辣椒渣鮮味肽初步分離純化研究

羅鳳蓮，王 燕，趙 靜

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南長沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

辣椒渣鮮味肽初步分離純化研究

羅鳳蓮1，2，3，*王 燕1，2，3，趙 靜1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.國家蔬菜加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖南長沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128）

以辣椒渣為原料，將辣椒渣中蛋白提取出來，采用風(fēng)味酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解得到蛋白酶解液，然后將辣椒渣酶解液進(jìn)行初步分離純化和感官評價，獲得辣椒渣目標(biāo)鮮味肽的相對分子質(zhì)量范圍為307.32～1 422.69 Da，鮮味評分為8.0分，綜合風(fēng)味評分為4.1分。

辣椒渣；鮮味肽；酶解；分離純化

Abstract：With chili residue as raw material，chili residue protein is extracted and later is hydrolyzed by protamex and flavorzyme.Then chili residue hydrolysates are isolated and purified and then sensory evaluated.The relative molecular mass of obtained chili residue umami peptide is range from 307.32～1 422.69 Da，with umami score 8.0 and comprehensive flavor score 4.1.

Key words：chili residue；umami peptide；enzymatic hydrolysis；isolation and purification

0 引言

辣椒渣（又名辣椒粕） 是紅辣椒深加工提取辣椒紅色素和辣椒素后剩余的渣料，辣椒渣得率為原料干辣椒的80%左右。辣椒渣含有極少量的紅色素、辣椒玉紅素、胡蘿卜素、玉米黃素、VC及辣椒堿類物質(zhì)。另外，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、VB1，VB2及多種礦物質(zhì)，其蛋白質(zhì)含量可達(dá)14%～19%，并含有大量人體所必需的氨基酸和鮮味氨基酸[1-2]。

我國辣椒資源非常豐富，辣椒深加工企業(yè)有1 000余家，辣椒渣的產(chǎn)量也較高。辣椒渣具有殺菌、增加畜禽腸內(nèi)有益菌群、減少腸炎發(fā)病率、提高畜禽抗病能力等作用[3-6]。目前，辣椒渣主要用來作飼料或作為生產(chǎn)廢料被直接丟棄，造成了極大的資源浪費。

由于辣椒渣中蛋白質(zhì)含量豐富，是非常寶貴的食品資源。因此，試驗以辣椒渣為原料，將辣椒渣蛋白提取出來，進(jìn)行酶解處理，以具有鮮味的辣椒肽為考查目標(biāo)，參照預(yù)試驗確定的最佳酶解工藝條件，采用風(fēng)味酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行雙向酶解，制得富含鮮味肽的蛋白酶解產(chǎn)物。利用超濾、凝膠過濾層析等現(xiàn)代分離純化手段對辣椒渣蛋白酶解產(chǎn)物初步分離純化，然后采用感官評價法對目標(biāo)辣椒渣鮮味肽的鮮味、風(fēng)味進(jìn)行評價。此研究將為辣椒渣蛋白的利用提供理論依據(jù)，使辣椒渣變廢為寶，大大地提高辣椒渣的附加值，而且還可以增加鮮味劑的來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

風(fēng)味酶（200 U/mg）、復(fù)合蛋白酶（120 U/mg），上?？笊锟萍加邢薰咎峁焕苯吩蛛x蛋白，蛋白質(zhì)含量59.14%，實驗室自制；葡聚糖凝膠Sephadex G-15型樹脂，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司提供；D45 mm透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 U），北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；桿菌肽（Mr=1 422.69 Da）、還原型谷胱甘肽GSH（Mr=307.32 Da）、二甘氨酰甘氨酸Gly-Gly-Gly（Mr=189.17 Da），美國Amresco公司提供。

氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠、鹽酸、硼砂、甲醛、無水硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼酸、單寧、檸檬酸等均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

FW177型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；AUY220型分析天平，日本島津公司產(chǎn)品；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司產(chǎn)品；KDN-103F型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品；TDZ5型臺式低速離心機，湖南赫西裝備儀器有限公司產(chǎn)品；GL-3250B型磁力攪拌器，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；FD-1B型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產(chǎn)品；HD-3型紫外檢測器、DHLA型恒流泵、層析柱（0.8 cm×80 cm）、HD-A型電腦采集器，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；PHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；Ultra-15型離心超濾管，上海北諾生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

在G20杭州峰會開幕主旨演講中，習(xí)總書記是這樣介紹杭州的：“杭州是中國的一個歷史文化重鎮(zhèn)和商貿(mào)中心，有千年以上的歷史。千百年來，從白居易到蘇東坡，從西湖到大運河，杭州的悠久歷史和文化傳說引人入勝。杭州是創(chuàng)新活力之城，電子商務(wù)蓬勃發(fā)展，在杭州點擊鼠標(biāo)，聯(lián)通的是整個世界。杭州也是生態(tài)文明之都，山明水秀，晴好雨奇，浸透著江南韻味，凝結(jié)著世代匠心?！?/p>

