• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的比較分析

    2017-10-19 06:40:37葉偉南莫榮新李少芳
    臨床肺科雜志 2017年10期
    關(guān)鍵詞:檢測方法

    葉偉南 莫榮新 李少芳

    ·檢驗·

    三種方法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的比較分析

    葉偉南1莫榮新2李少芳3

    目的初步研究恒溫擴增法(Isothermal amplification) 、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法在診斷結(jié)核分枝桿菌(Mtuberculosis,Mtb)復(fù)合群的臨床驗證和應(yīng)用,評估這三種方法檢測Mtb復(fù)合群的效能。方法選取肇慶市8縣區(qū)的結(jié)核病防治機構(gòu)2015年1月-2016年8月1496份痰標本,取587例痰培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物,同時進行恒溫擴增法、LAMP、改良羅氏培養(yǎng)法檢測Mtb復(fù)合群。結(jié)果羅氏培養(yǎng)法Mtb復(fù)合群陽性587例,陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%),以此作金標準。恒溫擴增法檢測Mtb復(fù)合群陽性570例,陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),其靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%),陽性預(yù)期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%),陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%);LAMP檢測Mtb復(fù)合群陽性578例,陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%),陽性預(yù)期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%),陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。結(jié)論改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法診斷Mtb復(fù)合群具有高度的準確度和特異性,恒溫擴增法和LAMP具有等同效能,而LAMP實操比更優(yōu),更適合基層結(jié)核病實驗室應(yīng)用。

    資料與方法

    一、資料

    1 液體培養(yǎng)菌株:收集2015年1月-2016年8月在結(jié)核病防治機構(gòu)就診的肺結(jié)核或疑似肺結(jié)核患者1496份痰標本, 取BBL MGIT 960培養(yǎng)陽性的587例菌株,其中肇慶市結(jié)核病防治所237例、各縣區(qū)慢病站:高新區(qū)4例、高要105例、四會41例、廣寧117例、懷集46例、德慶25例、封開12例。

    2 儀器與試劑:羅氏培養(yǎng)基(培養(yǎng)和鑒定管)廣東省結(jié)核病防治研究所提供,BBL MGIT 7mL Tubes由美國Becton Dickinson and Company提供,Mtb復(fù)合群核酸檢測試劑盒(恒溫擴增法),PCR熒光檢測儀由廣州迪澳生物科技有限公司提供。Mtb復(fù)合群核酸檢測試劑盒(LAMP),由廣州華鋒生物科技有限公司提供。

    二、方法

    1 羅氏培養(yǎng)法:在磨菌瓶加入 1-2 滴10% 吐溫 -80 ,無菌吸管尖端刮取新鮮菌落置于瓶中。旋緊瓶蓋振蕩器混旋 0.5-1分鐘。加入少許滅菌的PBS。將懸濁液轉(zhuǎn)移至比濁管中,加PBS 使其濁度與標準麥氏比濁管( MacFarland No.1 )一致。無菌操作逐步稀釋至10-2mg/mL。22 SWG 標準接種環(huán)分別沾1環(huán)菌液,均勻接種至接種到硝基苯甲酸 ( PNB )及噻吩-2-羧酸肼( TCH )鑒定培養(yǎng)基,于36 ±1℃培養(yǎng)至四周觀察記錄結(jié)果,將TCH培養(yǎng)基上生長判定是NTM;PNB培養(yǎng)基上不生長判定是Mtb復(fù)合群。

    2 恒溫擴增法:Mtb核酸檢測 (恒溫擴增法)按照試劑盒說明書操作,將培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物1mL加入100μ離心去上清液,加1mL 生理鹽水離心去上清液,加100μDNA提取液,100℃下加熱10min,離心后提取2μL上清液到PCR管中混勻擴增,PCR熒光檢測儀擴增檢測。利用擴增曲線來判斷結(jié)果,呈S型為陽性(含結(jié)核分枝桿菌),無S型則為陰性。每輪設(shè)陰陽性對照管。

