• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變選育研究

    2017-10-19 03:02:30全衛(wèi)豐鄭惠華劉廣建季宏更
    食用菌 2017年5期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)樹花菌絲

    全衛(wèi)豐 鄭惠華 劉廣建 蔣 益 薛 璟 季宏更 汪 潔

    (1江蘇省蘇微微生物研究有限公司,江蘇無錫,214063;2江蘇?。ㄌK微)菌物工程技術(shù)研究中心,江蘇無錫,214063;3江蘇安惠生物科技有限公司,江蘇南通216009)

    灰樹花是一種大型珍稀食藥用菌,又名舞茸、貝葉多孔菌,隸屬于擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、灰樹花屬,子實(shí)體肉質(zhì),質(zhì)感脆嫩,外形層疊似菊,具有清香氣味[1]?;覙浠ǘ嗵鞘腔覙浠ǖ闹饕δ芪镔|(zhì)之一,可以從灰樹花子實(shí)體、液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液中提取。相關(guān)研究證實(shí)灰樹花多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-木糖、D-甘露糖、D-鹽藻糖、L-阿拉伯糖、龍膽二糖和半乳糖組成的一類異構(gòu)糖復(fù)合物,具有生物活性的灰樹花多糖的基本結(jié)構(gòu)為帶有β-(1-6)側(cè)鏈的β(1-3)-D-葡聚糖[2-4]?;覙浠ǘ嗵蔷哂薪笛?、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤以及抵抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等作用,有著廣泛的藥理作用和應(yīng)用開發(fā)前景[5]。

    有研究工作者利用自然選育、雜交技術(shù)進(jìn)行灰樹花新菌株的選育工作,如劉振偉等[6]利用多孢雜交技術(shù)對(duì)不同種的灰樹花品種進(jìn)行雜交,培育出了灰樹花優(yōu)良菌株,栽培生物轉(zhuǎn)化率達(dá)73.4%,比出發(fā)菌株提高了19.5%,且表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐雜、抗雜能力。黃春燕等[7]對(duì)野生灰樹花菌種進(jìn)行系統(tǒng)選育馴化培養(yǎng)出“梯灰1號(hào)”,該品種豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、商品性好,已在部分地區(qū)推廣種植。迄今為止,僅見的研究報(bào)告主要在灰樹花的栽培品種選育方面。試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)選育灰樹花優(yōu)良新菌株,旨在通過改良菌種來提高灰樹花菌株液體發(fā)酵的多糖產(chǎn)率,為工業(yè)化生產(chǎn)制備灰樹花多糖創(chuàng)造條件,試驗(yàn)也在灰樹花多糖高產(chǎn)優(yōu)良菌株的人工選育方面做了有益的嘗試。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料①菌株:灰樹花1號(hào),引自北京吉蕈園科技有限公司。②試驗(yàn)儀器設(shè)備:紫外誘變箱,倒置顯微鏡(澳浦光電DSZ2000),渦旋振蕩器(IKA),旋轉(zhuǎn)式搖床(HZ-81),隔水式培養(yǎng)箱(DHP-9162B),0.22um針頭濾器(MILLEX GP),循環(huán)水式多用真空泵SHB-ⅢA等。③試劑:溶壁酶,購(gòu)于廣東省微生物研究所。甘露醇、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、麥芽糖均為分析純。

    1.2 培養(yǎng)基配方PDA培養(yǎng)基:土豆200 g,葡萄糖20 g,磷酸二氫鉀1 g,硫酸鎂 0.5 g,pH 自然,瓊脂20 g,加水1000 mL。

    PD液體培養(yǎng)基:土豆200 g,葡萄糖20 g,磷酸二氫鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,pH自然,玻璃珠適量,加水1000 mL。

    RM再生培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,麥芽糖4 g,酵母浸膏4 g,瓊脂15 g,pH自然,0.6 mol/L甘露醇溶液1000 mL。

    液體種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,豆餅粉10 g,玉米粉 20 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂0.5 g,VB150 mg,pH自然,加水1000 mL。

