高選擇性半胱氨酸熒光探針的合成及生物成像

楊志廣， 馮燦燦， 彭 鵬， 武 文， 田明剛

(1.周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南周口 466001； 2.山東大學(xué)晶體材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

圖1 探針C1結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of C1 probe

生物體內(nèi)半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH) 等許多含巰基生物分子在體內(nèi)生理與病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。例如，人體中缺乏Cys會(huì)引起肝臟受傷、皮膚松弛、身體浮腫和毛發(fā)褪色等病癥[1 - 3]；而Hcy含量的增高則會(huì)引起老年癡呆癥、動(dòng)脈硬化、神經(jīng)中樞缺陷和骨質(zhì)疏松等疾病[4 - 5]；GSH則與人體中的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡密切相關(guān)[6 - 7]。因此，定量、專一性檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)生物巰基分子對(duì)于人體疾病的預(yù)防、診斷和治療具有非常重要的指導(dǎo)意義。熒光分析法相對(duì)于高效液相色譜法[8]、電化學(xué)法[9]、質(zhì)譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]等檢測(cè)方法，具有操作簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高以及可視化觀測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[12 - 14]，在檢測(cè)生物巰基分子方面得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。

本文根據(jù)醛基與巰基、氨基官能團(tuán)共同作用合成了一種新型的,利用醛基識(shí)別生物巰基分子的熒光探針C1，探針C1結(jié)構(gòu)式如圖1所示。該探針本身無熒光，與Cys作用后，熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)且溶液顏色由無色變?yōu)樯钏{(lán)色，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cys的專一性識(shí)別和裸眼檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Bruker Advance 300型核磁共振譜儀(瑞士，布魯克公司)；Nexus 670型紅外光譜儀(美國(guó)，尼高力公司)；6510型Q-TOF質(zhì)譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；Cary50型紫外可見吸收光譜儀(美國(guó)，瓦利安公司)；HITACH F-4500型單光子熒光光譜儀(日本，日立公司)。

咔唑(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；N-溴代丁二酰亞胺(NBS)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4-乙酰氧基苯乙烯(分析純，百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)；氨基酸(分析純，日本株式會(huì)社生物試劑公司)。水為去離子水。

1.2 探針C1的合成與表征

1.2.19-乙基咔唑的合成將一定量的KOH粉末和咔唑加入到丙酮中，室溫?cái)嚢钄?shù)小時(shí)后，加入含有1-溴乙烷的丙酮溶液，反應(yīng)過夜。經(jīng)水洗，過濾，乙醇重結(jié)晶等過程，得到白色的固體，產(chǎn)率：83%。1H NMR(300 MHz,CDCl3),δ(ppm):8.10(d,J=7.8 Hz,2H),7.39～7.44(m,4H),7.20～7.25(m,2H),4.36(q,J=7.2 Hz,2H),1.43(d,J=7.2 Hz,3H)。

1.2.23-甲酰基-9-乙基咔唑的合成在250 mL圓底燒瓶中，加入1.86 mL DMF，冷卻至0 ℃，逐滴加入2.3 mL POC13，再加入溶有4.88 g 9-乙基咔唑(25 mmol)的CHC13溶液，加熱回流20 h。蒸出CHC13，倒入水中，調(diào)節(jié)pH至7～8左右，用CH2Cl2進(jìn)行萃取，用水、飽和NaCl溶液洗滌，無水MgSO4干燥過夜，過濾，蒸出溶劑，粗產(chǎn)品用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，經(jīng)柱色譜分離得到黃色固體，產(chǎn)率：87%。1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ(ppm) 10.10(s,1H),8.61(s,1H),8.16(d,J=7.8 Hz,1H),8.01(dd,J1=8.4 Hz,J2=1.5 Hz,1H),7.47～7.57(m,3H),7.26～7.35(m,1H),4.40(q,J=7.2 Hz,2H),1.47(t,J=7.4 Hz,3H)。

1.2.33-甲酰基-6-溴-9-乙基咔唑的合成在100 mL三口燒瓶中，加入2.2 g 3-甲?；?9-乙基咔唑(9.85 mmol)和60 mL CHC13∶HAc混合溶液(1∶1,V/V)，氬氣保護(hù)下，加入1.9 g NBS(10.67 mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20 h，倒入冰水中，用CH2Cl2進(jìn)行萃取，水洗，無水MgSO4干燥過夜，過濾，蒸出溶劑，粗產(chǎn)品用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)作淋洗液，經(jīng)柱色譜分離得到白色固體，產(chǎn)率：81%。1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ(ppm) 10.10(s,1H),8.56(d,J=1.2 Hz,1H),8.27(d,J=1.8 Hz,1H),8.05(dd,J1=8.6 Hz,J2=1.5 Hz ,1H),7.62(dd,J1=8.7 Hz,J2=1.8 Hz,1H),7.49(d,J=8.4 Hz,1H),7.35(d,J=8.7 Hz,1H),4.4(q,J=7.3 Hz,2H),1.47(t,J=7.4 Hz,3H)。

