豆腐酸漿中干酪乳桿菌的分離、鑒定及作為豆腐凝固劑的應(yīng)用

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(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州 121000)

豆腐酸漿中干酪乳桿菌的分離、鑒定及作為豆腐凝固劑的應(yīng)用

葉青1,許云賀2,張莉力1,*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121000)

通過平板涂布法和高效液相色譜法,以pH和產(chǎn)乳酸量為指標(biāo),從自然發(fā)酵酸漿中分離篩選出一株乳酸菌YQ336,對(duì)其進(jìn)行菌株形態(tài)觀察、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析,結(jié)果表明,該乳酸菌屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌。將分離出的干酪乳桿菌YQ336接種于豆腐黃漿水中純種發(fā)酵制成豆腐凝固劑點(diǎn)制豆腐,與自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩者的感官評(píng)分差異不顯著(p>0.05),說明干酪乳桿菌YQ336可以作為新型豆腐凝固劑開發(fā)并使用。

黃漿水,干酪乳桿菌,高效液相色譜,豆腐凝固劑,分離鑒定,酸漿豆腐

Abstract:A strain of lactic acid bacteria was screened out from the tofu acid pulp by the plate coating method and high performance liquid chromatography with the pH and lactic acid yield as indexes. The morphological observation,colony morphological observation,physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis of the strain were carried out,and the results showed that the lactic acid bacteria belonged toLactobacilluscasei. The isolatedLactobacilluscaseiYQ336 was inoculated into bean curd water and fermented into tofu coagulant to make tofu,compared with tofu made from natural fermented acid pulp,it was found that there was no significant difference between the two sensory scores(p>0.05). The result indicated thatLactobacilluscaseiYQ336 can be developed and used as a new tofu coagulant.

Keywords:bean curd water;Lactobacilluscasei;high performance liquid chromatography(HPLC);tofu coagulant;isolation and identification;acid slurry bean curd

黃漿水是豆腐生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、鹽類等物質(zhì),通常被直接排放,既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境[1]。近年來,黃漿廢水的利用主要有功能性成分的回收和直接利用[2-3]兩種方式。Xijun Chai[4]等利用膜處理法過濾黃漿廢水,使?jié)饪s物可以回到生產(chǎn)線重新利用,過濾后的水可以直接排放。而我國傳統(tǒng)酸漿豆腐是利用黃漿水直接自然發(fā)酵,形成酸漿作為豆腐凝固劑[5-6],并進(jìn)行循環(huán)使用。酸漿豆腐口感細(xì)膩,味甘甜,是純綠色食品[7-8]。但是,傳統(tǒng)酸漿都是由小作坊自然發(fā)酵制成,容易受外界因素影響,導(dǎo)致酸漿的酸度不易控制。外界溫度足夠時(shí),微生物繁殖迅速,酸漿可以很快達(dá)到點(diǎn)豆腐所需的酸度,而外界溫度過低時(shí),酸度則需要很長時(shí)間才能達(dá)到。而且由于環(huán)境不穩(wěn)定,酸漿的酸度就不容易控制,造成生產(chǎn)的酸漿豆腐品質(zhì)不穩(wěn)定。另一方面,酸漿在自然發(fā)酵過程中,除有益菌外,還有許多腐敗雜菌的存在,從而會(huì)導(dǎo)致所生產(chǎn)的酸漿豆腐貨架期短[9]。若將酸漿的生產(chǎn)由自然發(fā)酵改為純種發(fā)酵,將會(huì)解決以上兩方面的問題。

本研究是利用豆腐生產(chǎn)后剩余的黃漿水加適量碳源為培養(yǎng)基[10],通過平板涂布法從自然發(fā)酵黃漿水中分離乳酸菌,再以pH為指標(biāo)篩選出pH較低的菌株利用高效液相色譜法(HPLC)測菌株發(fā)酵液的乳酸量,最終篩選出產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)的菌株,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,生理生化實(shí)驗(yàn)以及16S rDNA序列分析鑒定其菌種,然后用該菌種進(jìn)行純種發(fā)酵制作成豆腐凝固劑進(jìn)行點(diǎn)制豆腐,以感官評(píng)分為指標(biāo),與自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐進(jìn)行比較[11],分析兩種豆腐的優(yōu)缺點(diǎn),旨在研究本文所篩菌株是否可以作為新型酸漿豆腐凝固劑進(jìn)行推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

