柳生金針菇發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化及菌絲體多糖提取工藝

彭 璐 楊健華 王 巍 王 琦

（吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，吉林長春130118）

柳生金針菇（Flammulina rossica）隸屬擔子菌門、傘菌綱、傘菌目、金針菇屬，是一種食用菌[1]，首次發(fā)現在俄羅斯東部[2]。研究組利用形態(tài)和分子系統發(fā)育方法，對世界上現知的冬菇屬種類進行了研究，發(fā)現我國有4種，柳生金針菇為我國的新記錄種[3]。朱宴妍等研究發(fā)現，柳生金針菇胞外粗多糖具有免疫及抗腫瘤活性，其胞外多糖對肝癌小鼠的免疫網絡有廣泛的影響，但發(fā)揮藥理作用的機制尚不明確[4]。筆者對柳生金針菇深層發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化及對菌絲體多糖提取工藝進行研究，以期篩選出能提高柳生金針菇多糖產量的液體培養(yǎng)條件，為柳生金針菇深層發(fā)酵的進一步研究提供實驗數據，同時也為后續(xù)研究菌絲體多糖結構及其生物活性提供充足的原料基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株柳生金針菇菌株：分離于采自四川省稻城縣香格里拉鄉(xiāng)亞丁村（地理坐標：100°16′E，28°13′N）的柳生金針菇子實體（編號：T23093）。菌種保藏于食藥用菌教育部工程研究中心菌種庫。

1.2 培養(yǎng)基（1）平板培養(yǎng)基（PDA綜合培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB10.1 g、瓊脂 20 g，水 1 L，pH 自然[5]。（2）液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸粉2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB110 mg、水1 L，pH自然[6]。（3）液體培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g，蛋白胨 2 g，酵母浸粉 2 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB110 mg，水1 L，pH自然[7，8]。

1.3 試驗方法

1.3.1 柳生金針菇菌種ITS鑒定 采用CTAB法提取柳生金針菇菌絲rDNA并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測同時對所提取的DNA進行PCR擴增，引物序列為ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和ITS4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）。PCR采用50 μL擴增體系，反應條件為：94℃預變性10 min；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s；72℃延伸2 min，共計30個循環(huán)，72℃溫浴10 min。

1.3.2 制備母種 將在4℃條件下保存的柳生金針菇菌種取出，放于24℃恒溫培養(yǎng)箱中活化一天。然后制備PDA培養(yǎng)基，取一小塊活化后的菌種，于無菌條件下接種于該PDA培養(yǎng)基上，后將其放在24℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，選擇菌絲潔白、生長速度快的菌種作為母種。

1.3.3 液體菌種培養(yǎng) 將已活化好的柳生金針菇菌種（0.5 cm大小2塊）在無菌條件下接入100 mL液體種子培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶），23℃、150 r/min搖床培養(yǎng)5～7 d，制得一級種子液。

1.3.4 液體發(fā)酵條件篩選

1.3.4.1 裝液量篩選 配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入250 mL三角瓶，裝液量分別為60 mL、90 mL、120 mL、150 mL、180 mL，121℃高壓滅菌25 min，滅菌后于無菌室無菌操作臺接種10%液體柳生金針菇菌種，23℃、150 r/min恒溫搖床震蕩培養(yǎng)，設三次重復。一周后測定菌絲體干重，發(fā)酵液多糖含量，篩選最適裝液量。

1.3.4.2 接種量篩選 接種量分別為5%、10%、15%、20%和25%。培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適接種量。

1.3.4.3 最適溫度篩選 培養(yǎng)溫度分別設置為17℃、20℃、23℃、26℃和29℃。培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適溫度。

1.3.4.4 搖床轉速篩選 搖床轉速分別設置為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min和180 r/min，培養(yǎng)方法等同1.3.4.1，篩選最適轉速。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化 選擇裝液量、接種量、最適溫度、搖床轉速4個因素，進行正交試驗，每個因素三個水平，測定菌絲體干重及發(fā)酵液多糖產量，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件。正交試驗設計L9（34）見表1。

