豌豆蛋白的提取及利用次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的研究

鄧永東，呂西軍，吳學(xué)鳳，李興江

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230009）

加工教研

豌豆蛋白的提取及利用次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的研究

鄧永東，呂西軍，吳學(xué)鳳，*李興江

（合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230009）

目前，國內(nèi)利用豌豆提取豌豆蛋白會產(chǎn)生大量廢棄液體，這些液體稱為次豌豆?jié){，其中含有大量的豌豆淀粉。一些企業(yè)將這部分液體直接排放或者用于生產(chǎn)飼料，造成了資源浪費和環(huán)境污染。為了解決這一問題，對豌豆蛋白的提取工藝及其余下的次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇展開研究，采用酸沉法對豌豆蛋白進行提取，然后通過試驗探究次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的最適條件。結(jié)果表明，50 g碗豆中蛋白含量10.84 g，淀粉含量20.34 g，淀粉水解率達到理論值的83.7%；最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃，菌液接種量10%，發(fā)酵液pH值4，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。在該條件下，乙醇產(chǎn)量達到28.36 g/L，糖利用率達到98%，乙醇產(chǎn)量達到理論值的88%。對次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇工藝展開研究將為豌豆綜合利用率的提高奠定一定基礎(chǔ)。

次豌豆?jié){；豌豆蛋白；葡萄糖；乙醇；發(fā)酵

Abstract：At present，the domestic use of peas to extract pea protein left a large number of abandoned liquid，these liquids are called sub-pea pulp，which contain a lot of pea starch.Some companies will directly discharge this part of the liquid or for the production of feed，resulting in waste of resources and environmental pollution.In order to solve this problem，this paper studies the extraction process of pea protein and the fermentation of fermented ethanol from the other pea pulp.The pea protein is extracted by acid precipitation method，and then the optimum conditions of ethanol fermentation are studied.The results show that 50 g peanut protein content of 10.84 g，starch content of 20.34 g，and the hydrolysis rate of starch reaches 83.7%of the theoretical value.The optimum fermentation conditions are as follows：fermentation temperature 30℃，inoculation amount 10%，initial pH 4，shaking speed 200 r/min.Under the optimum conditions，the ethanol yield reaches 28.36 g/L，sugar utilization rate of 98%.Ethanol production reaches 88%of the theoretical value.The research on the fermentation technology of pea pulp is carried out，which las a foundation for the improvement of the comprehensive utilization rate of pea.

Key words：secondary pea pulp；pea protein；glucose；ethanol；fermentation

豌豆是世界第二大豆類作物，目前生產(chǎn)干豌豆的國家有60多個。豌豆蛋白具有較高的溶解度、吸水性和乳化性，其中氨基酸組成符合人體需要，富含維生素、礦物質(zhì)元素、蛋白質(zhì)和碳水化合物等物質(zhì)，營養(yǎng)全面且均衡，在食品工業(yè)中用途廣泛。豌豆中含有膳食纖維，有助于消化、防止包括闌尾炎、心臟病和結(jié)腸癌等在內(nèi)的多種疾病。淀粉和蛋白是豌豆中的重要組分。

干豌豆不僅含有大量的淀粉，而且還含有豐富的蛋白質(zhì)；其成熟籽粒中分別含有蛋白質(zhì)21%～28%，淀粉48%～52%。目前，國內(nèi)許多企業(yè)利用豌豆提取豌豆蛋白，但未對其剩下的次豌豆?jié){進行有效利用，通常一些企業(yè)將這部分液體直接排放或者用于生產(chǎn)飼料，既造成了資源的浪費，又會對環(huán)境造成污染。為了解決這一問題，對豌豆蛋白提取及余下的次豌豆?jié){利用展開研究，利用次碗豆?jié){中的淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，不僅可以提高豌豆的利用率，也能達到改善環(huán)境的目的。

1 材料與方法

1.1 酵母菌

熱帶假絲酵母CICC1779。

1.2 培養(yǎng)基

YPD葡萄糖液體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母膏1 g，葡萄糖2 g，蛋白胨2 g。

YPD固體培養(yǎng)基（100 mL）：酵母膏1 g，葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，瓊脂1.5 g。