食品級(jí)大豆 錦州新瑪特超市;黃漿水 酸漿豆腐制作過程中的副產(chǎn)物,實(shí)驗(yàn)室自制;黃漿水培養(yǎng)基 新鮮黃漿水添加2%葡萄糖;黃漿水固體培養(yǎng)基 黃漿水培養(yǎng)基添加2%瓊脂;AxyPrep細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒 Axygen,AP-MN-BT-GDNA-50;DNA凝膠回收試劑盒 上海桑尼生物科技有限公司;TaqDNA 聚合酶 上海桑尼生物科技有限公司;DNAmarker 上海桑尼生物科技有限公司。

FA2104N型分析天平 蘭州中西儀器;BOXUN立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JB-VS-1300超凈工作臺(tái) 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;PHS-3B精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;YH-3880樂創(chuàng)多功能料理機(jī) 錦州新瑪特超市;數(shù)碼生物顯微鏡 OLYMPUS;720型Thermal Cycler PCR儀、3730-XL型測序儀 美國ABI公司；5804R型離心機(jī) Eppendorf公司；Tanon2500凝膠成像系統(tǒng) 天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)黃漿水的制備 首先在實(shí)驗(yàn)室以醋酸為凝固劑點(diǎn)制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調(diào)pH6.0,37 ℃自然發(fā)酵72 h左右,待黃漿水pH降至3.8以下時(shí)為一代酸漿,由于一代酸漿未接種,酸漿在自然發(fā)酵過程中其內(nèi)菌種生長緩慢,故達(dá)到點(diǎn)豆腐所需酸度時(shí)間較長,后續(xù)實(shí)驗(yàn)黃漿水均發(fā)酵24 h。以一代酸漿為豆腐凝固劑點(diǎn)制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調(diào)pH6.0,接種3%一代酸漿,37 ℃自然發(fā)酵24 h為二代酸漿。以二代酸漿為豆腐凝固劑點(diǎn)制豆腐,留壓制豆腐后剩余的黃漿水200 mL,加2%葡萄糖,調(diào)pH6.0,接種3%二代酸漿,37 ℃自然發(fā)酵24 h為三代酸漿,如此可以消除醋酸對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響[12]。三代后的酸漿即可作為本實(shí)驗(yàn)所用的豆腐凝固劑,用三代后的酸漿點(diǎn)制豆腐后剩余的黃漿水即為本實(shí)驗(yàn)所用的黃漿水。自制黃漿水pH在5.4～5.8之間,在大豆蛋白的等電點(diǎn)附近,蛋白質(zhì)含量在0.9%～1.5%之間。

1.2.2 菌株篩選

1.2.2.1 初篩 采用平板涂布法,分離純化樣品中的細(xì)菌。將樣品以3%的接種量接入黃漿水培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng),37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。然后將富集培養(yǎng)的菌液稀釋成10-1～10-77個(gè)梯度,各取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋梯度樣品的0.1 mL涂布到含有2% CaCO3的黃漿水固體培養(yǎng)基[13]上,37 ℃恒溫發(fā)酵48 h。挑取溶鈣圈較大的菌落在滅菌后的黃漿水固體培養(yǎng)基上劃線分離,于37 ℃培養(yǎng)48 h,如此反復(fù)劃線分離2～3次,顯微鏡觀察各菌落形態(tài),直到確定為單菌落后編號(hào)[14]。

1.2.2.2 復(fù)篩 將編好號(hào)的菌株接種到黃漿水培養(yǎng)基中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,分別測各菌株的pH和產(chǎn)乳酸量。選擇pH較低的三株菌,利用HPLC法測其乳酸產(chǎn)量,選擇乳酸產(chǎn)量最多的一株菌進(jìn)行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體形態(tài),記錄結(jié)果。

1.2.2.3 產(chǎn)乳酸量的測定 用HPLC[15]法測定,色譜分析條件:色譜柱為WondaSil C18-WR(250 mm×4.6 mm,5 μL),色譜條件為:檢測波長210 nm,流動(dòng)相為乙腈∶pH2.0磷酸=10∶90,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量10 μL,流速0.8 mL/min。流動(dòng)相配制好后分別過0.45 μm濾膜待用。乳酸標(biāo)準(zhǔn)品制備:經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)后,將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到0.5、1、2、3、4 mg/mL五個(gè)梯度,4 ℃保存。樣品處理:將樣品于50 ℃超聲提取20 min,稀釋10倍后過0.22 μm濾膜待用。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 生理生化實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16],對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定,包括觀察菌體運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)、過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)以及各種糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等。