    3 LAMP:Mtb復(fù)合群核酸檢測 (環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法)按照試劑盒說明書操作,將培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物1mL離心去上清液,加入100μDNA裂解液,100℃下裂解10min,離心后提取2.5μL到HF反應(yīng)管中,65℃反應(yīng)60min,顛倒混勻數(shù)次后肉眼觀察顏色變化判斷結(jié)果,陽性綠色,陰性橙色。每輪設(shè)陰陽性對照管。

    三、統(tǒng)計學方法

    采用Microsoft Excel2007軟件統(tǒng)計,SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件,三種方法比較采用四格表卡方檢驗,計數(shù)資料采用百分率及其95%CI表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    一、羅氏培養(yǎng)法與恒溫擴增法對比

    羅氏培養(yǎng)法Mtb復(fù)合群陽性587例,陽性率39.2%(95%CI: 36.7%-41.7%),以羅氏培養(yǎng)法作為金標準,恒溫擴增法陽性570例,陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特異度97.4%(95%CI: 96.2%-98.4%),陽性預(yù)期值95.9%(95%CI: 94.0%-97.4%),陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%)。兩種方法結(jié)果比較,Kappa=0.91高于0.8,代表檢測效果完全一致,(見表1)。

    表1 羅氏培養(yǎng)法與恒溫擴增法的一致性對比

    注: Kappa=0.91 ,P=0.011 ,Z=35.26

    二、羅氏培養(yǎng)法與LAMP對比

    以羅氏培養(yǎng)法作為金標準,LAMP法陽性578例,陽性率38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),靈敏度93.1%(95%CI: 90.8%-95.1%),特異度96.5%(95%CI: 95.2%-97.7%),陽性預(yù)期值94.6%(95%CI: 92.5%-96.3%),陰性預(yù)期值95.6%(95%CI: 94.1%-96.9%),兩種方法結(jié)果比較, Kappa=0.90 高于0.8,說明兩種方法具有同等效能,(見表2) 。

    表2 羅氏培養(yǎng)法與LAMP的一致性對比

    注: Kappa=0.90,P=0.012 ,Z=34.82

    三、恒溫擴增法與LAMP

    兩種方法一致性比較, Kappa=0.97 高于0.8,代表兩種方法檢測結(jié)果完全一致,(見表3 ) 。

    表3 恒溫擴增法與LAMP的一致性對比

    注: Kappa=0.97 ,P=0.006,Z=37.69

    討 論

    羅氏培養(yǎng)法,是鑒定Mtb復(fù)合群的傳統(tǒng)方法,也是金標準,因其操作簡單,經(jīng)濟,推廣易,已在臨床廣泛應(yīng)用[2-3]。原理是PNB在一定的濃度下(500μg)選擇性抑制Mtb復(fù)合群生長,而不抑制NTM生長,達到Mtb復(fù)合群確認。該方法特異性和靈敏度較高,但檢測期長(4周),不利于結(jié)核病早診療的原則。

    目前國內(nèi)外已應(yīng)用PCR技術(shù)檢測Mtb復(fù)合群[4-5],LAMP 法是日本學者 Notomi 在 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的一種新的基因檢測手段。恒溫擴增法和LAMP的檢測原理基本相同,引物均采用基因IS6110作為Mtb復(fù)合群檢測靶標序列。Bst聚合酶及特異性引物在恒溫條件下對Mtb DNA片段進行特異性擴增,測定其生成的產(chǎn)物來判斷結(jié)果。新興LAMP近年已在結(jié)核病防治方面得到廣泛應(yīng)用和研究[6-7]。

