湖南省油茶炭疽病病原鑒定*

李 河 李 楊 蔣仕強(qiáng) 劉君昂 周?chē)?guó)英

(森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004)

湖南省油茶炭疽病病原鑒定*

李 河 李 楊 蔣仕強(qiáng) 劉君昂 周?chē)?guó)英

(森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長(zhǎng)沙 410004)

【目的】 研究湖南省油茶炭疽病病原，為該病害的防控提供依據(jù)?！痉椒ā?采集湖南省長(zhǎng)沙、株洲、瀏陽(yáng)、永州、懷化、常德、常寧等油茶主產(chǎn)區(qū)9個(gè)樣地的典型油茶炭疽病葉，分離純化葉片病健交界處的真菌菌株，觀察菌株在(PDA)培養(yǎng)基上的菌落、分生孢子及附著孢的形態(tài)特征，確定為炭疽屬真菌。進(jìn)一步對(duì)炭疽屬菌株進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，確定油茶炭疽病病原菌菌株。對(duì)獲得病原菌的rDNA-ITS、CAL 和 GAPDH 3個(gè)基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，得到的基因序列與GenBank 中已有模式炭疽屬菌株序列按照3個(gè)基因一致的順序拼接后采用PAUP和MrBayes 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)?！窘Y(jié)果】 從湖南省9個(gè)采樣地共分離獲得62株炭疽屬菌株，致病性測(cè)試表明這62株菌均能對(duì)油茶嫩葉和果致病，但不同菌株的發(fā)病時(shí)間具有一定差異； 根據(jù)形態(tài)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，最終明確湖南省油茶炭疽病的病原種類(lèi)?！窘Y(jié)論】 湖南省油茶炭疽病的病原菌包含果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、膠孢炭疽菌、山茶炭疽菌和哈銳炭疽菌5種炭疽屬真菌，其中果生炭疽菌分布范圍最廣，分離率最高，達(dá)到64.5%。

油茶； 炭疽??； 病原菌

Abstract： 【Objective】The filamentous fungi,Colletotrichumspp., are found in all five continents and are capable of causing severe diseases in the important plants such asCamelliaoleifera(oil-tea trees). The pathogen causes defoliation, as well as necrotic spots on fruits. In recent years, the disease is rapidly spreading in the oil-tea trees producing areas of southern China. The objective of this study is to identify the pathogen causing stem and leaf anthracnose on oil-tea trees in Hunan, and to provide a basis for disease control and resistance breeding. 【Method】Infected leaves were collected from Changsha, Zhuzhou, Liuyang, Yongzhou, Huaihua, Changde and Changning City, in Hunan Province and the fungi were isolated and purified from the diseased border of leaves on acidified potato dextrose agar (PDA) plate. Identification of the pathogen was based on morphology of colony and conidial, pathogenicity tests. Isolates were characterized by colony morphology, conidial characteristics under 28 ℃ in dark. The rDNA-ITS，CAL and GAPDH region of isolates were amplified and sequenced. PAUP and MrBayes software were used to analyze the data of ITS-CAL-GAPDH sequences．【Result】 The result showed that a total of 62 colletotrichum strains were isolated from oil tea plants in 9 oil-tea plantations of Hunan provinces. Pathogenicity test showed that all of the isolates could infect oil-tea leaves and fruit, with different time in the onset of disease symptom. The multilocus sequence analysis, together with a critical examination of the phenotypic characters, revealed five previously described species. 【Conclusion】The typical anthracnose symptoms of oil-tea leaves in Hunan Province were described in this study. Based on the morphology and multiple gene sequences characters, the 62 isolates were identified asC.fructicola,C.siamense,C.gloeosporioides,C.horiiandC.camelliae. Among them,C.fructicolahad the highest isolated rate that was accounted for 64.5%.

Keywords： oil tea trees； anthracnose； pathogen

油茶(Camelliaoleifera)是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種，廣泛分布于我國(guó)南方14 個(gè)省(市、自治區(qū))。炭疽屬(Colletotrichum)真菌能夠侵染油茶樹(shù)造成落葉、落花、落果，經(jīng)濟(jì)損失巨大。油茶樹(shù)的炭疽病病原菌——膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)(周仲銘， 1990； 袁嗣令等， 1997； 楊光道等， 2004； 段琳等， 2005)是廣義膠孢炭疽菌，即Arx(1957)和Sutton(1992)所定義的膠孢炭疽菌復(fù)合群(C.gloeosporioidescomplex)。形態(tài)學(xué)特征和寄主范圍是區(qū)別炭疽菌種間關(guān)系的重要依據(jù)，但這些特征因寄主、培養(yǎng)條件的不同會(huì)在一定范圍內(nèi)變化。Weir等(2012) 通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法確定了膠孢炭疽菌復(fù)合群中22個(gè)合格種和1個(gè)亞種，其中包括Cannon等(2008)所描述的狹義膠孢炭疽菌附加模式種。湖南省油茶栽培面積廣，油茶炭疽病危害嚴(yán)重。本研究擬采用多基因位點(diǎn)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法并結(jié)合形態(tài)學(xué)研究，明確湖南省油茶炭疽病原菌種類(lèi)，以期為該病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集及病原菌的分離