表1 正交試驗因素及水平

1.3.6 熱水浸提法提取多糖工藝 選取對菌絲體多糖提取有較大影響的3個因素，即浸提時間、液料比和浸提溫度，每個因素各取3個水平，設計正交試驗[8]，以菌絲體多糖提取率為指標，確定菌絲體多糖提取的最佳工藝，試驗設計L9（33）見表2。提取工藝：將抽濾得到的菌絲體用蒸餾水洗滌至洗滌液無色，放置45℃烘箱中恒溫干燥，準確稱取1.0000 g烘干菌絲體，研磨成粉末，按照表1試驗設計，提取菌絲體多糖。每組提取3次，合并提取液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮，用4倍體積無水乙醇4℃冰箱沉淀過夜，3500 r/min離心，分離收集沉淀，乙醇液回收再利用，沉淀于-80℃冷凍過夜，真空冷凍干燥機干燥，稱重，溶解粗多糖，棄沉淀，再次醇沉過夜，收集沉淀，-80℃預冷過夜，真空冷凍干燥，稱重并計算提取率。

表2 熱水浸提法L9（33）正交試驗因素及水平

提取率（%）=（菌絲體粗多糖總量/菌絲體干重）×100

2 結果與分析

2.1 柳生金針菇序列分析試驗以ITS1和ITS4為引物，對柳生金針菇rDNA進行PCR擴增，將測定結果應用BLAST程序與GenBank數據庫中的已有序列進行同源相似性比較，結果表明：與KF179735.1的同源相似性達到98%，表明試驗所用的柳生金針菇與GenBank數據庫中的柳生金針菇為同種。

2.2 液體發(fā)酵條件篩選

2.2.1 裝液量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 食用菌在液體發(fā)酵過程中需要一定的氧氣供應，裝液量的多少直接影響培養(yǎng)瓶內氧氣含量，其他培養(yǎng)條件一致的情況下，裝液量越多，瓶內氧氣越少，溶氧量大小直接影響菌絲體生物量及多糖產量。由圖1看出在裝液量為120 mL/250 mL時柳生金針菇菌絲體干重，多糖含量均達到最大值。因此，確定柳生金針菇液體發(fā)酵搖瓶實驗裝液量為120 mL/250 mL。

2.2.2 不同接種量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 液體培養(yǎng)過程中，接種量的多少對菌種培養(yǎng)周期的長短、生物量的多少直接影響，接種量過多，發(fā)酵液營養(yǎng)不夠用，菌絲體有效多糖積累量少；接種量過少，菌絲體生物量少，培養(yǎng)周期長。由圖2看出接種量為10%～15%時，柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖均達到最大值。接種量超過15%，菌絲體生長受到抑制，多糖產量不會增加，污染幾率大。

2.2.3 不同培養(yǎng)溫度對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 培養(yǎng)溫度過高或過低都會導致菌絲體生長緩慢，甚至停止生長，而且溫度高易染細菌。由圖3看出，柳生金針菇菌絲最適生長溫度為23℃。此溫度下，菌絲體干重及發(fā)酵液多糖含量均達到最大值，分別為0.39 g/100 mL和0.55 g/100 mL。溫度為26℃，柳生金針菇菌絲體在培養(yǎng)液中的呼吸作用加快，分解速率大于合成速率，菌絲體處于過度消耗狀態(tài)。溫度達到29℃時，菌絲體生長緩慢，菌絲球表面發(fā)黃，色澤暗淡，活力衰退，各種代謝活動不能正常進行。

2.2.4 搖床轉速對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響 搖床轉速影響培養(yǎng)瓶與外界通氣量的大小，進而影響發(fā)酵液溶氧量的多少；搖床轉速不同，菌絲球的大小也不同，進而菌絲體生物量也不同。由圖4得出，菌絲體及發(fā)酵液多糖都呈現先增加后減少的趨勢，當搖床轉速為140 r/min時，發(fā)酵液多糖及菌絲體生物量達到0.59 g/100 mL和0.37 g/100 mL，為最大值。轉速過低，菌絲球相對較大，但生長速度出現先快后慢的趨勢；轉速過高，菌絲球相對較小，生長速度慢，搖瓶內出現氣泡，影響菌絲體換氣。

圖1 裝液量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖2 接種量對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對柳生金針菇菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