    恒溫擴增法和LAMP,在Mtb復(fù)合群診斷時,均具有靈敏度高,假陰性低,避免非特異性或污染造成的假陽性,(見表1、表2)。二種方法能顯著縮短診斷時間,3小時可得結(jié)果,操作上均需加溫、離心、擴增幾個步驟。由表1和表2得出,兩種方法在特異度、靈敏度以及診斷效能都具有完全一致性。本研究顯示,恒溫擴增法檢測Mtb復(fù)合群的陽性率38.1%(95%CI: 35.6%-40.6%),與陳濤等[8]結(jié)果基本一致, 但需在開放性的PCR管中加樣混勻,易產(chǎn)生氣溶膠造成二次污染,還需配備專業(yè)的PCR熒光檢測儀檢測擴增曲線;而LAMP陽性率為38.6%(95%CI: 36.1%-41.2%),與沈會平的結(jié)果基本相同[9],其操作時加樣到密封的HF反應(yīng)管內(nèi)擴增,過程完全在封閉的PCR管中進行,并與核酸染料SybrGreenⅠ結(jié)合,生成有色反應(yīng)物,肉眼即可判斷結(jié)果,且無需三個變控溫度擴增,儀器的需求。因此, LAMP與另二種方法相比,操作快速、方便、簡單、安全、經(jīng)濟有效,并可現(xiàn)場測定確認。進一步分析綜合陽性率為38.7%(95%CI: 37.2%-40.1%),說明本地區(qū)感染Mtb復(fù)合群較為嚴重,待加強結(jié)核病診治水平,建議各基層防治機構(gòu)(慢性病防治站) 盡快提升實驗室水平,及早應(yīng)用快速、有效的LAMP分子生物學檢測方法,為臨床治療提供有力依據(jù)。由于多種原因,筆者沒有對耐多藥的Mtb復(fù)合群專項研究,有待今后工作中完善。

    上述三種方法在診斷Mtb復(fù)合群均具有高度的準確度和特異性,具有同等效能,而LAMP實操比更優(yōu),更適合于條件落后的基層結(jié)核病實驗室推廣應(yīng)用。

    [1] 端木宏謹.21世紀結(jié)核病控制與研究工作展望[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2000,23(1):6-8.

    [2] 婁忠子,劉聰暖,賈萬忠,等.分枝桿菌分型三重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(1):8-15.

    [3] 車洋,于梅,平國華,等.耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rpsL 基因特征分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2016,26(3):311-313.

    [4] Lee HR,Kim SY,Chang HE,et al.Novel multiplex PCR using dual-primingolig onucleotides for detection and discrimination of the Mycobacterium tuberculosis complex and M.bovis BCG[J].J Clin Microbiol,2010,48(12):4612-4614.

    [5] Shah DH,Verma R,Bakshi CS,et al.A multiplex-PCR for the differentiation of Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis[J].FEMS Microbiol Lett,2002,214(1):39-43.

    [6] 包維華,劉毅,黃曙海,等.LAMP與RT-PCR法檢測痰結(jié)核分枝桿菌的效果比較[J].廣西醫(yī)學,2012,34(2):160-163.

    [7] 楊敏,王慧黨,于潞,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法檢測牛奶中結(jié)核分枝桿菌條件的優(yōu)化[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(7):1688-1693.

    [8] 陳濤,周琳,周杰,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法快速檢測結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用評估[J].中國防癆雜志2012,34(7):413-418.

    [9] 沈會平,張耀祺,楊堅,等.環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌核酸[J].臨床檢驗雜志,2011,29(5):378-380.

    10.3969/j.issn.1009-6663.2017.010.047

    肇慶市科技創(chuàng)新計劃項目(No 00189901150419047)

    1. 526020 廣東 肇慶,肇慶市結(jié)核病防治所檢驗科 2. 520061 廣東 肇慶,肇慶學院醫(yī)院檢驗科 3. 526070 廣東 肇慶,肇慶市鼎湖區(qū)人民醫(yī)院二門診部