    液體發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖2.5%,玉米粉2.5%,豆餅粉0.75%,磷酸氫二鉀0.1%,硫酸鎂0.05%,pH自然,加水1000 mL。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 灰樹花原生質(zhì)體制備及再生

    1.3.1.1 菌絲培養(yǎng) 灰樹花斜面菌塊接種于150 mL PD液體培養(yǎng)基中,靜置培養(yǎng)7~9 d,其間每日振搖1次。培養(yǎng)液過80目銅篩,去除瓊脂塊,收集菌絲,無菌水沖洗1遍,甘露醇溶液沖洗2遍,盡可能擠去水分,置于滅菌后的空試管中,稱重,計(jì)算出菌絲濕重。取菌絲約1 g。

    1.3.1.2 菌絲酶解 溶壁酶配置成2%濃度,30℃活化0.5 h,酶液用0.22 μm細(xì)菌濾器過濾后,按照每100 mg濕菌絲添加1 mL的酶液量加入酶液,渦旋振蕩混勻。選取酶解溫度和時(shí)間作為試驗(yàn)因素,設(shè)置不同的因素水平,基礎(chǔ)參數(shù):酶解溫度32℃;時(shí)間3 h[8]。鏡檢觀察原生質(zhì)體情況。

    1.3.1.3 原生質(zhì)體的精制 酶解液用滅菌后的8層擦鏡紙過濾,甘露醇溶液洗滌,3000 r/min離心15 min,重復(fù)處理兩次,加入甘露醇溶液定容至15 mL,渦旋振蕩混勻,得原生質(zhì)體懸液備用。

    1.3.1.4 原生質(zhì)體再生 將精制后的原生質(zhì)體懸液稀釋至107個(gè)/mL(血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)),取0.1 mL涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上,26℃避光培養(yǎng)7~10 d,觀察原生質(zhì)體菌落再生情況,計(jì)數(shù)。計(jì)算原生質(zhì)體的再生率。

    原生質(zhì)體再生率=再生的原生質(zhì)體菌落數(shù)/原生質(zhì)體數(shù)量×100%

    1.3.2 原生質(zhì)體紫外誘變 取精制的原生質(zhì)體懸液,稀釋至濃度107個(gè)/mL級(jí),渦旋混勻,取約15~20 mL,置于滅菌后的培養(yǎng)皿中,放置滅菌回形針兩個(gè)。

    紫外誘變箱中進(jìn)行紫外誘變處理,同時(shí)開啟磁力攪拌。紫外燈管15 W,距離20 cm,分別處理0 s,15 s,30 s,45 s,60 s,75 s,90 s,120 s。每個(gè)平皿取0.2 mL涂布于RM再生培養(yǎng)基上,26℃避光培養(yǎng)10~12 d,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),誘變過程中避免可見光,防止發(fā)生光修復(fù)。以紫外誘變0s作為對(duì)照,考察紫外誘變劑量(時(shí)間)對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響。致死率=1-(紫外誘變處理后原生質(zhì)體再生菌落的數(shù)量/對(duì)照原生質(zhì)體的再生菌落數(shù)量)×100%

    1.3.3 誘變菌株篩選 在RM再生培養(yǎng)基上挑選出經(jīng)誘變后再生的菌落,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上,與出發(fā)菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)、菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。

    1.3.3.1 拮抗試驗(yàn) 將誘變后菌株與出發(fā)菌株接種于同一PDA培養(yǎng)基平板上,26℃避光培養(yǎng),觀察菌絲相接處生長(zhǎng)情況。如菌絲相接處有明顯的相斥,菌絲在相接處何不生長(zhǎng)或向上拱起,從背面觀察相交處呈現(xiàn)細(xì)線,則可以認(rèn)定兩種菌絲有拮抗現(xiàn)象;如菌絲互相相交滲透生長(zhǎng),沒有明顯的相斥,則可以認(rèn)定這兩種菌絲不存在拮抗現(xiàn)象。