1.2.3.2 16S rDNA鑒定 細(xì)菌基因組DNA的提取:采用CTAB 法提取供試菌株基因組DNA。

細(xì)菌基因組PCR擴(kuò)增:引物設(shè)計(jì):27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL):上下游引物各1.5 μL,基因組DNA(20 ng/μL)1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTP 1 μL,超純水39 μL,Taq聚合酶 1 μL。確定PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,循環(huán)35次;72 ℃終延伸7 min,4 ℃保溫。反應(yīng)完成后,取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳檢測,確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。PCR產(chǎn)物的回收:PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收,具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。序列測定:取各個(gè)菌種純化后的PCR產(chǎn)物,使用測序儀ABI3730-XL進(jìn)行DNA測序。序列分析:用 NCBI Blast 程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI ribosomal RNA sequence(Bacteria and Archaea)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),得到與待測菌種序列相似性最大的菌種信息,即為16S rDNA的鑒定結(jié)果[17-18]。

1.2.4 菌株YQ336作為豆腐凝固劑的應(yīng)用

1.2.4.1 純種豆腐凝固劑的制作 將菌種YQ336接種于黃漿水培養(yǎng)基中37 ℃恒溫發(fā)酵24 h,即為純種酸漿豆腐凝固劑。

1.2.4.2 豆腐的制作工藝 將食品級(jí)大豆25 ℃下蒸餾水浸泡10～16 h,豆水比1∶10打漿,用100目尼龍篩布除渣并收集生豆?jié){,電磁爐煮沸后持沸5 min,當(dāng)豆?jié){溫度降至80～90 ℃時(shí),輕攪下徐徐加入純種酸漿豆腐凝固劑,直至出現(xiàn)均勻腦花,90 ℃養(yǎng)漿10 min后加熱煮沸1 min,將豆花倒入豆腐模具中1000 Pa壓強(qiáng)下壓制30 min成型[12]。

1.2.4.3 微生物檢驗(yàn) 分別按GB 4789.2-2010和GB 4789.3-2010方法測純種菌發(fā)酵漿與自然發(fā)酵酸漿的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。

1.2.4.4 感官評(píng)定 將純種豆腐凝固劑與自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐成品進(jìn)行色香味的粗比較。由10名感官鑒定人員對(duì)其色香味按百分制評(píng)分[12]。具體方法見表1。

表1 豆腐感官評(píng)定表Table 1 Tofu sensory evaluation table

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線采用 Excel2007制作,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0 進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(yàn)(p<0.05),數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Phylip 3.695軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

經(jīng)過挑取在黃漿水固體培養(yǎng)基上溶鈣圈較大的菌落,對(duì)其進(jìn)行純培養(yǎng),顯微鏡觀察發(fā)酵液中菌體形態(tài),直到確定為單菌落后,共選出10株產(chǎn)酸較多菌株,并進(jìn)行編號(hào)。

2.2 復(fù)篩

將初篩選出的10株菌接種于黃漿水培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,進(jìn)行pH測定,結(jié)果見表2。

由表2可以看出,經(jīng)24 h發(fā)酵后,菌株114、336、116的pH較低,與其他各組菌株pH差異顯著(p<0.05),因此,將這三株菌接種于黃漿水培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后,分別對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行乳酸含量的測定,乳酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1,乳酸標(biāo)樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,三菌株發(fā)酵液乳酸色譜圖見圖3～圖5。

表2 10株菌發(fā)酵24 h的pHTable 2 The pH of 10 strains fermented for 24 h

注:小寫字母不同表示各組之間pH呈顯著性差異(p<0.05)。

圖1 乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of lactic acid standard samples

圖2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of lactic acid standard sample

圖3 細(xì)菌114發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.3 Lactic acid chromatogram of bacteria 114 fermentation broth

圖4 細(xì)菌116發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.4 Lactic acid chromatogram of bacteria 116 fermentation broth

圖5 細(xì)菌336發(fā)酵液的乳酸色譜圖Fig.5 Lactic acid chromatogram of bacteria 336 fermentation broth

由圖1可以看出,乳酸標(biāo)樣出峰時(shí)間為2.776 min,根據(jù)乳酸標(biāo)樣各濃度梯度的峰面積做出如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=281.1X-124.4,R2=0.9998,結(jié)果表明這種色譜條件下測出的乳酸線性關(guān)系很好。根據(jù)三株菌色譜圖的峰面積計(jì)算出其產(chǎn)乳酸量見表3。