從湖南省長(zhǎng)沙、株洲、瀏陽(yáng)、永州、懷化、常德、常寧等油茶主產(chǎn)區(qū)9個(gè)樣地采集油茶樹(shù)上的典型炭疽病葉450份。采用組織分離法和(或)單孢法分離菌株， 在4 ℃和-80 ℃溫度下各保存1份。

1.2致病性測(cè)定

油茶葉片和果實(shí)經(jīng)酒精表面消毒后，將各菌株分生孢子配制成濃度為 1×105個(gè)·mL-1，采用有傷和無(wú)傷2種方式接種油茶嫩葉鋸齒狀葉緣(油茶自然林中，葉緣炭疽病發(fā)生率較其他部位高； 葉緣蠟質(zhì)層和角質(zhì)層較薄，接種后發(fā)病時(shí)間較短)和有傷接種油茶果實(shí)。對(duì)照采用無(wú)菌水處理，每個(gè)菌株設(shè)6個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)箱中28 ℃、12 h 光照/12 h黑暗保濕培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)是否發(fā)病以及顯癥時(shí)間。進(jìn)一步對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行再分離，觀察分離菌株是否與原接種菌株相同(黃俊斌等， 1999)。

1.3病菌形態(tài)學(xué)及產(chǎn)孢

病菌在 PDA 平板上28 ℃培養(yǎng)5天后，用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣處打孔，取菌塊至新的 PDA 平板上培養(yǎng)，每株 3個(gè)重復(fù)，28 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng) 5天后測(cè)量菌落直徑并記錄菌落形態(tài)特征。病菌在PD液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)3天后，統(tǒng)計(jì)每種菌的分生孢子產(chǎn)生率并測(cè)量50個(gè)分生孢子和附著胞的大小，描述其形態(tài)特征。

1.4菌株DNA提取、基因選擇、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

用無(wú)菌牙簽刮取約0.5 g菌絲，采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。對(duì)所有菌株的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)和鈣調(diào)蛋白基因(CAL)3個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，具體操作方法參見(jiàn)Weir等(2012)。相應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物和退火溫度見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序由上海博尚生物技術(shù)有限公司完成(Caietal., 2009)。

表1 選擇的基因引物和退火溫度Tab.1 Sequence of the primers and annealing temperature used in this study

1.5系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

對(duì)測(cè)定的序列在 GenBank 中進(jìn)行Blast比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果初步確定歸屬，選用Sharma等(2013)、Cannon等(2012)和 Weir等(2012)等炭疽菌模式菌株的序列與本研究分離純化獲得的菌株序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。利用 ClustalX 1.83(Thompsonetal., 1997)軟件進(jìn)行比對(duì)分析。利用BioEdit 7.0.5.3(Hall， 1999)校正，采用PAUP*4.0 beta10(Swofford， 2002)以最大簡(jiǎn)約法(maximum parsimony, MP)和MrBayes v.3.1.2(Ronquistetal., 2003)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，所有堿基賦予相同權(quán)重，自舉檢驗(yàn)(bootstraping)重復(fù)1 000次以獲得各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1病原菌分離及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