    1.3.3.2 菌絲生長(zhǎng)速度比較試驗(yàn) 選擇適齡菌種,用打孔器(直徑為6 mm)接種于PDA培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)皿背面接種處劃“十”字交叉線標(biāo)記,26℃避光培養(yǎng)14 d左右。其間,等菌絲萌發(fā)后每隔兩天測(cè)量一次菌絲生長(zhǎng)邊緣至“十”字交叉點(diǎn)的距離,取四個(gè)值的平均值作為菌落的半徑。記錄不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的菌落半徑,計(jì)算菌絲平均生長(zhǎng)速度。

    1.3.3.3 液體搖瓶發(fā)酵試驗(yàn) 在菌落外緣,取同樣菌齡的PDA平板培養(yǎng)基上的菌種,用打孔器接種15~20菌塊,接種于液體種子培養(yǎng)基中,26℃,140 r/min,旋轉(zhuǎn)式搖床,避光培養(yǎng)8~10 d。以8%接種量接液體種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,同樣條件下培養(yǎng)5~7 d,抽濾,菌絲體65℃烘干至恒重,稱重,即為菌絲生物量。

    分別收集發(fā)酵菌絲體進(jìn)行菌絲體胞內(nèi)多糖的含量測(cè)定。測(cè)定方法為硫酸-蒽酮法[9]。搖瓶液體發(fā)酵胞內(nèi)多糖產(chǎn)量=菌絲體生物量×胞內(nèi)多糖含量(單位:g/L)

    1.3.3.4 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 利用同工酶電泳試驗(yàn)對(duì)經(jīng)過篩選后的菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行比較驗(yàn)證,判別是否為遺傳性狀不同的菌株[10,11]。計(jì)算試驗(yàn)菌株酯酶同工酶電泳圖譜譜帶相似度T和關(guān)聯(lián)度S。T=nx1…n/(X1+X2+……+Xn),其中n表示試驗(yàn)菌株的數(shù)量,xn表示第n個(gè)菌株的酶譜的帶數(shù),X1…n是n個(gè)菌株所共同具有的酶譜的帶數(shù),S=(兩個(gè)菌株之間共有的酶譜帶數(shù))/(兩菌株所具有的酶譜帶數(shù)之和減去兩個(gè)菌株所共有的酶譜帶數(shù))。如果T<0.9、S<0.8,則可判定試驗(yàn)菌株發(fā)生了變異。

    1.3.4 菌株遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 將需要進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證的試驗(yàn)菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上連續(xù)繼代培養(yǎng)10次,而后參見1.2.3.2和1.2.3.3的試驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證,比較經(jīng)過繼代培養(yǎng)的菌株與初代菌株之間在菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo)上有無明顯的退化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酶解溫度、時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體制備及再生率的影響鏡檢發(fā)現(xiàn),酶解溫度在28~34℃對(duì)原生質(zhì)體制備的數(shù)量有一定的影響,原生質(zhì)體產(chǎn)量在32℃最高,在34℃時(shí)相應(yīng)的原生質(zhì)體數(shù)量有所下降,但這種差異不是非常顯著。另從表1中可以看出,在28~34℃的試驗(yàn)溫度內(nèi),隨著溫度的上升,原生質(zhì)體再生率呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢(shì),在32℃原生質(zhì)體的再生率最高,達(dá)到0.00231%。

    表1 酶解溫度對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

    表2 酶解時(shí)間對(duì)灰樹花原生質(zhì)體再生率的影響

    圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響

    圖2 菌絲拮抗試驗(yàn)

    表3 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)結(jié)果

    通過鏡檢發(fā)現(xiàn),酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體的生成有顯著的影響,在酶解2 h后,原生質(zhì)的數(shù)量比較少,大量存在的是菌絲,而在3 h之后原生質(zhì)體的數(shù)量較多,有少量的菌絲,原生質(zhì)體數(shù)量出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng),在酶解4 h后,原生質(zhì)體的數(shù)量同比有一定的增長(zhǎng)。另從表2可見,原生質(zhì)體再生率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在酶解2~4 h,以酶解2 h所對(duì)應(yīng)的原生質(zhì)體再生率最高。由于在酶解2 h,原生質(zhì)體制備的數(shù)量非常少,綜合原生質(zhì)體的數(shù)量及再生率,試驗(yàn)選擇酶解時(shí)間3 h為宜。