種子培養(yǎng)基、擴大培養(yǎng)基，均用YPD培養(yǎng)基。

1.3 主要儀器

LY-B0.025型壓力蒸汽滅菌器，武漢市鴻雁醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；AR1140/C型電子分析天平，奧豪斯（上海）公司產(chǎn)品；SWO-CJ-IP型超凈工作臺，蘇靜集團安泰公司產(chǎn)品；756MC型紫外分光光度計，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；ZHP-Y2102L型智能恒溫搖床培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FE20型實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；MC型酒精計，上海長城儀器廠產(chǎn)品；WYT-4型手持糖量計，泉州中友光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；溫度計，鄭州澤銘科技有限公司產(chǎn)品；RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海五相儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.4 主要試劑

葡萄糖、牛血清蛋白、重鉻酸鉀溶液、DNS溶液、蛋白胨、酵母膏、瓊脂（BR）、考馬斯亮藍試劑、95%乙醇、HCl和NaOH，以上試劑均為分析純。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種的活化與擴培

（1） 菌種活化。配置YPD葡萄糖固體培養(yǎng)基；將冷藏的酵母菌活化，使菌種從冷藏狀態(tài)恢復(fù)到室溫狀態(tài)。將冷藏的酵母菌用糖水活化后，接種到固體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)溫度30℃。挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落接種到新的YPD固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)此步驟2～3次，從而得到生長良好的菌落。

（2）菌種保存。挑選茁壯的單個菌落接種到試管中，置于4℃冰箱中保存。

（3）菌種擴培。將保存的菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h（溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min），實現(xiàn)擴培[1]。

1.5.2 豌豆中蛋白的提取

將50 g豌豆與300 mL水混合，清洗后浸泡24 h（浸泡使纖維吸水膨脹增大，使之破碎后，與蛋白、淀粉易于分離，從而使蛋白和淀粉從中提取出來）。去除豌豆皮后，用豆?jié){機磨漿（磨漿是通過機械作用破壞豌豆內(nèi)部纖維與蛋白的結(jié)構(gòu)網(wǎng)，從而使淀粉和蛋白溶于磨漿液中）[2]，使用100目濾網(wǎng)過濾，濾渣部分主要為淀粉、纖維素等不溶成分，上層清液中主要為蛋白等[3]。

取上清液，調(diào)節(jié)pH值至4.6后，使用離心機以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，下層沉淀部分為豌豆蛋白。通過考馬斯亮藍法，標定出標準蛋白曲線[4]。

1.5.3 豌豆中淀粉含量的測定

將50 g豌豆與300 mL水混合，浸泡24 h后打漿，調(diào)pH值至4.6等電點去除蛋白后，取余下淀粉乳→烘干→稱量→蒸煮糖化→烘干→稱量，減少的質(zhì)量即為淀粉糊化糖化減少的質(zhì)量[5]。取最后的烘干產(chǎn)物，用一定水溶解后加入碘液，有輕微淡藍色出現(xiàn)，則淀粉分解較為完全[6]。

1.5.4 次豌豆?jié){的制備及糖化率的測定

次豌豆?jié){是指提取豌豆蛋白后所余下的部分，在這里通過制備得到次豌豆?jié){。將上一步分離蛋白之后的液體與之前的濾渣混合，得到的漿液即為次豌豆?jié){[7]。

調(diào)節(jié)次豌豆?jié){pH值至5.6（α-高溫淀粉酶最適pH值），加入α-高溫淀粉酶，于60℃條件下水浴30 min，隨后于100℃條件下水浴60 min；待漿液冷卻至60℃，加入糖化酶于60℃條件下水浴60 min，得到糖化后用于發(fā)酵的次豌豆?jié){。

取少量糖化后的次豌豆?jié){置于試管中，滴加2滴碘液，有輕微淡藍色出現(xiàn)，則淀粉水解較為完全[8]。

1.5.5 乙醇產(chǎn)量測定

重鉻酸鉀標準曲線的標定：①取8支10 mL比色管，分別加入2 mL重鉻酸鉀溶液和適量乙醇標準溶液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴10 min后流水冷卻至室溫，于波長600 nm處測定吸光度，以吸光度為橫坐標、乙醇含量為縱坐標繪制標準曲線[8]；②取發(fā)酵液10 mL，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測液；③取10 mL比色管加入2 mL重鉻酸鉀溶液，1 mL待測液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴10 min后流水冷卻至室溫，于波長600 nm處測定吸光度，根據(jù)重鉻酸鉀標準曲線回歸方程計算出乙醇粗測質(zhì)量分數(shù)[9]。