從湖南省9個(gè)采樣地油茶炭疽病葉上共分離、純化獲得真菌156株，通過(guò)菌落、菌絲和分生孢子等形態(tài)特征，確定炭疽屬真菌62株。在基于ITS-CAL-GPDH多基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(圖1)中，分離自湖南省9個(gè)不同采樣地的62株油茶炭疽菌以非常高的支持率聚為5個(gè)進(jìn)化分支， 這些分支又分別位于2個(gè)Clade中。其中，40個(gè)菌株以高支持率(Bootstrap=95%、后驗(yàn)概率值為1.00)與C.fructicola模式菌株和權(quán)威菌株構(gòu)成的進(jìn)化分支、9個(gè)菌株以高支持率(Bootstrap=86%、后驗(yàn)概率值1.00)與C.siamense模式菌株構(gòu)成的進(jìn)化分支以及5個(gè)菌株以高支持率(Bootstrap=100%、后驗(yàn)概率值為1.00)與C.gloeosporioides模式菌株構(gòu)成的進(jìn)化分支位于CladeⅠ中。3個(gè)進(jìn)化分支中，C.fructicola與C.siamense親緣關(guān)系較近，與之前報(bào)道的油茶炭疽病菌C.gloeosporioides的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。另外，有5個(gè)菌株以86%的Bootstrap值和后驗(yàn)概率值為1.00與C.camelliae模式菌株構(gòu)成進(jìn)化分支以及3個(gè)菌株以100%的Bootstrap值和后驗(yàn)概率值為1.00與C.horii模式菌株構(gòu)成進(jìn)化分支，這2個(gè)分支位于Clade Ⅱ中。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，湖南省9個(gè)不同采樣地62個(gè)油茶炭疽病菌的2種建樹(shù)方法均以非常高的支持率聚為5個(gè)進(jìn)化分支，分別代表5個(gè)分類(lèi)單元且可以歸為2個(gè)Clade，這說(shuō)明湖南省的油茶炭疽病菌主要有2個(gè)進(jìn)化方向。另外，C.fructicola分布范圍非常廣，9個(gè)采樣地中有8個(gè)樣地都分離得到了該菌，分布地包括湖南懷化、常德、板塘、馬家河、天際嶺、瀏陽(yáng)、新寧和攸縣，共分離獲得40個(gè)菌株，占總分離菌株的64.5%，為優(yōu)勢(shì)菌；C.siamense則在6個(gè)樣地中分離得到，包括湖南板塘、常德、天際嶺、瀏陽(yáng)、懷化和馬家河，共獲得9個(gè)菌株，占總分離菌株的14.5%，為次要菌株； 5株C.gloeosporioides，占總分離菌株的8.1%，分布在云田、常德和懷化3個(gè)采樣地； 5株C.camelliae，占總分離菌株的8.1%，分布在瀏陽(yáng)和攸縣2個(gè)采樣地； 3株C.horii，占總分離菌株的4.8%，只在湖南板塘樣地分離獲得。

2.2菌株致病性測(cè)定

通過(guò)回接油茶嫩葉及果實(shí)進(jìn)行致病性測(cè)定，結(jié)果表明這62個(gè)菌株均能引起油茶炭疽病癥，但部分不同的菌株間顯癥時(shí)間有一定差異(表2)。62個(gè)菌株回接油茶嫩葉和果實(shí)出現(xiàn)的癥狀與自然狀態(tài)下的油茶炭疽病癥狀一致： 病葉初期為褐色斑點(diǎn)，然后逐漸變成黑褐色病斑，有時(shí)可見(jiàn)橘黃色分生孢子堆，病斑有隆起的輪紋，邊緣有1條暗褐色或暗紅色的隆起線(xiàn)； 植株活體接種的病葉后期病斑中心呈灰白色，密生許多分生孢子盤(pán)。通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證這62株炭疽屬真菌均是油茶炭疽病病原菌。

表2 62個(gè)菌株對(duì)油茶葉及果實(shí)的致病性測(cè)定①Tab.2 Pathogenicity of 62 isolates to leaves and fruits of oil-tea trees

① +:致病。 根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析劃分5種菌株類(lèi)型。+:Pathogenic. Five types of strains were classified according to phylogenetic analysis.

圖1 炭疽病菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of Colletotrichum species isolated from oil-tea tree * 表示模式菌株； 括號(hào)中的數(shù)字表示菌株數(shù)量。*Type culture； Data in brackets is the quantity of strains.

2.3形態(tài)學(xué)特征

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，62個(gè)菌株共劃分為果生炭疽菌(C.fructicola)、暹羅炭疽菌(C.siamense)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、山茶炭疽菌(C.camelliae)和哈銳炭疽菌(C.horii)5種類(lèi)型菌株。2.3.1 果生炭疽菌 菌落特征： 在PDA 培養(yǎng)基上，菌落厚重濃密，棉絮狀，淺灰色至深灰色，圓形，規(guī)則完整，邊緣顏色稍淺一些，氣生菌絲絨毛狀，菌落背面黑色素沉積，灰白色至黑褐色，分生孢子堆淺黃色；5天平均生長(zhǎng)速率為10.68 mm·d-1。

形態(tài)特征： 營(yíng)養(yǎng)菌絲透明，光滑，有隔膜，分枝； 厚垣孢子未發(fā)現(xiàn)； 分生孢子盤(pán)未見(jiàn)，剛毛未發(fā)現(xiàn)； 分生孢子直，無(wú)隔膜，圓柱狀或橢圓形，兩端鈍圓或一端略尖，光滑，無(wú)色，單孢，大小為(16.2±0.9) μm×(5.5±0.7) μm； 分生孢子附著胞近圓形，褐色，邊緣完整； 附著胞通常單個(gè)或多個(gè)，淺棕色至深棕色，球狀，圓柱狀或紡錘狀，極少數(shù)為不規(guī)則狀，大小為(9.3 ± 1.67) μm× (5.8 ± 0.9) μm。在PDA平板培養(yǎng)后期可見(jiàn)有性態(tài)(圖2)。這些特征與果生炭疽菌特征一致(Prihastutietal., 2009)。

圖2 果生炭疽菌Fig.2 Colletotrichum fructicolaA.油茶葉無(wú)傷接種癥狀； B.油茶葉有傷接種癥狀； C.油茶果有傷接種癥狀； D，E.PDA培養(yǎng)基上的菌落(正面，反面)； F.分生孢子； G，H.附著胞; I.附著胞萌發(fā)形成侵染釘(絲)； J.包囊被； K.子囊； L.子囊孢子。標(biāo)尺=10 μm。 A. Symptom on no-wounded oil-tea leaf; B. Symptom on wounded oil-tea leaf; C. Symptom on wounded oil-tea fruit; D,E.Colony on PDA(upper, reverse); F. Conidia;G,H. Appressoria; I. Germinated appressoria developed infection peg(hypha); J. Peridium; K. Asci; L. Ascospores. Scale bar=10 μm.