    綜合酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備及再生率的影響,試驗(yàn)選擇酶解溫度32℃,酶解3 h作為灰樹花原生質(zhì)體制備的適宜參數(shù)。

    2.2 紫外誘變劑量對(duì)原生質(zhì)體致死率的影響試驗(yàn)中選擇紫外誘變時(shí)間作為主要的誘變劑量參數(shù)。

    由圖1可見,在15 W紫外燈管,距離樣品20 cm時(shí),灰樹花原生質(zhì)體致死率隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì),在紫外照射時(shí)間60 s時(shí),原生質(zhì)體致死率為90%,而在照射時(shí)間達(dá)到90 s以上時(shí),原生質(zhì)體幾乎沒有再生,明顯高于在相同劑量下紫外誘變菌絲所對(duì)應(yīng)的致死率(基于相應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果,數(shù)據(jù)暫未列出)。分析其中原因,可能是原生質(zhì)體缺少了細(xì)胞壁的保護(hù),導(dǎo)致其對(duì)紫外線損傷的耐受性明顯降低,更容易致死,同時(shí)經(jīng)過誘變后,原生質(zhì)體的再生也較難。鑒于以往經(jīng)驗(yàn),選擇致死率為90%所對(duì)應(yīng)的誘變劑量作為試驗(yàn)誘變的適宜劑量,即在15 W紫外燈管距離樣品20 cm時(shí),照射60 s作為適宜的誘變條件。

    2.3 誘變菌株的篩選

    2.3.1 初篩 挑取誘變?cè)偕蟮脑囼?yàn)菌株約600多株與對(duì)照菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn),先后挑取有拮抗現(xiàn)象的菌落156個(gè),其試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示(僅選取部分圖片),在試驗(yàn)菌株與對(duì)照菌株菌絲相交界處,菌絲生長(zhǎng)不相互滲透,呈現(xiàn)向上隆起的現(xiàn)象,從而形成明顯的拮抗線。如圖2所示為菌株拮抗呈陽(yáng)性的圖片。

    2.3.2 復(fù)篩

    2.3.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn) 選取初篩得到的菌株(即拮抗試驗(yàn)呈陽(yáng)性的菌株)156株,與對(duì)照菌株進(jìn)行菌絲生長(zhǎng)速度試驗(yàn)和搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)。其結(jié)果如表3、表4所示(由于試驗(yàn)數(shù)據(jù)過多,僅列出部分試驗(yàn)數(shù)據(jù))。

    由表3可見不同灰樹花菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度約在1.00~2.81 mm/d,其中菌絲生長(zhǎng)速度以菌株1、5、7號(hào)較快,1號(hào)菌株生長(zhǎng)速度明顯高于其它菌株,且高于對(duì)照菌株;菌絲形態(tài)以菌株1、4以及對(duì)照菌株較粗壯,濃白,生長(zhǎng)活力較強(qiáng)。菌株5、7、8號(hào)菌絲較粗,呈白色;而菌株2、3、6菌絲較細(xì)。

    表4 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

    2.3.2.2 搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn) 由表4可見,生物量以1、6和8號(hào)菌株較高,3和7號(hào)菌株較低;胞內(nèi)多糖含量以1、5、6、7、8號(hào)較高,高于對(duì)照。菌株搖瓶液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量在0.45~0.77 g/L,以1、6和8號(hào)較高,3、7號(hào)菌株較低,其中1號(hào)和8號(hào)菌株分別比對(duì)照高出37.5%和25.0%。

