右美托咪定通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抗膿毒癥大鼠肺損傷的實驗研究

張建峰 劉濤 曹波 李明強 吳樹寧 周立文 葉習紅

右美托咪定通過調(diào)控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抗膿毒癥大鼠肺損傷的實驗研究

張建峰 劉濤 曹波 李明強 吳樹寧 周立文 葉習紅

目的探討右美托咪定對膿毒癥致肺損傷大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用。方法選取30只Wistar大鼠隨機分為對照組(假手術(shù))、模型組(盲腸結(jié)扎穿孔)、右美托咪定組(盲腸結(jié)扎穿孔+右美托咪定處理)，每組10只。右美托咪定組于術(shù)前30min腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，對照組和模型組腹腔注射生理鹽水。造模后24h處死大鼠。蘇木精-伊紅染色法評估肺組織病理學變化；ELISA法檢測肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性；計算肺組織濕干重比(W/D)；western blot法檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達。結(jié)果與對照組相比較，模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織MPO、肺損傷評分及肺組織W/D顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。與對照組相比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組(P<0.05)。結(jié)論右美托咪定可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路，減輕炎癥反應，從而發(fā)揮對膿毒癥肺損傷的保護作用。

右美托咪定；膿毒癥；肺損傷；HMGB1；TLR4

膿毒癥是指由感染誘發(fā)的全身炎癥反應綜合征，常伴有多臟器功能障礙[1]。在膿毒癥并發(fā)的多器官損傷中，肺損傷出現(xiàn)最早，也最為常見，是導致膿毒癥患者預后不良的主要因素[2]。右美托咪定屬于高效α2腎上腺素能受體激動劑。既往研究證實，右美托咪定可通過抑制機體炎癥級聯(lián)反應，發(fā)揮對膿毒癥肺損傷的保護作用，但其分子機制尚未明確[3]。肺損傷的發(fā)生發(fā)展與高遷移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)活化密切相關(guān)，后者可通過激活下游Toll樣受體4(Toll like receptor 4, TLR4)/核因子κB(nuclear factor kappaB, NF-κB)信號通路致炎癥介質(zhì)過度釋放，進而導致組織損傷[4]。右美托咪定是否通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制膿毒癥所致的炎癥級聯(lián)反應，進而抗膿毒癥肺損傷尚未可知。本研究擬采用盲腸結(jié)扎穿孔法誘導的膿毒癥大鼠為模型，探討右美托咪定對膿毒癥肺損傷的保護作用，并分析右美托咪定對HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用，揭示右美托咪定抗膿毒癥肺損傷的分子機制，以期為膿毒癥肺損傷的臨床防治提供新思路。

資料與方法

一、實驗動物及試劑

SPF級Wistar大鼠，雄性，15周齡，200-250g，共30只，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。ECL化學發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于南京建成生物有限公司；HMGB1、TLR4、NF-κB抗體購于大連Santa cruz公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購于武漢博士德生物有限公司。

二、模型建立與分組處理

所有大鼠應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為對照組、模型組及右美托咪定組，每組10例。模型組及右美托咪定組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔法建立膿毒癥模型：術(shù)前禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，沿腹正中線做1cm長切口，游離盲腸及腸系膜，用4-0絲線對盲腸進行環(huán)形結(jié)扎，在盲腸結(jié)扎端用18號針頭進行貫通穿刺，之后還納腸段，常規(guī)縫合腹膜、皮膚。對照組僅常規(guī)開腹。右美托咪定組于術(shù)前30min給予腹腔注射40μg/kg 右美托咪定，模型組和對照組于相同時間點注射等量生理鹽水。

三、標本取材

造模后24h處死大鼠，之后沿胸骨正中線剪開胸骨，暴露肺臟，結(jié)扎并剪取右側(cè)肺臟，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

四、肺組織病理學觀察

4%多聚甲醛固定肺組織24h，然后常規(guī)行組織石蠟包埋、切片及蘇木精-伊紅染色。光鏡下依據(jù)肺泡內(nèi)細胞浸潤、肺泡出血、肺泡間隔水腫及肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積4個方面情況進行肺損傷病理學評價，每只大鼠取4張切片，每張切片觀察6個不同視野，分別記錄病理學評分，最后取平均值。

五、髓過氧化物酶(MPO)活性

準確稱取肺組織，用0℃生理鹽水制備5%肺組織勻漿，肺組織勻漿37℃水浴15min，按ELISA試劑盒說明書進行實驗操作，測量樣本490nm處OD值，根據(jù)OD值換算MPO活性。

六、肺組織濕干重比(W/D)測定

取出大鼠右肺后，立即用濾紙拭干肺組織表面水分、血液，用天平所稱得其質(zhì)量為濕重，之后將肺組織放入80℃烤箱烘烤48 h，再次用天平所稱得其質(zhì)量為干重，計算濕干重比(W/D)。

七、HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白測定

采用western blot法檢測肺組織中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達。將肺組織、裂解液混合物置于勻漿器中，充分研磨后得到組織勻漿，冰上裂解30min后，離心10min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品蛋白濃度，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育，加入一抗(HMGB1、TLR4、NF-κB、β-actin)(1:2000)，4℃孵育過夜，TBS緩沖液洗滌3次，加入相應二抗(1:500)，室溫孵育2h，常規(guī)顯影，并進行定量分析。

八、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、肺組織損傷程度

對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性細胞滲出；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞滲出，肺間質(zhì)彌漫性出血；右美托咪定組大鼠肺組織炎癥細胞滲出及出血程度較模型組明顯減輕(見圖1)。