    WHO 2015年制定戰(zhàn)略的目標,是在2015-2035年將結(jié)核病死亡率降低95%,將新發(fā)病例減少90%。而我國是全球22個高負擔國家之一,僅次于印度,位居世界第二[1], 近年仍有近50萬人感染耐多藥Mtb。目前結(jié)核病防治診斷主要依賴臨床表現(xiàn),影象學和實驗室的診斷,而Mtb復(fù)合群確診以羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法為主要的可靠手段。但Mtb生長緩慢的特性(6-8周),限制了檢出率,隨著實驗室技術(shù)不斷發(fā)展,出現(xiàn)了熒光定量PCR方法,恒溫擴增法,LAMP等分子生物學檢測方法診斷Mtb復(fù)合群。本研究通過對肇慶市結(jié)核病防治所2015年1月-2016年8月587份BBL MGIT 960培養(yǎng)陽性的培養(yǎng)物,用三種方法進行Mtb復(fù)合群檢測,對結(jié)果進行比較分析和驗證,進一步對分子生物學診斷Mtb復(fù)合群進行比較分析。

    2017-02-04]

    猜你喜歡
    檢測方法
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    學習方法
    可能是方法不對
    小波變換在PCB缺陷檢測中的應(yīng)用
    用對方法才能瘦
    Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
    四大方法 教你不再“坐以待病”!
    Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
    美女福利国产在线| 高清在线国产一区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲综合色网址| 高清av免费在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产99久久九九免费精品| 中文字幕精品免费在线观看视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 性色av一级| 一区二区日韩欧美中文字幕| 1024视频免费在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品国产av在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲免费av在线视频| 在线观看免费高清a一片| 在线观看www视频免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产成人啪精品午夜网站| 精品久久久精品久久久| 国产又爽黄色视频| 久久久久久久久久久久大奶| 男女高潮啪啪啪动态图| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 交换朋友夫妻互换小说| 成人三级做爰电影| 黄色视频,在线免费观看| 欧美日韩黄片免| 黄片大片在线免费观看| 亚洲黑人精品在线| 亚洲天堂av无毛| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产淫语在线视频| 亚洲专区中文字幕在线| 乱人伦中国视频| tube8黄色片| 考比视频在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 天天操日日干夜夜撸| 1024视频免费在线观看| 亚洲天堂av无毛| 操美女的视频在线观看| 午夜久久久在线观看| av在线播放精品| www日本在线高清视频| 12—13女人毛片做爰片一| avwww免费| 国产成人精品久久二区二区91| 男女午夜视频在线观看| 自线自在国产av| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲色图综合在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 欧美精品亚洲一区二区| 1024香蕉在线观看| av福利片在线| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 色老头精品视频在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 日本av免费视频播放| 中文字幕色久视频| 午夜91福利影院| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲国产看品久久| 国产男女超爽视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 黄色片一级片一级黄色片| 淫妇啪啪啪对白视频 | 久久久欧美国产精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久国内视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 人妻久久中文字幕网| 色视频在线一区二区三区| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人系列免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美一区二区三区黑人| av福利片在线| 国产成人啪精品午夜网站| 男男h啪啪无遮挡| 午夜两性在线视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产免费现黄频在线看| 视频在线观看一区二区三区| 国产不卡av网站在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男人爽女人下面视频在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 999久久久精品免费观看国产| 在线观看人妻少妇| 人妻一区二区av| 在线看a的网站| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产男人的电影天堂91| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产精品久久久久成人av| 欧美成人午夜精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 成年人免费黄色播放视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 丰满少妇做爰视频| 另类亚洲欧美激情| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜免费观看性视频| 国产精品偷伦视频观看了| 窝窝影院91人妻| av天堂在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄色怎么调成土黄色| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品九九99| 免费不卡黄色视频| 亚洲专区国产一区二区| 视频区欧美日本亚洲| 各种免费的搞黄视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品一品国产午夜福利视频| 69精品国产乱码久久久| 在线 av 中文字幕| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久国产亚洲av麻豆专区| 1024视频免费在线观看| 精品久久蜜臀av无| 桃红色精品国产亚洲av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 国产av又大| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美日本中文国产一区发布| 女警被强在线播放| 亚洲av片天天在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品高清国产在线一区| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 麻豆国产av国片精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品久久久av美女十八| 极品少妇高潮喷水抽搐| 1024香蕉在线观看| 久久中文字幕一级| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产精品国产三级国产专区5o| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 天天添夜夜摸| 美女主播在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品久久久精品久久久| 男人舔女人的私密视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 一级,二级,三级黄色视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 