    2.3.3 酯酶同工酶電泳試驗(yàn) 試驗(yàn)初選出有拮抗現(xiàn)象、菌絲較為粗壯,菌絲生長(zhǎng)速度及生物量等高于出發(fā)菌株5%以上的菌株28株,與出發(fā)菌株進(jìn)行酯酶同工酶電泳試驗(yàn),驗(yàn)證試驗(yàn)菌株與出發(fā)菌株相比是否發(fā)生了變異。部分電泳試驗(yàn)圖譜如圖3所示。

    試驗(yàn)菌株共計(jì)28株,得到不同的譜帶共計(jì)10條,試驗(yàn)菌株中T<0.9、S<0.8的菌株有16個(gè),綜合菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量等指標(biāo),擇優(yōu)選擇6株菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的驗(yàn)證 ,其 編 號(hào) 為 zygf001,zygf008,zygf041,zygf101,zygf105,zygf154。

    圖3 灰樹花菌株酯酶同工酶電泳圖譜

    2.4 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)6株新菌株進(jìn)行了遺傳性狀穩(wěn)定性的驗(yàn)證試驗(yàn)(僅列出部分?jǐn)?shù)據(jù),數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Spss處理),由表5可見,菌株zygf001和zygf008在繼代培養(yǎng)10代后,與初代相比,在菌絲生長(zhǎng)速度、液體發(fā)酵菌絲生物量、菌絲胞內(nèi)多糖含量及產(chǎn)量數(shù)據(jù)不存在顯著變化(P>0.05),遺傳性狀較穩(wěn)定。而菌株zygf041、zygf101、zygf105和zygf154相應(yīng)的指標(biāo)出現(xiàn)明顯下降(P<0.01),菌株性狀出現(xiàn)一定的退化。

    表5 菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    菌株zygf001多糖產(chǎn)量高于zygf008,因此試驗(yàn)最終選擇zygf001號(hào)菌株作為灰樹花多糖高產(chǎn)菌株誘變篩選的目標(biāo)菌株,其搖瓶液體發(fā)酵生物量和多糖產(chǎn)量分別達(dá)到了1.15 g/100 mL和0.78 g/L。

    3 小結(jié)與討論

    試驗(yàn)采用原生質(zhì)體紫外誘變選育灰樹花多糖高產(chǎn)新菌株,獲得了一株灰樹花新菌株,其在搖瓶液體發(fā)酵試驗(yàn)中,菌絲體生物量(干計(jì))及胞內(nèi)多糖產(chǎn)量等指標(biāo)達(dá)到1.15 g/mL和0.78 g/L,分別比出發(fā)菌株提高了40.2%和37.5%,且遺傳性狀穩(wěn)定,為進(jìn)一步的中試及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了良好的條件,同時(shí)誘變出的其它新菌株為灰樹花高產(chǎn)多糖菌株的進(jìn)一步選育提供了很好的生物材料。

    原生質(zhì)體紫外誘變?cè)诨覙浠ň甑倪x育上獲得了成功,相較于其他誘變育種的方法,本方法具有工藝較為簡(jiǎn)單、材料易獲得、對(duì)設(shè)備要求不高以及試驗(yàn)過程對(duì)人體無毒害等優(yōu)勢(shì)。紫外誘變可使生物材料的DNA分子形成嘧啶二聚體,減弱雙鍵間氫鍵的作用,引起DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)變形扭曲,影響其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄,同時(shí)引起堿基顛換、轉(zhuǎn)換、缺失或移碼,造成突變。從試驗(yàn)結(jié)果來看,原生質(zhì)體紫外誘變菌株的方法可以完成預(yù)期目標(biāo),但相應(yīng)的突變率比較小,試驗(yàn)工作量較大。

    灰樹花多糖的功效受到灰樹花多糖組成成分、分子量分布以及結(jié)構(gòu)等因素影響,而這些與灰樹花品種及培養(yǎng)條件緊密相關(guān),因此有必要對(duì)此灰樹花菌株粗多糖開展分離純化、組成成分和結(jié)構(gòu)分析的深入研究;另外灰樹花新菌株的性狀與出發(fā)菌株相比有一定的差異,今后有待于圍繞液體發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及灰樹花多糖提取工藝,在中試和產(chǎn)業(yè)化階段開展進(jìn)一步的深入研究,提高灰樹花多糖的產(chǎn)量,實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