2.3.2 暹羅炭疽菌 菌落特征： 在PDA培養(yǎng)基上，菌絲呈輻射生長(zhǎng)，菌落圓形，初期為白色，后逐漸變?yōu)闇\灰色； 氣生菌絲由白色漸變?yōu)樯罨疑q狀； 菌落背面淺灰色至淺黃色，中心顏色深，邊緣顏色淺；5天平均生長(zhǎng)速率為 11.0 mm·d-1。

形態(tài)特征： 分生孢子為單胞，直、圓柱狀，無(wú)色，光滑，兩端鈍圓或一端鈍圓，另一端稍尖，分生孢子大小為(15.6±1.12) μm×(4.93±0.53) μm； 分生孢子附著胞單個(gè)或呈簇狀分布，淺棕色到深棕色，卵圓形，近球形或短圓柱形，部分輕微不規(guī)則形，大小為(9.62±1.8) μm×(5.84±0.93)μm(圖3)。這些特征與果炭疽菌特征一致(Prihastutietal., 2009)。

圖3 暹羅炭疽菌Fig.3 Colletotrichum siamenseA.油茶葉無(wú)傷接種癥狀； B.油茶葉有傷接種癥狀； C.油茶果有傷接種癥狀； D，E.PDA培養(yǎng)基上的菌落(正面，反面)； F.分生孢子； G，H.附著胞; I.附著胞萌發(fā)形成侵染釘(絲)； J.分生孢子萌發(fā)后芽管可繼續(xù)形成新的分生孢子。標(biāo)尺=10 μm。 A. Symptom on no-wounded oil-tea leaf; B. Symptom on wounded oil-tea leaf; C. Symptom on wounded oil-tea fruit; D，E.Colony on PDA(upper, reverse); F. Conidia;G,H. Appressoria; I. Germinated appressoria developed infection peg(hypha); J. Germinated conidia developed new conidia. Scale bar=10 μm.

2.3.3 膠孢炭疽菌 菌落特征： 在PDA培養(yǎng)基平板上，菌落圓形，規(guī)則； 菌落形態(tài)主要有2種： 一種氣生菌絲厚重濃密，淺灰色至深灰色，棉絮狀； 另一種菌絲稀疏，中心黃褐色而邊緣白色。菌落背面橄欖灰； 未見(jiàn)剛毛； 5天平均生長(zhǎng)速率為 11.5 mm·d-1。

形態(tài)特征： 營(yíng)養(yǎng)菌絲透明，光滑，有隔膜，分枝； 分生孢子堆橘紅色，分生孢子直、圓柱狀，兩端鈍圓或一端略尖，無(wú)色，光滑，有油球, 大小為(14.7±1.3) μm×(5.3±0.64) μm。分生孢子附著胞通常單個(gè)或散生，近橢圓形，淺褐色，邊緣完整，大小為(8.47±1.41) μm×(5.95±0.86)μm(圖4)。這些特征與膠炭疽菌特征一致(Cannonetal., 2008)。

圖4 膠孢炭疽菌Fig.4 Colletotrichum gloeosporioidesA.油茶葉無(wú)傷接種癥狀； B.油茶葉有傷接種癥狀； C.油茶果有傷接種癥狀； D,E. PDA培養(yǎng)基上的菌落(正面，反面)； F.分生孢子； G.萌發(fā)的分生孢子； H,K.附著胞; L.附著胞萌發(fā)形成侵染釘。標(biāo)尺=10 μm。 A. Symptom on no-wounded oil-tea leaf; B. Symptom on wounded oil-tea leaf; C. Symptom on wounded oil-tea fruit; D，E.Colony on PDA(upper, reverse); F. Conidia; G. Germinated conidia； H,K. Appressoria; L. Germinated appressoria developed infection peg(hypha). Scale bar=10 μm.