圖1 三組大鼠肺組織病理切片(蘇木精-伊紅染色，×100)

二、肺損傷指標

與對照組相比較，模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織MPO、肺損傷評分及肺組織W/D顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組，P<0.05，(見表1)。

表1 三組大鼠各項肺損傷指標比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

三、肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達

與對照組相比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)；與模型組相比較，右美托咪定組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，但仍高于對照組，P<0.05，(見表2、圖2)。

圖2 三組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達

表2 三組大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

討 論

膿毒癥常并發(fā)多器官功能障礙綜合征(Mutiple organ disfunction syndrome, MODS)，而肺臟則往往是受累的首位靶器官[5]。在膿毒癥病程早期就可出現(xiàn)急性肺損傷，之后隨著病情進展，肺纖維化程度日益加重，最終導致呼吸衰竭、死亡[6-7]。據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥危重患者肺損傷發(fā)生率為70%，死亡率為40%，已成為致膿毒癥患者死亡的首位原因[8]。因此，防治膿毒癥肺損傷是改善臨床預后的關(guān)鍵。

膿毒癥所致肺損傷與HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路激活密切相關(guān)。正常生理狀態(tài)下， HMGB1存在于核內(nèi)，穩(wěn)定核染色體和調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄、翻譯[9]；但膿毒癥時，在早期炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素的刺激下，單核/巨噬細胞通過出胞作用將HMGB1大量釋放到胞外，之后HMGB1與其內(nèi)源性配體TLR4在胞外結(jié)合，激活MyD88依賴性途徑，使NF-κB結(jié)構(gòu)中的IκB磷酸化，實現(xiàn)NF-κB活化，實現(xiàn)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路激活，從而誘導白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎癥介質(zhì)大量分泌，導致毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷，造成肺組織結(jié)構(gòu)和功能破壞[4]。此外，IL-6、TNF-α等促炎因子又可反過來促進HMGB1分泌，正反饋瀑布式擴大炎癥級聯(lián)反應，進一步加劇肺組織損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎術(shù)后模型組大鼠肺組織MPO、肺損傷評分及肺組織W/D顯著增高(P<0.05)，提示盲腸結(jié)扎誘發(fā)了大鼠肺組織炎性反應，導致急性肺損傷；以此同時，模型組肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達顯著增高(P<0.05)，HMGB1、TLR4及NF-κB表達與肺組織損傷程度存在某種正相關(guān)性，提示HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路激活在膿毒癥肺損傷中發(fā)揮重要作用。

右美托咪定屬于新型α2腎上腺素能受體(α2-AR)激動劑，其可通過與α1及α2腎上腺素能受體選擇性結(jié)合，發(fā)揮抑制交感神經(jīng)及刺激迷走神經(jīng)的雙重作用，并兼具鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及抗炎等功效[11]。動物研究證實，右美托咪定具有多器官保護作用，而其抗膿毒癥肺損傷作用，可能與抑制HMGB1、IL-6等炎癥介質(zhì)分泌有關(guān)，但其分子機制尚未完全明確[3，12-13]。本研究結(jié)果顯示，采用右美托咪定進行預處理，膿毒癥大鼠肺組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達顯著減少，同時肺組織結(jié)構(gòu)和功能得到明顯改善，提示右美托咪定可能是通過激活HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抗膿毒癥肺損傷。

綜上所述，右美托咪定可抑制膿毒癥所致的HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路激活，減輕炎癥反應，從而發(fā)揮對膿毒癥肺損傷的保護作用。但右美托咪定是否還可通過調(diào)控其他信號通路影響膿毒癥致肺損傷，仍有待進一步研究證實。

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Studyofdexmedetomidineagainstratsepsis-inducedlunginjurybyregulatingHMGB1/TLR4/NF-κBsignalingpath

ZHANGJian-feng,LIUTao,CAOBo,LIMing-qiang,WUShu-ning,ZHOULi-wen,YEXi-hong

XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441021,China

ObjectiveTo evaluate the effect of dexmedetomidine against rat sepsis-induced lung injury by regulating HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway.Methods30 Wistar rats were randomly divided into the control group (sham-operation), the model group (cecal ligation and puncture) and the dexmedetomidine group (cecal ligation and puncture+dexmedetomidine treatment), 10 rats in each group. 30min before operation, the dexmedetomidine group was intraperitoneal?injected with 40μg/kg dexmedetomidine, and the control group and model group were intraperitoneal?injected with normal saline. 24 hours after modeling, pulmonary pathological changes were detected by hematoxylin-eosin staining. The myeloperoxidase (MPO) activity of lung tissue were detected by ELISA method. The wet and dry weight ratio (W/D) of lung tissue was detected. The protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB in lung tissue were detected by Western blot.ResultsCompared with the control group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the MPO, lung injury score and lung tissue W/D decreased obviously in the dexmedetomidine group (P<0.05), but they were still higher than those in the control group. Compared with the control group, the MPO, protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB increased significantly in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the protein expression of HMGB1, TLR4 and NF-κB of the dexmedetomidine group significantly decreased (P<0.05), but still higher than those in the control group.ConclusionDexmedetomidine can inhibit HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathways, reduce inflammation, playing a role of protection for sepsis-induce lung injury.

dexmedetomidine; sepsis; lung injury; HMGB1; TLR4

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.005

湖北省自然科學基金面上項目(No 2014CFC1076)

441021 湖北 襄陽，襄陽市中心醫(yī)院麻醉科，湖北文理學院附屬醫(yī)院麻醉科

劉濤，E-mail:liutao558558@163.com

2017-02-28]