1.3.1 辣椒渣分離蛋白的提取及蛋白酶解液的制備

辣椒渣→粉碎，過100目過篩→采用超聲輔助堿溶法提取（選擇超聲功率250 W，超聲溫度50℃，超聲時間4 h，NaOH堿液濃度0.3 mol/L，料液比1∶20） →離心（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min） →收集上清液→稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值3.6→離心（以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min） →收集沉淀，經(jīng)透析袋脫鹽→冷凍干燥（溫度-50℃，時間10 h），即為辣椒渣分離蛋白[2，7]。

將辣椒渣分離蛋白和水按照1∶10的比例混合均勻，在風(fēng)味酶和復(fù)合蛋白酶質(zhì)量比為1∶2，總酶用量為2%（以辣椒渣分離蛋白的質(zhì)量計算），選擇預(yù)試驗確定的最佳條件（酶解時間6 h，pH值6.5，酶解溫度50℃）進(jìn)行酶解，獲得辣椒渣蛋白酶解液。

1.3.2 辣椒渣蛋白酶解液的超濾分離

采用離心超濾管對辣椒渣蛋白酶解液進(jìn)行超濾分離。超濾膜的可截留分子量一般包括1，3，5，10 kDa等不同大小的分子量。一般來說，食源性蛋白中的呈味肽，其分子量均小于5 kDa[8-9]。預(yù)試驗結(jié)果也表明辣椒肽分子量較小，故選用3 kDa的超濾膜進(jìn)行分離。首先，將酶解液通過0.45 μm的微孔濾膜，然后使用離心超濾管（截留分子量為3 kDa）對酶解液進(jìn)行超濾，收集好大于3 kDa和小于3 kDa兩部分濾液，冷藏備用。

1.3.3 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析分離[10-11]

經(jīng)過預(yù)試驗，選擇葡聚糖凝膠SephadexG-15為最終填充柱材料。稱取5 g葡聚糖凝膠SephadexG-15，加200 mL蒸餾水，于室溫下溶脹6 h，達(dá)到溶脹平衡后將懸浮在液體表面的小顆粒傾瀉倒出，靜置過夜，棄去多余的蒸餾水，使葡萄糖凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%～70%。然后，參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行操作，得到凝膠過濾層析液。

1.3.4 辣椒渣鮮味肽的分子量估測

采用還原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 為標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL的肽標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取1 mL肽標(biāo)液使通過葡聚糖凝膠SephadexG-15層析柱，再進(jìn)行洗脫，采用紫外檢測器和電腦采集器繪制圖譜。將標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫出峰時間與樣品的洗脫出峰時間進(jìn)行對比，初步估計辣椒渣鮮味肽的相對分子質(zhì)量范圍。

1.3.5 辣椒渣鮮味肽的感官評價方法

選擇檸檬酸（代表酸味）、蔗糖（代表甜味）、鹽酸奎寧（代表苦味）、谷氨酸鈉（代表鮮味）、氯化鈉（代表咸味）做感官評價呈味基準(zhǔn)物質(zhì)，按照呈味閾值濃度（檸檬酸0.001 2%，白砂糖0.5%，鹽酸奎寧0.000 05%，谷氨酸鈉0.15%，氯化鈉0.08%）[12]、2倍呈味閾值濃度、4倍呈味閾值濃度、6倍呈味閾值濃度配制標(biāo)準(zhǔn)使用液，依次代表起始味道（Threshold）、輕微（Slight）味道、一般（Modetate）味道、較強（Strong）味道，然后對辣椒渣酶解液進(jìn)行感官評價。挑選7名對味道很敏感的評價員（4男3女），反復(fù)訓(xùn)練使記住基準(zhǔn)物質(zhì)味道，再根據(jù)基準(zhǔn)物質(zhì)味道對試驗樣品的味道分別進(jìn)行評判，并在呈味強度標(biāo)尺相應(yīng)的位置標(biāo)記酸、甜、苦、鮮、咸的程度，5種味道評分取值范圍設(shè)定在0～15分，最后對所得數(shù)據(jù)采用加權(quán)法計算總分。

呈味強度標(biāo)尺（起始、輕微、一般、較強） 見圖1，感官評價綜合評分權(quán)重系數(shù)見表1。

圖1 呈味強度標(biāo)尺（起始、輕微、一般、較強）

表1 感官評價綜合評分權(quán)重系數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解液的超濾分離

辣椒渣蛋白經(jīng)過風(fēng)味酶和復(fù)合蛋白酶的雙酶水解之后，獲得辣椒渣蛋白酶解液，再經(jīng)過超濾分離后得到分子量小于3 kDa和分子量大于3 kDa的2種組分，進(jìn)行感官評價。測得經(jīng)超濾分離截留分子量小于3 kDa的組分鮮味更加明顯，綜合風(fēng)味也更好。因此，選擇截留分子量小于3 kDa的組分進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。