2.3.4 山茶炭疽菌 菌落特征： 在PDA培養(yǎng)基上，菌落近似圓形，邊緣平整，氣生菌絲白色漸變?yōu)榛疑藁?，稀疏?背面開(kāi)始為白色，然后中心灰至黑；5天平均生長(zhǎng)速率為7.06 mm·d-1。

形態(tài)特征： 分生孢子無(wú)色、光滑，單孢，長(zhǎng)橢圓形或圓柱形，兩端圓或一端略粗，另一端稍尖，大小為(16.2±2.4) μm×(5.4±0.78) μm； 附著胞形狀不規(guī)則，棍棒狀，圓齒，淺裂，褐色至黑褐色，單個(gè)，支鏈，鏈狀； 大小為(9.82±2.1) μm×(7.1±1.94)μm(圖5)。這些特征與山茶炭疽菌特征一致(Weiretal., 2012)。

圖5 山茶炭疽菌Fig.5 Colletotrichum camelliae A.油茶葉無(wú)傷接種癥狀； B.油茶葉有傷接種癥狀； C.油茶果有傷接種癥狀； D,E.PDA培養(yǎng)基上的菌落(正面，反面)； F.分生孢子； G.萌發(fā)的分生孢子； H.分生孢子萌發(fā)后芽管可繼續(xù)形成新的分生孢子； I,K.附著胞; L.附著胞萌發(fā)形成侵染釘。 標(biāo)尺=10 μm。 A. Symptom on no-wounded oil-tea leaf; B. Symptom on wounded oil-tea leaf; C. Symptom on wounded oil-tea fruit; D，E.Colony on PDA(upper, reverse); F. Conidia;G. Germinated conidia； H. Germinated conidia developed new conidia;I,K.Appressoria; L. Germinated appressoria developed infection peg(hypha). Scale bar=10 μm.

2.3.5 哈銳炭疽菌 菌落特征： 在PDA培養(yǎng)基上，菌落邊緣規(guī)則，形態(tài)均勻，氣生菌絲較薄，棉花狀，灰色到灰黑色； 菌落背面中央呈褐色，邊緣灰白色，隨菌齡增長(zhǎng)菌落顏色變深，可產(chǎn)生同心輪紋； 5天平均生長(zhǎng)速率為10.34 mm·d-1。

形態(tài)特征： 分生孢子堆橙色；分生孢子直、柱形或長(zhǎng)橢圓形，表面光滑，兩端鈍圓，無(wú)色，單孢，大小為(18.0±3.5) μm×(5.2±0.67) μm。附著胞短圓柱形，一般輪廓均勻或不規(guī)則裂，大小為(9.8±2.4) μm×(6.6±1.2) μm(圖6)。這些特征與哈銳炭疽特征一致(Weiretal., 2010)。

圖6 哈銳炭疽菌Fig.6 Colletotrichum horii A.油茶葉無(wú)傷接種癥狀； B.油茶葉有傷接種癥狀； C.油茶果有傷接種癥狀； D，E.PDA培養(yǎng)基上的菌落(正面，反面)； F.分生孢子； G，H.附著胞； H.附著胞萌發(fā)后可繼續(xù)形成新的附著胞； J，K.附著胞萌發(fā)形成侵染釘(侵染絲)。 標(biāo)尺=10 μm。 A. Symptom on no-wounded oil-tea leaf; B. Symptom on wounded oil-tea leaf; C. Symptom on wounded oil-tea fruit; D，E.Colony on PDA(upper, reverse); F. Conidia;G，H. Appressoria； I. Germinated appressoria developed a new appressoria; J，K. Germinated appressoria developed infection peg(hypha). Scale bar=10 μm.

3 討論

通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合多基因序列特征，鑒定出引起湖南省油茶炭疽病5種病原菌，分別是果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、膠孢炭疽菌、山茶炭疽菌和哈銳炭疽菌。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這5種病原菌可以歸為2個(gè)Clade。CladeⅠ包括果生炭疽菌、暹羅炭疽菌和膠孢炭疽菌 3個(gè)分類(lèi)單元，CladeⅡ包括山茶炭疽菌和哈銳炭疽菌2個(gè)分類(lèi)單元，說(shuō)明湖南省油茶炭疽病菌主要有2個(gè)進(jìn)化方向，且每個(gè)方向又存在遺傳分化現(xiàn)象。

果生炭疽菌最初描述源自咖啡豆(coffee berries)上的分離物 (Prihastutietal., 2009)，該菌在生物學(xué)和地理學(xué)上都差異較大。其模式種為MFLU090228，該菌株現(xiàn)保存為ICMP 18581。筆者于2014年報(bào)道了該菌是油茶的致病菌，并廣泛分布在我國(guó)幾乎所有油茶產(chǎn)區(qū)(李河等， 2014)。本研究從湖南省油茶炭疽病葉上分離獲得40株果生炭疽菌，形態(tài)特征與模式菌株相似(Prihastutietal., 2009)，菌株數(shù)量占總分離菌株的64.5%，包括8個(gè)樣品采集地，說(shuō)明該病菌分布范圍非常廣。