1.5.6殘?zhí)橇繙y定

（1）DNS試劑。量取750 mL去離子水，加熱至微熱后順序加入3,5-二硝基水楊酸10 g，NaOH 16 g，苯酚5 g，亞硫酸鈉5 g和酒石酸鉀鈉300 g，溶解后定容至1 000 mL，棕色瓶中室溫下暗處放置1周后使用。

（2）DNS標準曲線的標定。①取10 mL比色管，分別加入1.5 mL DNS試劑和適量葡萄糖標準溶液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴5 min后冷卻至室溫，于波長540 nm處測定吸光度[10]；②取發(fā)酵液10 mL，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測液；③取10 mL比色管，加入1.5 mL DNS溶液，50 μL待測液，用蒸餾水定容至10 mL，沸水浴5 min后流水冷卻至室溫，于波長540 nm處測定吸光度，根據(jù)DNS標準曲線回歸方程計算出殘?zhí)橇縖10]。

1.5.7 次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的單因素試驗

由以往發(fā)酵試驗得知，影響發(fā)酵的因素 包括發(fā)酵時間、菌液接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵液 pH值、轉(zhuǎn)速以及通氣量等。試驗主要研究發(fā)酵液pH值、菌液接種量、發(fā)酵溫度，搖床轉(zhuǎn)速這4個因素對乙醇發(fā)酵的影響[7]。

發(fā)酵時間72 h，每個500 mL錐形瓶中裝入次豌豆?jié){300 mL，發(fā)酵液pH值分別取3，4，5，6，7共5個水平；菌液接種量分別取6%，8%，10%，12%，14%共 5個水平；發(fā)酵溫度分別取26，28，30，32，34℃共5個水平；搖床轉(zhuǎn)速分別取100，150，200，250， 300 r/min共5個水平。

1.5.8 次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行正交試驗。正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 豌豆成分含量測定

根據(jù)方法1.5.2測出蛋白溶液于波長595 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線計算出50 g豌豆中蛋白含量為10.84 g；根據(jù)方法1.5.3測得50 g豌豆中淀粉含量為20.34 g，其他含量為18.82 g。

2.2 糖化率

根據(jù)方法1.5.4利用淀粉酶和糖化酶對次豌豆?jié){進行水解，然后通過DNS法測得葡萄糖質(zhì)量濃度為62.97 g/L，達到淀粉水解理論值的83.7%（理論值為1 g淀粉完全水解得到1.11 g葡萄糖）。

2.3 最適單因素試驗研究

2.3.1 最佳發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響見圖1。

發(fā)酵溫度是影響乙醇發(fā)酵的主要因素之一。溫度會影響微生物細胞內(nèi)的生物大分子活性，進而影響到微生物的生命活動。隨著溫度升高，細胞內(nèi)的酶反應(yīng)速度會加快；可是溫度過高或過低，生物活性物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸等）會發(fā)生變性，細胞功能下降，甚至死亡。由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，酵母菌利用次豌豆?jié){發(fā)酵乙醇的產(chǎn)量有明顯提高。在30℃時乙醇產(chǎn)量達到最高值26.58 g/L，殘?zhí)橇績H為5.2 g/L；隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)升高，乙醇產(chǎn)量明顯降低。當(dāng)發(fā)酵溫度低于30℃時，發(fā)酵溫度越高越有利于發(fā)酵；而發(fā)酵溫度高于30℃時，由于發(fā)酵溫度過高，會影響乙醇產(chǎn)量[11]。

2.3.2 最佳搖床轉(zhuǎn)速的確定

搖床轉(zhuǎn)速對乙醇產(chǎn)量的影響見圖2。

圖1 發(fā)酵溫度對乙醇產(chǎn)量的影響

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對乙醇產(chǎn)量的影響

搖床可以排出發(fā)酵液中生成的CO2，CO2會通過影響酵母細胞內(nèi)外的pH值、細胞膜及酶來抑制酵母的生長代謝[2]。而搖床轉(zhuǎn)速對釀酒酵母的生長與發(fā)酵狀況也有一定影響，搖床能夠加速發(fā)酵過程中產(chǎn)生CO2的排出，并使酵母懸浮在培養(yǎng)液中，在一定程度上增加菌液濃度。由圖2可知，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，乙醇產(chǎn)量有明顯的提高[12]。在搖床轉(zhuǎn)速200 r/min時，乙醇產(chǎn)量達到最高達到25.63 g/L；隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高，乙醇產(chǎn)量有略微的降低。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100～200 r/min時，搖床轉(zhuǎn)速越高，乙醇產(chǎn)量越高；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為200～300 r/min時，搖床轉(zhuǎn)速越高越不利于酵母菌的生長，乙醇產(chǎn)量越低。

