株的數(shù)量,xn表示第n個(gè)菌株的酶譜的帶數(shù),X1…n是n個(gè)菌株所共同具有的酶譜的帶數(shù),S=(兩個(gè)菌株之間共有的酶譜帶數(shù))/(兩菌株所具有的酶譜帶數(shù)之和減去兩個(gè)菌株所共有的酶譜帶數(shù))。如果T<0.9、S<0.8,則可判定試驗(yàn)菌株發(fā)生了變異。

    1.3.4 菌株遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 將需要進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證的試驗(yàn)菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)10次,而后參見1.2.3.2和1.2.3.3的試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證,比較經(jīng)過繼代培養(yǎng)的菌株與初代菌株之間在菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo)上有無明顯的退化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酶解溫度、時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體制備及再生率的影響鏡檢發(fā)現(xiàn),酶解溫度在28~34℃對(duì)原生質(zhì)體制備的數(shù)量有一定的影響,原生質(zhì)體產(chǎn)量在32℃最高,在34℃時(shí)相應(yīng)的原生質(zhì)體數(shù)量有所下降,但這種差異不是非常顯著。另從表1中可以看出,在28~34℃的試驗(yàn)溫度內(nèi),隨著溫度的上升,原生質(zhì)體再生率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì),在32℃原生質(zhì)體的再生率最高,達(dá)到0.00231%。

    表1 酶解溫度對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

    表2 酶解時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

    圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響

    圖2 菌絲拮抗試驗(yàn)

    表3 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)結(jié)果

    通過鏡檢發(fā)現(xiàn),酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的生成有顯著的影響,在酶解2 h后,原生質(zhì)的數(shù)量比較少,大量存在的是菌絲,而在3 h之后原生質(zhì)體的數(shù)量較多,有少量的菌絲,原生質(zhì)體數(shù)量出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng),在酶解4 h后,原生質(zhì)體的數(shù)量同比有一定的增長(zhǎng)。另從表2可見,原生質(zhì)體再生率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在酶解2~4 h,以酶解2 h所對(duì)應(yīng)的原生質(zhì)體再生率最高。由于在酶解2 h,原生質(zhì)體制備的數(shù)量非常少,綜合原生質(zhì)體的數(shù)量及再生率,試驗(yàn)選擇酶解時(shí)間3 h為宜。

    綜合酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生率的影響,試驗(yàn)選擇酶解溫度32℃,酶解3 h作為灰樹花原生質(zhì)體制備的適宜參數(shù)。

    2.2 紫外誘變劑量對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響試驗(yàn)中選擇紫外誘變時(shí)間作為主要的誘變劑量參數(shù)。

    由圖1可見,在15 W紫外燈管,距離樣品20 cm時(shí),灰樹花原生質(zhì)體致死率隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì),在紫外照射時(shí)間60 s時(shí),原生質(zhì)體致死率為90%,而在照射時(shí)間達(dá)到90 s以上時(shí),原生質(zhì)體幾乎沒有再生,明顯高于在相同劑量下紫外誘變菌絲所對(duì)應(yīng)的致死率(基于相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果,數(shù)據(jù)暫未列出)。分析其中原因,可能是原生質(zhì)體缺少了細(xì)胞壁的保護(hù),導(dǎo)致其對(duì)紫外線損傷的耐受性明顯降低,更容易致死,同時(shí)經(jīng)過誘變后,原生質(zhì)體的再生也較難。鑒于以往經(jīng)驗(yàn),選擇致死率為90%所對(duì)應(yīng)的誘變劑量作為試驗(yàn)誘變的適宜劑量,即在15 W紫外燈管距離樣品20 cm時(shí),照射60 s作為適宜的誘變條件。

    2.3 誘變菌株的篩選

    2.3.1 初篩 挑取誘變?cè)偕蟮脑囼?yàn)菌株約600多株與對(duì)照菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn),先后挑取有拮抗現(xiàn)象的菌落156個(gè),其試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示(僅選取部分圖片),在試驗(yàn)菌株與對(duì)照菌株菌絲相交界處,菌絲生長(zhǎng)不相互滲透,呈現(xiàn)向上隆起的現(xiàn)象,從而形成明顯的拮抗線。如圖2所示為菌株拮抗呈陽(yáng)性的圖片。

    2.3.2 復(fù)篩

    2.3.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn) 選取初篩得到的菌株(即拮抗試驗(yàn)呈陽(yáng)性的菌株)156株,與對(duì)照菌株進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。其結(jié)果如表3、表4所示(由于試驗(yàn)數(shù)據(jù)過多,僅列出部分試驗(yàn)數(shù)據(jù))。