无限看片的www在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 夫妻午夜视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 日本a在线网址| 久久热在线av| 日本欧美视频一区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产老妇伦熟女老妇高清| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 中文字幕人妻熟女乱码| 欧美精品亚洲一区二区| 成在线人永久免费视频| 天堂8中文在线网| 国产野战对白在线观看| 国产色视频综合| 无限看片的www在线观看| 宅男免费午夜| 亚洲第一av免费看| 日韩人妻精品一区2区三区| xxxhd国产人妻xxx| 另类亚洲欧美激情| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久影院123| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 超色免费av| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜免费鲁丝| 狠狠狠狠99中文字幕| 男人操女人黄网站| svipshipincom国产片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 蜜桃国产av成人99| 国产91精品成人一区二区三区 | 男女免费视频国产| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 老司机深夜福利视频在线观看 | 日韩大片免费观看网站| 高清欧美精品videossex| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 叶爱在线成人免费视频播放| 桃花免费在线播放| 一本大道久久a久久精品| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 一区二区三区精品91| av电影中文网址| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品 欧美亚洲| 18禁观看日本| 又大又爽又粗| 亚洲一区中文字幕在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99国产精品99久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 各种免费的搞黄视频| 美女视频免费永久观看网站| 视频在线观看一区二区三区| a级毛片黄视频| 亚洲中文av在线| 一级毛片电影观看| 国产又爽黄色视频| 国产97色在线日韩免费| 好男人电影高清在线观看| 久久精品成人免费网站| 老司机影院成人| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 新久久久久国产一级毛片| 香蕉国产在线看| 热99国产精品久久久久久7| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机福利观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲少妇的诱惑av| 99久久国产精品久久久| 日韩一区二区三区影片| 国产伦人伦偷精品视频| 在线观看舔阴道视频| a级片在线免费高清观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美乱码精品一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 9色porny在线观看| 另类亚洲欧美激情| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩有码中文字幕| 国产成人欧美| 中文欧美无线码| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 90打野战视频偷拍视频| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 久久人人爽av亚洲精品天堂| 他把我摸到了高潮在线观看 | 五月天丁香电影| 视频区欧美日本亚洲| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄片小视频在线播放| 亚洲avbb在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 性色av一级| 久久免费观看电影| 老司机深夜福利视频在线观看 | a级毛片黄视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 99九九在线精品视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丁香六月天网| av片东京热男人的天堂| 国产精品影院久久| 精品久久久久久电影网| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美成狂野欧美在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 人妻一区二区av| 免费av中文字幕在线| 午夜影院在线不卡| 久久久久视频综合| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 91老司机精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人影院久久av| 久久青草综合色| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产在线视频一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 五月天丁香电影| 91精品三级在线观看| 成人国语在线视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产亚洲欧美在线一区二区| 大码成人一级视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| videosex国产| 国产激情久久老熟女| 成人av一区二区三区在线看 | 中文字幕最新亚洲高清| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人精品无人区| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美国产精品一级二级三级| 一区福利在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 精品视频人人做人人爽| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 久久精品亚洲av国产电影网| 秋霞在线观看毛片| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| av网站免费在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 在线观看舔阴道视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲欧美一区二区三区久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| av不卡在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产免费现黄频在线看| 91九色精品人成在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频 | 亚洲国产精品999| 国产区一区二久久| 超碰成人久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲中文字幕日韩| 黄色视频不卡| 国产成人免费观看mmmm| 久久人人爽人人片av| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av美国av| 各种免费的搞黄视频| 妹子高潮喷水视频| 国产福利在线免费观看视频| 日日爽夜夜爽网站| av视频免费观看在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲熟女毛片儿| 人成视频在线观看免费观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一级片免费观看大全| 丝袜脚勾引网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久国产精品人妻一区二区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲中文字幕日韩| 99香蕉大伊视频| 18禁观看日本| 国产97色在线日韩免费| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品免费大片| 