超濾分離后2種組分的感官評價結(jié)果見表2。

表2 超濾分離后2種組分的感官評價結(jié)果/分

2.2 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析分離純化

對超濾后分子量小于3 kDa的組分Ⅰ繼續(xù)進(jìn)行凝膠過濾分離純化，選用凝膠SephadexG-15，進(jìn)樣量1 mL，上樣濃度25 mg/mL，以蒸餾水為洗脫液，洗脫速度30 mL/h，得到3個洗脫峰A，B，C，以感官評分進(jìn)行結(jié)果評定。

辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析見圖2，凝膠過濾層析后不同組分的感官評價結(jié)果見表3。

圖2 辣椒渣蛋白酶解液的凝膠過濾層析

表3 凝膠過濾層析后不同組分的感官評價結(jié)果/分

測得A組分的鮮味評分為5.0分，綜合風(fēng)味評分為2.0分；B組分的鮮味評分為8.0分，綜合風(fēng)味評分為4.1分；C組分的鮮味評分為6.0分，綜合風(fēng)味評分為2.9分。因此，選擇B組分為目標(biāo)鮮味肽。

2.3 辣椒渣鮮味肽分子量的估測

辣椒渣鮮味肽B組分與還原型谷胱甘肽GSH（307.32 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、二甘氨酰甘氨酸（189.17 Da） 標(biāo)樣在相同凝膠過濾層析條件下比較，依據(jù)其出峰時間可以初步判定，辣椒渣鮮味肽B組分的相對分子質(zhì)量范圍為307.32～1 422.69 Da。

3 結(jié)論

試驗選擇復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味酶酶解辣椒渣蛋白，采用超濾法對辣椒渣蛋白酶解液進(jìn)行第一步分離提純，感官評價結(jié)果表明分子量小于3 kDa的組分鮮味更加明顯，綜合風(fēng)味也更好。采用凝膠過濾層析法作進(jìn)一步分離純化，最終得到較純的辣椒渣鮮味肽ⅠB組分，其相對分子質(zhì)量范圍為307.32～1 422.69 Da，鮮味評分為8.0分，綜合風(fēng)味評分為4.1分。

[1]楊清香，葛亮，潘鋒，等.辣椒資源開發(fā)利用狀況 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2010（10）：80-82.

[2]唐鑫媛，夏延斌，文新昱，等.超聲波輔助堿法提取辣椒渣中蛋白質(zhì)的工藝優(yōu)化 [J].食品與機械，2015，31（2）：222-226.

[3]李萬峰.辣椒粕的營養(yǎng)價值與作用 [J].農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù)，2012 （23）：44.

[4]王東海，鐵鑫，趙蕓君，等.新疆辣椒粕在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用分析及前景展望 [J].草食家畜，2015（4）：35-39.

[5]Sowbhagya H B，Soumya C，Indrani D，et al.Physicochemical characteristics of chilli spent residue and its effect on the rheological，microstructural and nutritional qualities of bread[J].Journal of Food Science and Technology，2015，52 （11）：7 218-7 226.

[6]Luana P Cruz，Suzanna F F Ribeiro，Andre O Carvalho，et al.Isolation and partial characterization of a novel lipid transfer protein（LTP） and antifungal activity of peptides from chilli pepper seeds[J].Protein&Peptide Letters，2010，17 （3）：311-318.

[7]趙靜，王燕.辣椒粕分離蛋白酶解工藝條件的優(yōu)化 [J].食品與機械，2016，32（1）：162-166.

[8]周雪松，趙謀明.肽的呈味功能研究 [J].中國調(diào)味品，2005 （6）：38-42．

[9]劉亞，章超樺.肽的呈味作用研究進(jìn)展 [J].食品工業(yè)科技，2010，31（3）：418-421．

[10]盧君.鯉魚卵卵黃高磷蛋白的分離純化和性質(zhì)研究 [D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014．

[11]尹歆.鰱魚蛋白制備ACE抑制肽的工藝及其活性研究 [D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[12]夏延斌，王燕.食品化學(xué) [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：25-28.◇

Preliminary Isolation and Purification of Chili Residue Umami Peptide

LUO Fenglian1，2，3，*WANG Yan1，2，3，ZHAO Jing1
（1.College of Food Science and Technology，Hu'nan Agricultural University，Changsha，Hu'nan 410128，China；2.National R＆D Center for Vegetable Processing，Changsha，Hu'nan 410128，China；3.Hu'nan Provincial KeyLaboratoryofFood Science and Biotechnology，Changsha，Hu'nan 410128，China）

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.028

1671-9646（2017） 09b-0008-03

2017-07-06

湖南省科技重大專項子項目“蔬菜貯藏保鮮和加工新技術(shù)以及功能成分高效綜合利用研究與示范”（2015NK1003）。

羅鳳蓮（1973— ），女，博士，副教授，研究方向為食品分析與營養(yǎng)。

*通訊作者：王 燕（1968— ），女，博士，教授，研究方向為食品功能成分和食品添加劑。