    猜你喜歡
    原生質(zhì)樹花菌絲
    感恩生活,給生命一樹花開——讀《花田半畝》有感
    井岡教育(2022年2期)2022-10-14 03:11:40
    羊肚菌母種培養(yǎng)基配方的優(yōu)化研究
    中國(guó)被毛孢三種菌絲形態(tài)的超顯微特征觀察
    送你一樹花
    陌上花開文學(xué)社:播撒文學(xué)之種,靜待一樹花開
    香菇Y(jié)J-01原生質(zhì)體制備與再生條件的優(yōu)化
    食用菌(2017年5期)2017-10-19 03:02:28
    甘露醇對(duì)低溫下草菇菌絲的保護(hù)效應(yīng)研究
    新型抗菌肽菌絲霉素純化工藝研究
    廣東飼料(2016年5期)2016-12-01 03:43:21
    酶法制備黑曲霉原生質(zhì)體的條件
    電擊法介導(dǎo)的人參大片段DNA轉(zhuǎn)化靈芝原生質(zhì)體的研究
    美女午夜性视频免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| svipshipincom国产片| 亚洲五月婷婷丁香| 91成年电影在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 一本综合久久免费| 9色porny在线观看| a在线观看视频网站| 五月开心婷婷网| 老司机靠b影院| 日韩国内少妇激情av| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久国内视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲国产欧美网| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精品国产色婷婷电影| 在线观看免费日韩欧美大片| 啦啦啦 在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品 欧美亚洲| 无人区码免费观看不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲片人在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 黄色女人牲交| 精品人妻1区二区| 激情视频va一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 极品人妻少妇av视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日本五十路高清| 亚洲精品成人av观看孕妇| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费av中文字幕在线| 欧美一级毛片孕妇| 国产熟女午夜一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 首页视频小说图片口味搜索| 国产av又大| 一区二区三区精品91| 亚洲av熟女| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲男人天堂网一区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产欧美日韩一区二区精品| www.www免费av| 精品免费久久久久久久清纯| 91成年电影在线观看| 亚洲av成人av| a级片在线免费高清观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 在线视频色国产色| 99久久人妻综合| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 咕卡用的链子| 91在线观看av| 久久久久久久久中文| 亚洲精品久久午夜乱码| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美成人免费av一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 免费不卡黄色视频| bbb黄色大片| 99香蕉大伊视频| 超色免费av| 国产精华一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久亚洲真实| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 18禁美女被吸乳视频| 男女之事视频高清在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久影院123| 午夜久久久在线观看| svipshipincom国产片| 99久久综合精品五月天人人| av片东京热男人的天堂| 久久草成人影院| 婷婷丁香在线五月| 亚洲avbb在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产97色在线日韩免费| 操美女的视频在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲在线自拍视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 中文字幕最新亚洲高清| 看免费av毛片| 一级毛片女人18水好多| 欧美最黄视频在线播放免费 | av免费在线观看网站| a级毛片黄视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产免费男女视频| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 午夜日韩欧美国产| 一本大道久久a久久精品| 国产精品国产高清国产av| 一边摸一边做爽爽视频免费| 丝袜在线中文字幕| 亚洲伊人色综图| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 免费搜索国产男女视频| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲黑人精品在线| 国产成人精品久久二区二区91| 久久精品国产亚洲av高清一级| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜福利在线观看吧| 在线观看午夜福利视频| 中国美女看黄片| 国产成人影院久久av| 久久久久九九精品影院| 一区在线观看完整版| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费看十八禁软件| 母亲3免费完整高清在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲九九香蕉| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黄色视频,在线免费观看| 露出奶头的视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美激情高清一区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲av熟女| 精品国产乱码久久久久久男人| 天堂中文最新版在线下载| 久久人妻熟女aⅴ| 天堂中文最新版在线下载| cao死你这个sao货| 69av精品久久久久久| 日本a在线网址| 天堂中文最新版在线下载| 夜夜爽天天搞| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲人成电影观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 成年人黄色毛片网站| 国产精品成人在线| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美色视频一区免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| www.www免费av| a在线观看视频网站| 99香蕉大伊视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久这里只有精品19| 美女 人体艺术 gogo| 麻豆国产av国片精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一级片'在线观看视频| 日日夜夜操网爽| 在线观看免费高清a一片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 看免费av毛片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 午夜日韩欧美国产| 国产免费男女视频| 