    由表3可見不同灰樹花菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度約在1.00~2.81 mm/d,其中菌絲生長(zhǎng)速度以菌株1、5、7號(hào)較快,1號(hào)菌株生長(zhǎng)速度明顯高于其它菌株,且高于對(duì)照菌株;菌絲形態(tài)以菌株1、4以及對(duì)照菌株較粗壯,濃白,生長(zhǎng)活力較強(qiáng)。菌株5、7、8號(hào)菌絲較粗,呈白色;而菌株2、3、6菌絲較細(xì)。

    表4 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.2.2 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn) 由表4可見,生物量以1、6和8號(hào)菌株較高,3和7號(hào)菌株較低;胞內(nèi)多糖含量以1、5、6、7、8號(hào)較高,高于對(duì)照。菌株搖瓶液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量在0.45~0.77 g/L,以1、6和8號(hào)較高,3、7號(hào)菌株較低,其中1號(hào)和8號(hào)菌株分別比對(duì)照高出37.5%和25.0%。

    2.3.3 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 試驗(yàn)初選出有拮抗現(xiàn)象、菌絲較為粗壯,菌絲生長(zhǎng)速度及生物量等高于出發(fā)菌株5%以上的菌株28株,與出發(fā)菌株進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗(yàn),驗(yàn)證試驗(yàn)菌株與出發(fā)菌株相比是否發(fā)生了變異。部分電泳試驗(yàn)圖譜如圖3所示。

    試驗(yàn)菌株共計(jì)28株,得到不同的譜帶共計(jì)10條,試驗(yàn)菌株中T<0.9、S<0.8的菌株有16個(gè),綜合菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo),擇優(yōu)選擇6株菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 ,其 編 號(hào) 為 zygf001,zygf008,zygf041,zygf101,zygf105,zygf154。

    圖3 灰樹花菌株酯酶同工酶電泳圖譜

    2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)6株新菌株進(jìn)行了遺傳性狀穩(wěn)定性的驗(yàn)證試驗(yàn)(僅列出部分?jǐn)?shù)據(jù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Spss處理),由表5可見,菌株zygf001和zygf008在繼代培養(yǎng)10代后,與初代相比,在菌絲生長(zhǎng)速度、液體發(fā)酵菌絲生物量、菌絲胞內(nèi)多糖含量及產(chǎn)量數(shù)據(jù)不存在顯著變化(P>0.05),遺傳性狀較穩(wěn)定。而菌株zygf041、zygf101、zygf105和zygf154相應(yīng)的指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降(P<0.01),菌株性狀出現(xiàn)一定的退化。

    表5 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    菌株zygf001多糖產(chǎn)量高于zygf008,因此試驗(yàn)最終選擇zygf001號(hào)菌株作為灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變篩選的目標(biāo)菌株,其搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量分別達(dá)到了1.15 g/100 mL和0.78 g/L。

    3 小結(jié)與討論

    試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變選育灰樹花多糖高產(chǎn)新菌株,獲得了一株灰樹花新菌株,其在搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)中,菌絲體生物量(干計(jì))及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量等指標(biāo)達(dá)到1.15 g/mL和0.78 g/L,分別比出發(fā)菌株提高了40.2%和37.5%,且遺傳性狀穩(wěn)定,為進(jìn)一步的中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了良好的條件,同時(shí)誘變出的其它新菌株為灰樹花高產(chǎn)多糖菌株的進(jìn)一步選育提供了很好的生物材料。

    原生質(zhì)體紫外誘變?cè)诨覙浠ň甑倪x育上獲得了成功,相較于其他誘變育種的方法,本方法具有工藝較為簡(jiǎn)單、材料易獲得、對(duì)設(shè)備要求不高以及試驗(yàn)過程對(duì)人體無毒害等優(yōu)勢(shì)。紫外誘變可使生物材料的DNA分子形成嘧啶二聚體,減弱雙鍵間氫鍵的作用,引起DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)變形扭曲,影響其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,同時(shí)引起堿基顛換、轉(zhuǎn)換、缺失或移碼,造成突變。從試驗(yàn)結(jié)果來看,原生質(zhì)體紫外誘變菌株的方法可以完成預(yù)期目標(biāo),但相應(yīng)的突變率比較小,試驗(yàn)工作量較大。

    灰樹花多糖的功效受到灰樹花多糖組成成分、分子量分布以及結(jié)構(gòu)等因素影響,而這些與灰樹花品種及培養(yǎng)條件緊密相關(guān),因此有必要對(duì)此灰樹花菌株粗多糖開展分離純化、組成成分和結(jié)構(gòu)分析的深入研究;另外灰樹花新菌株的性狀與出發(fā)菌株相比有一定的差異,今后有待于圍繞液體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及灰樹花多糖提取工藝,在中試和產(chǎn)業(yè)化階段開展進(jìn)一步的深入研究,提高灰樹花多糖的產(chǎn)量,實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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