亚洲视频免费观看视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 高清在线国产一区| 99精品欧美一区二区三区四区| 天堂8中文在线网| 国产在线视频一区二区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 久热爱精品视频在线9| 又大又爽又粗| 老司机靠b影院| 99热国产这里只有精品6| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人av激情在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产成人免费无遮挡视频| 女人久久www免费人成看片| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 性高湖久久久久久久久免费观看| 美女午夜性视频免费| 一本综合久久免费| 精品一品国产午夜福利视频| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天添夜夜摸| 久久久久久久精品精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人欧美在线观看 | 一进一出抽搐动态| 一区二区三区激情视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产成人影院久久av| 天堂俺去俺来也www色官网| 后天国语完整版免费观看| 男人舔女人的私密视频| 狂野欧美激情性xxxx| 久久亚洲精品不卡| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 9191精品国产免费久久| 满18在线观看网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品国产乱码久久久久久小说| 一区二区三区四区激情视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一本久久精品| a级毛片在线看网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一进一出抽搐动态| 天天影视国产精品| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 99国产精品一区二区蜜桃av | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品 国内视频| 性色av一级| 女警被强在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产福利在线免费观看视频| 久久久精品区二区三区| 亚洲国产av影院在线观看| 免费少妇av软件| 国产人伦9x9x在线观看| 黄色视频不卡| 不卡av一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线精品无人区一区二区三| 欧美乱码精品一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 不卡一级毛片| e午夜精品久久久久久久| 在线观看免费视频网站a站| 久久国产精品人妻蜜桃| 女性生殖器流出的白浆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费人妻精品一区二区三区视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产欧美在线一区| 人妻一区二区av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 69av精品久久久久久 | 日本黄色日本黄色录像| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 精品福利永久在线观看| 超碰97精品在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 人妻 亚洲 视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品第二区| 一进一出抽搐动态| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜免费鲁丝| 久久久国产精品麻豆| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品在线电影| 我的亚洲天堂| 十八禁网站网址无遮挡| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人国产av品久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美激情高清一区二区三区| 一本综合久久免费| 91av网站免费观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 黄频高清免费视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产男女内射视频| 成年动漫av网址| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久热这里只有精品99| av一本久久久久| a级片在线免费高清观看视频| 欧美大码av| 亚洲国产精品999| 黄色a级毛片大全视频| 一二三四社区在线视频社区8| 日日夜夜操网爽| 老司机影院毛片| 午夜91福利影院| 久久久久久久久久久久大奶| 男人舔女人的私密视频| 国产精品欧美亚洲77777| 国产一区二区三区综合在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 成人手机av| 国产野战对白在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| 91av网站免费观看| 超碰97精品在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美一级毛片孕妇| 日本黄色日本黄色录像| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99香蕉大伊视频| avwww免费| 在线观看免费高清a一片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 18禁观看日本| 一级毛片电影观看| 大陆偷拍与自拍| 秋霞在线观看毛片| 日韩大片免费观看网站| 亚洲久久久国产精品| 免费日韩欧美在线观看| 最黄视频免费看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| xxxhd国产人妻xxx| 51午夜福利影视在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产99久久九九免费精品| 永久免费av网站大全| 91字幕亚洲| 久久久久精品国产欧美久久久 | av在线播放精品| 精品福利永久在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 91大片在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人妻一区二区av| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 首页视频小说图片口味搜索| 十八禁网站网址无遮挡| 老司机在亚洲福利影院| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲色图综合在线观看| 在线看a的网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 中文字幕最新亚洲高清| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 香蕉丝袜av| 久久久精品区二区三区| 午夜激情久久久久久久| 女人久久www免费人成看片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 中文字幕色久视频| 亚洲中文av在线| 国产日韩欧美视频二区| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品国产一区二区三区四区第35| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看一区二区三区激情| 真人做人爱边吃奶动态| 黄片大片在线免费观看| 久久狼人影院| 丰满少妇做爰视频| 久9热在线精品视频| 在线永久观看黄色视频| 美国免费a级毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| av视频免费观看在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 另类亚洲欧美激情| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久这里只有精品19| 免费在线观看完整版高清|