国产视频一区二区在线看| 亚洲精品在线美女| 中文亚洲av片在线观看爽| 999精品在线视频| 18禁观看日本| 啦啦啦免费观看视频1| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲男人天堂网一区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人精品在线电影| 免费在线观看完整版高清| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲自拍偷在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| a级毛片在线看网站| 久久精品成人免费网站| 又大又爽又粗| cao死你这个sao货| 中文欧美无线码| 欧美日韩福利视频一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 国产精品久久久久成人av| 国产亚洲av高清不卡| av天堂在线播放| 宅男免费午夜| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产黄a三级三级三级人| 国产成人精品在线电影| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久性视频一级片| 免费不卡黄色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 91在线观看av| 亚洲色图av天堂| 涩涩av久久男人的天堂| 两个人免费观看高清视频| 成人免费观看视频高清| av网站免费在线观看视频| aaaaa片日本免费| 久久影院123| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲一区中文字幕在线| 女同久久另类99精品国产91| 精品人妻1区二区| 日韩精品青青久久久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久国产成人精品二区 | 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲av电影在线进入| 露出奶头的视频| 露出奶头的视频| 51午夜福利影视在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 97碰自拍视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 免费高清在线观看日韩| av天堂在线播放| 18禁观看日本| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久久久久,| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲av熟女| 久久久久国内视频| 日韩有码中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜日韩欧美国产| 不卡av一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲国产精品999在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| www.999成人在线观看| 美女高潮到喷水免费观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 后天国语完整版免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 免费在线观看日本一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人18禁在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 两个人看的免费小视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 免费在线观看影片大全网站| 精品国产亚洲在线| 亚洲 国产 在线| 亚洲国产精品999在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜福利,免费看| 午夜免费观看网址| 亚洲性夜色夜夜综合| 99在线人妻在线中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 久久亚洲真实| 久久99一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久精品亚洲av国产电影网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成年人黄色毛片网站| 麻豆国产av国片精品| 大码成人一级视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av片天天在线观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲国产精品sss在线观看 | 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲国产看品久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 久久久久久大精品| 老鸭窝网址在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久九九热精品免费| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品熟女少妇八av免费久了| 一区在线观看完整版| 国产精品亚洲av一区麻豆| 多毛熟女@视频| 91在线观看av| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩精品青青久久久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲七黄色美女视频| 免费看十八禁软件| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品第一国产精品| 国产单亲对白刺激| 黑人猛操日本美女一级片| 黄片播放在线免费| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲情色 制服丝袜| 日本vs欧美在线观看视频| 两人在一起打扑克的视频| 两性夫妻黄色片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 精品午夜福利视频在线观看一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 女人精品久久久久毛片| 精品第一国产精品| av国产精品久久久久影院| 日韩国内少妇激情av| 三上悠亚av全集在线观看| 国产又爽黄色视频| 黄色视频,在线免费观看| 国产一区二区激情短视频| 日本免费a在线| 香蕉国产在线看| 久久草成人影院| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 老汉色∧v一级毛片| 久久人人精品亚洲av| 男女下面进入的视频免费午夜 | 黄色怎么调成土黄色| 看片在线看免费视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久草成人影院| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩国内少妇激情av| 亚洲伊人色综图| 五月开心婷婷网| 一区在线观看完整版| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美性长视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 成人三级黄色视频| 久久中文字幕人妻熟女| 热99re8久久精品国产| 精品久久久久久久久久免费视频 | 咕卡用的链子| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 午夜91福利影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 99精品欧美一区二区三区四区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本免费a在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲伊人色综图| 