2.3.3 最佳發(fā)酵液pH值的確定

發(fā)酵液pH值對乙醇產(chǎn)量的影響見圖3。

培養(yǎng)基或環(huán)境中的pH值與微生物的生命運動有著密切的聯(lián)系。培養(yǎng)基或環(huán)境中的pH值不光影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、促進或抑制微生物的生長，還可影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性；影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用；并且酵母對酸度耐受性的高低是評價乙醇酵母優(yōu)劣的重要指標[13]。由圖3可知，隨著發(fā)酵液pH值的提高，乙醇產(chǎn)量有明顯提高。在發(fā)酵液pH值4時，乙醇產(chǎn)量達到最高值26.98 g/L，殘?zhí)橇繛?.69 g/L；發(fā)酵液pH值繼續(xù)升高，乙醇產(chǎn)量有明顯降低。因此，發(fā)酵液pH值為5是最適發(fā)酵液pH值。

2.3.4 最佳菌液接種量的確定

菌液接種量對乙醇產(chǎn)量的影響見圖4。

圖3 發(fā)酵液pH值對乙醇產(chǎn)量的影響

圖4 菌液接種量對乙醇產(chǎn)量的影響

酵母菌菌液接種量不同，其中酵母菌的含量也不同。菌液接種量過多，培養(yǎng)基成分會對發(fā)酵造成一定影響；這里接種量較少，不考慮培養(yǎng)基成分的影響，僅觀察酵母菌量對發(fā)酵的影響。菌液量過少會使得發(fā)酵速率大大降低，菌液量過多酵母菌之間會相互抑制。由圖4可知，隨著菌液接種量的提高，乙醇產(chǎn)量有明顯提高。在菌液接種量為10%時，乙醇產(chǎn)量達到最高值27.52 g/L，殘?zhí)橇繛?.36 g/L；隨著菌液接種量繼續(xù)增高，乙醇產(chǎn)量又有明顯降低。因此，菌液接種量為10%是最佳菌液接種量。

2.4 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，4個因素中對乙醇產(chǎn)量影響的主次順序為發(fā)酵液pH值＞搖床轉(zhuǎn)速＞菌液接種量＞發(fā)酵溫度，其中發(fā)酵液pH值對乙醇產(chǎn)量影響最為顯著，搖床轉(zhuǎn)速次之。發(fā)酵液pH值不僅影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、促進或抑制微生物的生長，還可影響環(huán)境中有害物質(zhì)對微生物的毒性；影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用。搖床轉(zhuǎn)速影響了培養(yǎng)基中CO2的含量，影響較強；發(fā)酵溫度影響最小。

由正交試驗分析可知，最佳乙醇發(fā)酵條件為發(fā)酵液pH值4，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵溫度30℃，菌液接種量10%。

表2 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

通過對豌豆蛋白的提取工藝及對其余下的次豌豆?jié){發(fā)酵制備乙醇進行研究，采用酸沉法對豌豆蛋白進行提取，分析得到蛋白含量為21.68%，淀粉含量為40.68%。然后，對次豌豆?jié){發(fā)酵制備乙醇進行單因素試驗及在此基礎(chǔ)上進行正交試驗優(yōu)化，最終得到最佳的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃，菌液接種量10%，發(fā)酵液pH值4，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min；最終乙醇產(chǎn)量達到28.36 g/L，糖利用率達到98%。

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Studyon the Extraction ofPea Protein and the Fermentation of Ethanol fromSub-pea Pulp

DENG Yongdong，LV Xijun，WU Xuefeng，*LI Xingjiang
（Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products in Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009，China）

TS201.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.026

1671-9646（2017） 09b-0001-04

2017-06-26

安徽省重大科技專項“利用次淀粉漿廢液發(fā)酵酒精資源綜合利用的關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化”（15CZZ03100）。

鄧永東（1992— ），男，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：李興江（1978— ），男，博士，副教授，研究方向為發(fā)酵工程。