表3 三株菌發(fā)酵液的乳酸含量Table 3 The lactic acid content of fermentation broth of three strains

注:小寫字母不同表示各組之間產(chǎn)乳酸量呈顯著差異(p<0.05)。

從表3可以看出,菌株336的產(chǎn)乳酸量顯著高于其他兩株菌，為24.48 g/L,是劉冬梅[19]等人測定干酪乳桿菌在泡菜液中發(fā)酵24 h后產(chǎn)乳酸量13.64 g/L的1.79倍。

2.3 形態(tài)特征

通過油鏡觀察,菌株336大小為(0.7～1.1 μm)×(2.0～4.0 μm),呈桿狀或長桿狀,細(xì)胞分裂后的排布方式為鏈狀,革蘭氏染色結(jié)果為陽性,無芽孢,不運(yùn)動(dòng),其菌落大小為1～3 mm,呈乳白色圓形低凸不透明,邊緣整齊,表面光滑有光澤。菌株形態(tài)特征見圖6,菌株鏡檢特征見圖7。

圖6 菌株336的菌落特征Fig.6 The colony characteristics of strain 336

圖7 菌株336的革蘭染色形態(tài)(100×)Fig.7 Gram stain morphology of strain 336(100×)

2.4 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,菌株336的生理生化鑒定結(jié)果見表4。

從表4可以看出,菌株336不運(yùn)動(dòng),不含過氧化氫酶,不能產(chǎn)生硫化氫,不能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,不能分解明膠,15～45 ℃范圍內(nèi)均能生長,能利用大多數(shù)糖進(jìn)行發(fā)酵。

表4 菌株生理生化特性Table 4 Strain physiological and biochemical characteristics

注:+:陽性;-:陰性。

2.5 16S rDNA鑒定

原核生物的核糖體DNA有23S、16S和5S 3種,由于16S rDNA 的信息量大,序列大小適中(15 kbp),因而被選為生物進(jìn)化過程的標(biāo)尺,用于生物的系統(tǒng)分類,是目前所知系統(tǒng)發(fā)育研究中最好的標(biāo)記。目前,細(xì)菌學(xué)家普遍認(rèn)為,當(dāng)16S rDNA 序列同源性高于97%時(shí),可以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種[20]。

經(jīng)16S rDNA鑒定,菌株336的16S rDNA序列全長為1483 bp,經(jīng)Genbank比對(duì)與Lactobacilluscasei相似性達(dá)到99%。利用Phylip 3.695軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,菌株YQ336與Lb.caseiNR_113333.1親緣關(guān)系最近,結(jié)果如圖8所示。

圖8 利用 16S rDNA序列進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

結(jié)合其菌體的群體形態(tài)特征、個(gè)體形態(tài)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及菌株的16S rDNA 序列比對(duì),確定細(xì)菌336為干酪乳桿菌,命名為LactobacilluscaseiYQ336,現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏編號(hào)為CGMCC No. 12796。

2.6 純種菌發(fā)酵漿與自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)豆腐品質(zhì)的比較

2.6.1 微生物檢驗(yàn) 自然發(fā)酵酸漿的微生物檢驗(yàn)結(jié)果為細(xì)菌總數(shù)6.4×109cfu/mL,大腸菌群檢出為4 cfu/100 mL。純種發(fā)酵酸漿的微生物檢驗(yàn)結(jié)果為細(xì)菌總數(shù)5.2×109cfu/mL,大腸菌群未檢出。

2.6.2 感官評(píng)價(jià) 10名感官鑒定人員對(duì)兩種豆腐的色、香、味進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果見表5。

表5 兩種豆腐的感官評(píng)分Table 5 The sensory evaluation scores of the two tofu types

注:小寫字母不同表示同行感官評(píng)分之間差異顯著(p<0.05)。

由表5可知,用兩種酸漿點(diǎn)制出的豆腐其色澤均偏白,有明顯豆香味無明顯酸味,塊形完整軟硬適宜,質(zhì)地較細(xì)膩,較有彈性表面不粘,細(xì)膩爽滑彈性好,斷面整齊表面光滑。純菌發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐總感官評(píng)分結(jié)果略高于自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐,但是兩種豆腐的各項(xiàng)感官評(píng)分結(jié)果均無顯著差異(p>0.05)。說明純種酸漿發(fā)酵豆腐既擁有傳統(tǒng)酸漿豆腐獨(dú)特的色香味,又無有害菌存在,綠色健康,保質(zhì)期更長,可以作為新型酸漿豆腐凝固劑并廣泛使用。