在线视频色国产色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男女午夜视频在线观看| av欧美777| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品一区二区在线不卡| 午夜日韩欧美国产| 一区二区三区激情视频| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美日韩乱码在线| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 最近最新中文字幕大全电影3 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产野战对白在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久这里只有精品19| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲视频免费观看视频| 国产黄色免费在线视频| 在线av久久热| 人人澡人人妻人| 一进一出抽搐gif免费好疼 | av在线播放免费不卡| 亚洲第一青青草原| 中国美女看黄片| 久久九九热精品免费| 91麻豆av在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看舔阴道视频| a级毛片黄视频| 国产一区二区三区视频了| 美女高潮到喷水免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品永久免费网站| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲国产精品sss在线观看 | 99久久99久久久精品蜜桃| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲激情在线av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 日韩人妻精品一区2区三区| 久99久视频精品免费| 国产精品偷伦视频观看了| 黄频高清免费视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| av中文乱码字幕在线| 天堂中文最新版在线下载| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲免费av在线视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 超碰成人久久| 午夜老司机福利片| www.www免费av| 国产xxxxx性猛交| 亚洲av成人av| 欧美日韩一级在线毛片| 一级毛片女人18水好多| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 在线观看免费高清a一片| 999久久久精品免费观看国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 99香蕉大伊视频| 一级毛片女人18水好多| 精品电影一区二区在线| 99国产综合亚洲精品| 欧美中文日本在线观看视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久精品成人免费网站| 国产高清videossex| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美在线二视频| 久热爱精品视频在线9| 精品人妻在线不人妻| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产激情久久老熟女| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲欧美激情在线| 深夜精品福利| 日韩有码中文字幕| 99国产精品一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 午夜两性在线视频| www.自偷自拍.com| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 热99re8久久精品国产| 看片在线看免费视频| 波多野结衣av一区二区av| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成a人片在线一区二区| 一本综合久久免费| 老司机靠b影院| 啦啦啦 在线观看视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91成人精品电影| 久久亚洲真实| 窝窝影院91人妻| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲专区国产一区二区| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲人成电影免费在线| 国产99白浆流出| 超色免费av| 一区二区三区国产精品乱码| 黄色 视频免费看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜成年电影在线免费观看| 不卡一级毛片| 日本欧美视频一区| a在线观看视频网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 日本欧美视频一区| 国产亚洲精品久久久久5区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲成人久久性| 国产av精品麻豆| 欧美一级毛片孕妇| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品国产av在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲色图av天堂| 欧美午夜高清在线| 久99久视频精品免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜精品在线福利| 丁香六月欧美| 精品一区二区三卡| 两性夫妻黄色片| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产91精品成人一区二区三区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久亚洲精品不卡| 免费av中文字幕在线| 免费av毛片视频| 国产精品一区二区在线不卡| 久久精品国产清高在天天线| av天堂久久9| 18禁国产床啪视频网站| av天堂久久9| 亚洲男人天堂网一区| 精品久久久久久久久久免费视频 | 国产黄色免费在线视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费看十八禁软件| 亚洲精品在线美女| 国产欧美日韩一区二区精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 五月开心婷婷网| 亚洲人成电影观看| 在线国产一区二区在线| 久久精品国产清高在天天线| 久9热在线精品视频| 咕卡用的链子| 一区二区日韩欧美中文字幕| 操出白浆在线播放| www日本在线高清视频| 色在线成人网| 麻豆av在线久日| 精品高清国产在线一区| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久久久午夜电影 | 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 这个男人来自地球电影免费观看| 9色porny在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费看十八禁软件| 亚洲精品av麻豆狂野| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产有黄有色有爽视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 18禁观看日本| 嫩草影院精品99| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本五十路高清| 丝袜人妻中文字幕| 真人做人爱边吃奶动态| 18禁国产床啪视频网站| 校园春色视频在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 欧美午夜高清在线| 久久久国产成人精品二区 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产又爽黄色视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 露出奶头的视频| 国产高清国产精品国产三级| 午夜两性在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 |