暹羅炭疽菌是由Prihastuti等(2009)定名的，其模式種為MFLU 09230，該菌株現(xiàn)保存為ICMP 18578。有研究者則認(rèn)為暹羅炭疽菌是一個(gè)復(fù)合種(Sharmaetal.,2015)。Weir等(2012)研究了30株暹羅炭疽菌的代表性菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)它們形成了一個(gè)無(wú)法再區(qū)分的單系分離枝。Liu等(2016)也認(rèn)為暹羅炭疽菌不存在生殖隔離、地理和寄主植物的基因流障礙，不是復(fù)合種。本研究中，筆者從湖南省6個(gè)樣地中分離得到暹羅炭疽菌菌株，形態(tài)特征與模式菌株相似(Prihastutietal., 2009)。 6個(gè)樣地包括湖南板塘、常德、天際嶺、瀏陽(yáng)、懷化和馬家河，共有9個(gè)菌株，占總分離菌株的14.5%，說(shuō)明該菌分布范圍較廣。

在先前的研究中大多數(shù)植物炭疽病病原菌或寄生菌是膠孢炭疽菌，但自從該菌指代模式種的全基因測(cè)序公布后，發(fā)現(xiàn)其寄主范圍較小，許多熱帶水果植物炭疽病均不是由膠孢炭疽菌引起的(Phoulivongetal., 2010)。目前報(bào)道的寄主主要包括柑橘(Citrusreticulata)、檸檬(Citruslimon)、榕樹(shù)(Ficusmicrocarpa)、芒果(Mangiferaindica)、葛根(Puerarialobata)、葡萄(Vitisvinifera)等(符丹丹， 2014)。本研究共分離獲得5株膠孢炭疽菌，形態(tài)特征與模式菌株相似(Cannonetal., 2008)，菌株數(shù)量占總分離菌株的8.1%，分布在云田、常德和懷化3個(gè)采樣地，該病菌數(shù)量較少，分布范圍有限。

山茶炭疽菌最早的記錄是斯里蘭卡的茶葉炭疽病菌(Massee，1899)，目前將其作為茶樹(shù)褐枯病的病原菌廣泛使用(Weiretal., 2012)。我國(guó)科學(xué)家早期定名油茶炭疽病原菌就是山茶炭疽菌(袁嗣令等， 1963； 翁月霞等， 1982； 王敬文， 1985； 賀正興等， 1985)，后來(lái)又改為膠孢炭疽菌(周仲銘， 1990； 袁嗣令等， 1997)。本研究從湖南省共分離獲得5株山茶炭疽菌，形態(tài)特征與模式菌株相似(Massee，1899)，菌株數(shù)量占總分離菌株的8.1%，菌株數(shù)量較少且只分布在瀏陽(yáng)和攸縣2個(gè)采樣地，分布范圍小。

哈銳炭疽菌是Weir等(2010) 研究中國(guó)、日本和新西蘭的柿樹(shù)(Diospyroskaki)炭疽病病原菌后定名的，依據(jù)ITS，EFla 和GPDH基因序列，可將其區(qū)分為一個(gè)明確的種，自此柿樹(shù)炭疽病的病原菌被正式確定為柿樹(shù)炭疽菌，并被廣泛使用 (Xieetal., 2010; Kwonetal., 2013； 余賢美等， 2015； 郗慧， 2015)。哈銳炭疽菌沒(méi)有寄主專(zhuān)化性，謝柳(2010)研究發(fā)現(xiàn)其能夠侵染香蕉(Musanana)和西葫蘆(Cucurbitapepo)產(chǎn)生典型癥狀。本研究中，共分離獲得3株哈銳炭疽菌，形態(tài)特征與模式菌株相似(Weiretal., 2010)，菌株數(shù)量占總分離菌株的4.8%，只在湖南板塘樣地分離獲得，數(shù)量和分布范圍均最小，但這是哈銳炭疽菌能引起油茶炭疽病的首次報(bào)道。

目前我國(guó)已有1種植物上有多種炭疽菌種類(lèi)作為病原菌同時(shí)被侵染的報(bào)道。符丹丹等(2013)報(bào)道中國(guó)蘋(píng)果炭疽病的病原有7種，分別是C.alienum、C.fructicola、C.gloeosporioides、C.nymphaeae、C.siamense和C.orientalis。王玉春等(2015)報(bào)道的中國(guó)主要茶區(qū)茶樹(shù)炭疽菌有3種，分別是C.camelliae、C.fructicola和C.siamense。湖南省油茶種植面積廣泛，是我國(guó)油茶種植的核心地區(qū)，本研究鑒定出湖南省油茶5種炭疽病原菌，豐富了對(duì)油茶炭疽病原種類(lèi)的認(rèn)識(shí)。對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的油茶炭疽病仍需要進(jìn)行深入研究，以期全面了解其病原種類(lèi)、分布規(guī)律以及遺傳變異機(jī)制，為我國(guó)制定有針對(duì)性的病害防治策略提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

分別獲得湖南省油茶炭疽病的病原菌5種，分別是果生炭疽菌、暹羅炭疽菌、膠孢炭疽菌、山茶炭疽菌和哈銳炭疽菌，其中果生炭疽菌分布范圍最廣，分離率最高，達(dá)到64.5%。

段 琳,楊光道,束慶龍, 等.2005.油茶果皮顏色對(duì)炭疽病的抗性的影響. 經(jīng)濟(jì)林研究, 23(2):9-12.