3 結(jié)論

利用黃漿水添加少量葡萄糖為培養(yǎng)基,通過平板涂布法和高效液相色譜法,經(jīng)過初篩、復(fù)篩、菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析等步驟,從自然發(fā)酵豆腐黃漿水中分離純化出一株產(chǎn)乳酸能力強(qiáng)的干酪乳桿菌YQ336,該菌37 ℃恒溫發(fā)酵24 h可產(chǎn)乳酸24.48 g/L,pH可達(dá)3.55。然后利用其純種發(fā)酵制成豆腐凝固劑點(diǎn)制豆腐,與自然發(fā)酵酸漿點(diǎn)制的豆腐進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)前者感官評(píng)分優(yōu)于后者,但差異不顯著(p>0.05)。此外,自然發(fā)酵酸漿中有大腸桿菌和腐敗菌存在[9],導(dǎo)致生產(chǎn)的酸漿豆腐保質(zhì)期短且存在危害人體健康的隱患,而純種發(fā)酵酸漿不含腐敗菌,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對(duì),本文篩選出的干酪乳桿菌YQ336純種發(fā)酵酸漿可以作為一種新型豆腐凝固劑并廣泛使用。

[1]李里特. 大豆加工與應(yīng)用[M]. 北京:化學(xué)出版社,2003.

[2]劉力. 豆腐酸漿中乳酸菌的分離鑒定、代謝研究及高密度培養(yǎng)[D].廣州:華南理工大學(xué),2015.

[3]李娟. 黃漿水的綜合開發(fā)利用[D].濟(jì)南:山東輕工業(yè)學(xué)院,2012.

[4]Xijun Chai,Yongli Mi,Po-Lock Yue,et al. Bean curd wastewater treatment by membrane separation[J]. Separation and Purification Technology,1999,15(2):175-180.

[5]王國良. 酸漿野生菌發(fā)酵黃漿水生產(chǎn)天然凝固劑的研究[D]. 濟(jì)南:山東輕工業(yè)學(xué)院,2005.

[6]呂博,黎晨晨,劉寧,等. 雙菌發(fā)酵黃漿水制備豆腐凝固劑培養(yǎng)條件優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技,2015(2):212-216.

[7]C G Vinderola,P Mocchiutti,J A Reinheimer. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products[J]. J Dairy Sci,2002,85(3):721-729.

[8]王愛偉,孫冰潔.酸漿豆腐廢水中發(fā)酵假絲酵母的研究[J].中國釀造,2009(10):44-46.

[9]喬支紅,閆佳,陳虹,等. 酸漿標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)工藝的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(12):162-164.

[10]趙貴麗,羅愛平,廖婭凡,等. 酸漿最適自然發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué),2013,34(17):201-204.

[11]王榮榮,王家東,周麗萍,等. 豆腐凝固劑的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2006(1):78-79.

[12]張影,劉志明,劉衛(wèi),等. 酸漿豆腐的工藝研究[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2014(4):21-23,26.

[13]華鶴良. 乳酸菌的分離鑒定及其抗菌肽與發(fā)酵性能研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2014.

[14]劉晶. Viili中乳酸菌的分離及其胞外多糖的研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[15]郭子好,方華,夏志生,等. 反相高效液相色譜法測定發(fā)酵豆粕中的乳酸含量[J]. 飼料工業(yè),2014,S1:121-123.

[16]R. E. 布坎南. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

[17]烏日娜. 內(nèi)蒙古傳統(tǒng)酸馬奶中乳桿菌的分離鑒定及16S rDNA序列同源性分析[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[18]K H Wilson,R B Blitchington. Human colonic biota studied by ribosomal DNA sequence analysis[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62(4):2273-2278.

[19]劉冬梅,吳暉,余以剛,等. 高效液相色譜法對(duì)泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分離和測定[J]. 現(xiàn)代食品科技,2007(8):74-76.

[20]Kolbert C P,Persing D H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens[J].Current Opinion in Microbiology,1999,2(3):299-305.

IsolationandidentificationofLactobacilluscaseiintofuacidpulpanditsapplicationastofucoagulant

YEQing1,XUYun-he2,ZHANGLi-li1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0094-06

2017-04-05

葉青(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：18741650927@163.com。

*通訊作者:張莉力(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：lilyzhang1977@163.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301499)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014022052)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014022046)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.019