1.2.4探針C1的合成在100 mL三口燒瓶中，加入0.9 g 3-甲?；?6-溴-9-乙基咔唑(3 mmol)、33.67 mg乙酸鈀(0.15 mmol)、91.31 mg三鄰甲苯基膦(0.3 mmol)和30 mL DMF，室溫?cái)嚢?0 min。然后加入0.91 mL 4-乙酰氧基苯乙烯(6 mmol)和1 mL三乙胺，氬氣保護(hù)下，加熱至120 ℃，反應(yīng)3 d。倒入水中，再用CH2Cl2進(jìn)行萃取，水洗，無水MgSO4干燥過夜，過濾，蒸出溶劑，粗產(chǎn)品用CH2Cl2作淋洗液，經(jīng)柱色譜分離得到黃色固體，產(chǎn)率：35%。IR(cm-1):1 671(υC=O),1 755(υC=O)。1H NMR(300 MHz,DMSO-d6),δ(ppm):10.08(s,1H),8.80(d,J=1.2 Hz,1H),8.57(s,1H),8.02(dd,J=8.55 Hz,1H),7.79～7.83(m,2H),7.73(d,J=8.4 Hz,1H),7.64～7.69(m,2H),7.32～7.45(m,2H),7.14～7.18(m,2H),4.53(m,2H),2.29(s,3H),1.36(t,J=7.2 Hz,3H)。HRMS(m/z):C25H21NO3[M+H]+計(jì)算值為383.15，測(cè)定值為384.18。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針C1紫外吸收和滴定光譜分析

固定探針C1濃度為10 μmol/L，Cys濃度為0～1.0×10-3mol/L，激發(fā)波長(zhǎng)為347 nm，在甲醇中進(jìn)行吸收光譜紫外和熒光滴定實(shí)驗(yàn)。由圖2(a)可知，隨著Cys濃度的增加，探針C1的紫外吸收峰在347 nm左右逐漸消失，而在332 nm處有一新峰出現(xiàn)，藍(lán)移15 nm左右，同時(shí)在346 nm和324 nm處各出現(xiàn)一個(gè)等吸收點(diǎn)(圖2(a))，表明探針C1與Cys發(fā)生了反應(yīng)，生成了一種新的物質(zhì)。根據(jù)熒光滴定結(jié)果，探針C1本身沒有熒光，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖2(b))，當(dāng)Cys濃度為600 μmol/L，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)105倍，說明探針C1是一種良好的檢測(cè)Cys熒光增強(qiáng)型探針。另外，探針C1在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度與Cys的濃度存在一定的線性關(guān)系，線性范圍為20～100 μmol/L，熒光檢出限(S/N=3)[15]為5 μmol/L。

圖2 探針C1的紫外吸收(a)和熒光滴定(b)光譜Fig.2 UV absorption(a) and fluorescence titration (b) spectra of probe C1

2.2 探針C1的選擇性分析

固定探針C1的濃度為10 μmol/L，其它相關(guān)生物分析物濃度均為600 μmol/L，激發(fā)波長(zhǎng)為347 nm。由圖3可見，在甲醇中加入Cys后，探針C1的紫外最大吸收峰藍(lán)移15 nm左右，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而加入Hcy、GSH等其它生物分析物后，紫外吸收和熒光光譜幾乎沒有變化，說明探針C1對(duì)Cys具有較高的選擇性。另外，在自然光下溶液顏色均為無色(圖4(a))，但在紫外燈(λex=365 nm)下，只有加入Cys溶液顏色呈深藍(lán)色(圖4(b))，其它溶液顏色沒有發(fā)生變化，表明探針C1可以作為檢測(cè)Cys的裸眼探針。

圖3 探針C1加入各種生物分析物前后的紫外吸收(a)和熒光(b)光譜Fig.3 UV absorption(a) and fluorescence(b) spectra of probe C1(10 μmol/L) in the presence of 60 equiv diverse bioanalytes

圖4 探針C1加入各種生物分析物前后的自然光照片(a)和紫外燈下(λex=365 nm)照片(b)Fig.4 The photos of probe C1(10 μmol/L) in the absence and presence of 60 equiv diverse bioanalytes under natural light(a) and UV light(b)(λex=365 nm) From left to right,then from top to bottom:C1,Cys,Hcy,GSH,Arg,Asn,Asp,β -ala,DTT,Gln,Glu,Gly,His,Ile,L-ala,Leu,Lys,Met,NAC,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val.

2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響

固定探針C1的濃度為10 μmol/L，Cys、Hcy和GSH的濃度均為600 μmol/L，激發(fā)波長(zhǎng)為347 nm。由圖5可見，在甲醇中加入Cys后，探針C1的熒光強(qiáng)度在1～10 min內(nèi)顯著增強(qiáng)并達(dá)到最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸降低，但降低幅度較小。因此，探針C1與Cys的最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min。而探針C1本身以及與Hcy、GSH作用后的熒光強(qiáng)度很弱且在1 h內(nèi)幾乎保持不變，表明探針C1與Cys作用后生成的強(qiáng)熒光物質(zhì)具有較高的光穩(wěn)定性。

2.4 探針C1的細(xì)胞成像

將濃度為5 μmol/L的探針C1分子在37 ℃ 孵育細(xì)胞0.5 h，用PBS洗三遍。將接種好細(xì)胞的玻片用PBS洗三遍，室溫下在5 μmol/L的C1溶液中染色0.5 h，用488 nm氬離子激光進(jìn)行掃描，經(jīng)濾色片濾色后收集探針分子成像的熒光信號(hào)。成像結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，探針C1具有較好的細(xì)胞滲透性，能進(jìn)入活細(xì)胞，并且得到了清晰的藍(lán)色熒光照片。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of reaction time on fluorescence intensity of probe

圖6 探針 C1的寬場(chǎng)成像Fig.6 Wide-field image of probe C1

3 結(jié)論

以咔唑?yàn)樵?，利用親核取代反應(yīng)、Vilsmeier反應(yīng)和Heck反應(yīng)等簡(jiǎn)單的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，合成了一個(gè)熒光增強(qiáng)型半胱氨酸探針，并通過核磁、質(zhì)譜和紅外光譜等對(duì)探針結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。該探針具有合成簡(jiǎn)單、選擇性好和光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)半胱氨酸具有高度的選擇性，可進(jìn)行裸眼分辨和活細(xì)胞成像，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。