(Duan L, Yang G D, Shu Q L,etal. 2005. Relationship of peel color with resistance to anthracnose in oil teaCamellia. Nonwood Forest Research, 23(2):9-12. [in Chinese])

符丹丹,莊杰麗,張 榮,等. 2013.蘋(píng)果炭疽病病原菌ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及遺傳多樣性分析. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),40(3):231-236.

(Fu D D, Zhuang J L, Zhang R,etal. 2013. Optimization of ISSR- PCR reaction system and genetic diversity analysis ofColletotrichumspecies causing bitter rot of apple. Acta Phytophylacica Sinica, 40(3):231-236. [in Chinese])

符丹丹.2014.中國(guó)蘋(píng)果炭疽病病原菌的遺傳多樣性.西安： 西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文.

(Fu D D.2014. Pathogenetic diversity ofColletotrichumspp. on apple in China. Xi’an: PhD thesis of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry. [in Chinese])

賀正興,何美云,廖正乾,等.1985.油茶炭疽病菌對(duì)油茶花果的侵染及早期防治研究.湖南林業(yè)科技,12(1):20-27.

(He Z X, He M Y, Liao Z Q,etal. 1985.Camelliaanthracnose ofCamelliafruit and early prevention and treatment of infection. Hunan Forestry Science & Technology, 12(1):20-27. [in Chinese])

黃俊斌,趙純森,周茂繁.1999.三種藥用植物根腐病的病原鑒定.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),18(3):212-213.

(Huang J B, Zhao C S, Zhou M F.1999. Identification of root rot disease son three species of medicinal plant. Journal of Huazhong Agricultural University, 18(3):212-213. [in Chinese])

李 河, 周?chē)?guó)英, 徐建平,等.2014. 一種油茶新炭疽病原的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 41(5): 602-607.

(Li H, Zhou G Y, Xu J P,etal. 2014. Pathogen identification of a new anthracnose ofCamelliaoleiferain China based on multiple-gene phylogeny. Acta Phytophylacica Sinica, 41(5): 602-607.[in Chinese])

王玉春,郝心愿,黃玉婷,等.2015.中國(guó)主要茶區(qū)茶樹(shù)炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué).中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),48(24):4924-4935.

(Wang Y C, Hao X Y, Huang Y T,etal.2015. Phylogenetic Study ofColletotrichumspecies associated withCamelliasinensisfrom the major tea areas in China. Scientia Agricultura Sinica, 48(24):4924-4935. [in Chinese])

王敬文.1985.油茶炭疽病菌(Colltotrichumcamelliae)分生孢子的自身抑制作用. 植物生理學(xué)通訊,21(1):25-27.

(Wang J W. 1985. Self inhibitory effect of the spores ofColltotrichumcamelliaefromCamelliaoil. Plant Physiology Communication, 21(1):25-27.[in Chinese])

翁月霞,張常青,趙漢明,等.1982.油茶春梢炭疽病的研究. 林業(yè)科學(xué),18(3):289-295.

(Weng Y X, Zhang C Q, Zhao H M,etal.1982. The role of spring shoots lesions in anthracnose disease ofCamelliaoleifera. Scientia Silvae Sinicae, 18(3):289-295.[in Chinese])

郗 慧.2015.我國(guó)柿樹(shù)炭疽病調(diào)查、鑒定及其防治研究.洛陽(yáng)： 河南科技大學(xué)碩士學(xué)位論文.

(Xi H. 2015. Investigation isolating identification and chemical control of anthracnose from persimmon in China. Luoyang: MS thesis of Henan University of Science and Technology. [in Chinese])

謝 柳.2010. 哈銳炭疽菌的分類(lèi)和侵染特征的研究.杭州:浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文.

(Xie L.2010. Study on Infection characteristics and species identification ofColletotrichumhorii. Hangzhou: MS thesis of Zhejiang University. [in Chinese])

楊光道,束慶龍,段 琳,等. 2004.主要油茶品種對(duì)炭疽病的抗性研究. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),31(4):480-483.

(Yang G D, Shu Q L, Duan L,etal. 2004.Resistance of main cultivars of oil tea toColletotrichumgloeosporioides. Journal of Anhui Agricultural University, 31(4):480-483.[in Chinese])

余賢美,侯長(zhǎng)明,王 潔,等.2015.山東牛心柿炭疽病菌的分離鑒定及致病性.林業(yè)科學(xué), 51(4):126-133.