圖4 搖床轉速對菌絲體干重及發(fā)酵液多糖的影響

2.2.5 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件 根據單因素試驗結果，選取影響因子合適區(qū)間值進行正交試驗，正交試驗結果分析見表3。由表3可以分析出4個因素對柳生金針菇菌絲體干重的影響程度由大到小為：A（裝液量）＞B（接種量）＞D（搖床轉速）＞C（培養(yǎng)溫度），對柳生金針菇發(fā)酵液多糖產量的影響程度由大到小為：B（接種量）＞D（搖床轉速）＞C（培養(yǎng)溫度）＞A（裝液量）；由表3可以看出積累菌絲體生物量最多的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，即裝液量120 mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度23℃，150 r/min；獲得發(fā)酵液多糖產量最多的最優(yōu)組合為A2B1C2D3，綜合菌絲生物量及多糖產量兩個指標，最終確定柳生金針菇發(fā)酵培養(yǎng)的最佳組合為：A2B1C2D3，此條件下菌絲體干重及發(fā)酵液多糖產量均能得最大值。

表3 正交試驗L9（34）結果極差分析

2.3 熱水浸提法最佳工藝確定由表4看出，B（液料比）是影響柳生金針菇菌絲體多糖提取率3個因素中最主要的因素，其他依次為浸提溫度（C）和浸提時間（A）。熱水浸提的最佳提取工藝為A1B2C2，即浸提時間2 h，液料比50∶1，浸提溫度90℃，此條件下多糖的提取率為74.39%。

表4 正交試驗L9（33）結果極差分析

3 小結與討論

食用真菌多糖是國際公認的天然免疫增強劑，它可參與細胞識別、抗原呈遞、調節(jié)機體免疫應答及新陳代謝等，真菌多糖通常與TLRs協同激活機體細胞，經過多條通路啟動機體細胞的吞噬活性、ROS的產生及細胞因子的合成釋放[10-13]。其中金針菇多糖主要作用于腹腔滲出細胞膜上的TLR4，從而激活P38MAPK信號通路，活化轉錄因子NF-κβ，后者啟動TNF-α基因轉錄，最終導致TNF-α的合成與分泌增加。金針菇具有增智菇的說法，鄒宇曉等得出金針菇多糖可有效改善氫溴酸東莨菪堿誘導的記憶障礙模型小鼠、大鼠的學習記憶能力，并且治療效果優(yōu)于腦復興[14]。金針菇發(fā)酵液還具有抗衰老的作用，研究發(fā)現金針菇發(fā)酵液能夠極顯著降低腦中MAO-B的活性，對肝MAO-B活性無顯著影響，能使肝中LPO含量降低，血中SOD活性增加，皮膚中Hyp（Hydroxyproline）含量上升，表明其具有提高機體內膠原蛋白的作用[15，16]。作為新紀錄菌種，朱宴妍等研究發(fā)現，柳生金針菇多糖對肝癌H-22細胞有針對性抑制的同時，對機體也具有調高免疫和調解平衡的作用[4]。因此，為進一步探討柳生金針菇發(fā)揮生物活性的作用機制，開發(fā)以柳生金針菇多糖為原料的醫(yī)藥產品及功能食品，大量培育柳生金針菇成為了重中之重。

為適應市場發(fā)展，獲得高產菌株及代謝產物，發(fā)酵工程技術應運而生，其培育時間短，產量高，受外界影響少，故能大批量生產其活性成分，有利于菌物醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。根據不同菌種適應生長條件不同，應進行培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化，選取最佳提取工藝路線。

試驗對柳生金針菇進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，篩選最佳多糖提取工藝，為高效、快速開發(fā)柳生金針菇相關產品提供理論依據及技術支持。試驗篩選出柳生金針菇液體發(fā)酵最適培養(yǎng)條件為：裝液量120 mL/250 mL，接種量10%，培養(yǎng)溫度23℃，搖床轉速150 r/min。多糖產量往往受到提取方法及條件不同的影響，目前多糖的提取方法包括熱水提法、稀酸稀堿提取法以及微波、酶、膜處理、超聲波等輔助提取法。試驗采用傳統的熱水浸提法優(yōu)化多糖提取工藝，避免了稀堿或稀酸浸提法等對多糖糖苷鍵的破壞，從而造成多糖的損失，另外，由于柳生金針菇菌絲體及發(fā)酵液中均含有較多不溶性多糖，故采取多糖復溶措施，兩次醇沉干燥，提高可溶性多糖提取率，為后續(xù)藥理實驗的準確性奠定基礎。試驗得到的柳生金針菇菌絲體多糖最佳提取工藝為：浸提時間2 h，液料比50∶1，浸提溫度90℃，兩次醇沉，此條件下多糖提取率為74.39%。