(Yu X M, Hou C M, Wang J,etal. 2015. Identification of pathogen causing beef heart persimmon anthracnose in Shandong and its pathogenicity. Scientia Silvae Sinicae, 51(4):126-133.[in Chinese])

袁嗣令,張能唐,翁月霞,等.1963.油茶炭疽病的研究.植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2(3):253-262.

(Yuan S L, Zhang N T, Weng Y X,etal.1963. The anthracnose disease ofCamelliaoleosa(Lour.) rehd. Acta Phytophylacica Sinica, 2(3): 253-262.[in Chinese])

袁嗣令,邵力平,李傳道.1997.中國(guó)喬、灌木病害.北京:科學(xué)出版社,42.

(Yuan S L, Shao L P, Li C D. 1997.Chinese arbor and shrub diseases. Beijing: Science Press, 42.[in Chinese])

周仲銘.1990. 林木病理學(xué).北京:中國(guó)林業(yè)出版社, 117-119.

(Zhou Z M. 1990. Forest pathology. Beijing: China Forestry Publishing House, 117-119.[in Chinese])

Arx J A. 1957. Die arten der gattungColletotrichumCda. Phytopathologische Zeitschrift, 29(1): 413-468.

Cai L, Hyde K D, Taylor P W J,etal. 2009.A polyphasic approach for studyingColletotrichum. Fungal Diversity, 39(2): 183-204.

Cannon P F, Buddie A G, Bridge P D. 2008. The typification ofColletotrichumgloeosporioides. Mycotaxon 104(2):189-204.

Cannon P F, Damm U, Johnston P R,etal. 2012.Colletotrichum-current status and future dirctions. Studies in Mycology,73:181-213.

Hall T A.1999. BioEdit: auser-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser, 41: 95-98.

Kwon J H, Kim J, Chio O,etal. 2013. Anthracnose caused byColletotrichumhoriion sweet persimmon in Korea: dissemination of conidia and disease development．Journal of Phytopathology, 161(7/8): 497-502.

Liu F, Wang M, Damm U,etal. 2016. Species boundaries in plant pathogenic fungi: aColletotrichumcase study. BMC Evolutionary Biology, 16:81.

Massee G. 1899. Tea and coffee diseases. Bulletin of Miscellaneous Informations of the Royal Botanical Gardens Kew,89-94.

Phoulivong S, Cai L, Chen H,etal. 2010.Colletotrichumgloeosporioidesis not a common pathogen on tropical fruits. Fungal Div, 44(1):33-43.

Prihastuti H, Cai L, Chen H,etal.2009. Characterisation ofColletotrichumspecies associated with coffee berries in northern Thailand. Fungal Diversity, 39(2): 89-109.

Ronquist F, Huelsenbeck J P. 2003. MrBayes 3: Bayesian phyloge netic inference under mixed models. Bioinformatics, 19(12): 1572-1574.

Sharma G, Pinnaka A K, Shenoy B D.2015.Resolving theColletotrichumsiamensespecies complex using ApMat marker. Fungal Diversity,71(1):247-264.

Sharma G, Kumar N, Weir B S,etal. 2013.The ApMat marker can resolveColletotrichumspecies:a case study withMangiferaindica. Fungal Diversity, 61(1):117-138.

Swofford D L.2002. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts,USA.Sutton B C. 1992. The genusGlomerellaand its anamorphColletotrichum∥Bailey J A, Jeger M J.Colletotrichumbiology, pathology and control. CAB International, Wallingford: 1-26.

Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F,etal.1997. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 25(24): 4876-4882.

Weir B S, Peter R, Johnston. 2010. Characterisation and neotypification ofGloeosporiumkakiHori asColletotrichumhoriinom. nov. Mycotaxon, 111(1):209-219.

Weir B S, Johnston P R, Damm U. 2012. TheColletotrichumgloeosporioidesspecies complex. Studies in Mycology, 73(1):115-180.

Xie L, Zhang J Z, Cai L,etal.2010. Biology ofColletotrichumhorii, the causal agent of persimmon anthracnose.Mycology,1(4): 242-253.

(責(zé)任編輯 王艷娜)

PathogenofOil-TeaTreesAnthracnoseCausedbyColletotrichumspp.inHunanProvince

Li He Li Yang Jiang Shiqiang Liu Jun’ang Zhou Guoying

(HunanProvincialKeyLaboratoryforControlofForestDiseasesandPestsKeyLaboratoryforNon-WoodForestCultivationandConservationofMinistryofEducation,CentralSouthUniversityofForestryandTechnologyChangsha410004)

S763.11

A

1001-7488(2017)08-0043-11

10.11707/j.1001-7488.20170806

2016-11-17；

2017-01-11。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31570641)； 教育部農(nóng)作物生物災(zāi)害綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部華東作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題。

*周?chē)?guó)英為通訊作者。