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    面包乳桿菌(Lactobacillus panis)C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析

    2017-10-11 11:36:05單成俊胡彥新夏秀東劉小莉章建浩周劍忠
    食品科學(xué) 2017年20期
    關(guān)鍵詞:陽離子乙酸乙酯緩沖液

    單成俊,胡彥新,夏秀東,劉小莉,李 瑩,王 英,章建浩,周劍忠,*

    面包乳桿菌(Lactobacillus panis)C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析

    單成俊1,2,胡彥新1,2,夏秀東2,劉小莉2,李 瑩2,王 英2,章建浩1,周劍忠1,2,*

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014)

    本實(shí)驗(yàn)對面包乳桿菌C-M2所產(chǎn)的新型細(xì)菌素進(jìn)行分離純化和特性研究。通過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步分離純化該細(xì)菌素。最終細(xì)菌素的比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg,純化倍數(shù)為79.8 倍,但回收率僅為0.35%。通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析,該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D,氨基酸序列為MVKKTSAV,它是一種新型的Ⅱ類細(xì)菌素。該細(xì)菌素具有廣泛的抑菌譜,可以抑制革蘭氏陽性和陰性的食品腐敗菌。該細(xì)菌素對熱和pH值穩(wěn)定,即使在121 ℃滅菌15 min,仍保留82.1%的抑菌活性,在pH 6條件下保留85.6%的抑菌活性。它能被多種蛋白酶失活,不能被脂肪酶和淀粉酶失活,這些結(jié)果表明該細(xì)菌素具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

    面包乳桿菌;細(xì)菌素;分離純化;抑菌特性

    細(xì)菌素由某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生,是一類對親緣關(guān)系相近的乳酸菌和非乳酸菌的革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌具有抑菌生物活性的蛋白質(zhì)或多肽,而產(chǎn)生菌多所產(chǎn)的細(xì)菌素具有免疫性[1-2]。由于細(xì)菌素能被人胃腸道分泌的蛋白酶降解,對人體無毒副作用,所以細(xì)菌素作為生物食品防腐劑比化學(xué)防腐劑更安全且天然,并且細(xì)菌素具有高效、耐高溫、無抗藥性等特點(diǎn),能較好地適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)[3-5]。因此,細(xì)菌素在天然食品防腐劑、飼料添加劑、益生素及開發(fā)新藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

    根據(jù)細(xì)菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量大小和穩(wěn)定性將細(xì)菌素分為四大類[6-7]:第I類nisin為代表的羊毛硫抗生素,一般為小分子(<5 kD)且熱穩(wěn)定的、含羊毛硫氨酸的多肽;第Ⅱ類是小分子、熱穩(wěn)定、不含羊毛硫氨酸的多肽(<10 kD),分為3個(gè)亞類:Ⅱa(如pediocin)、Ⅱb(如lactocin G)、Ⅱc(如lactocin B);第Ⅲ類熱敏感的大分子蛋白(>30 kD);第Ⅳ類復(fù)合細(xì)菌素,除蛋白質(zhì)外還包含其他化學(xué)成分(如碳水化合物、脂類等)。其中Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素作為生物防腐劑在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的最為廣泛[8-9]。

    到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有百余種乳酸菌素,但真正用于商業(yè)化的卻只有nisin和pediocin PA-1,其余僅限于實(shí)驗(yàn)室研究[10]。主要是因?yàn)槿樗峋氐男再|(zhì)(抑菌譜窄、pH值敏感性、熱穩(wěn)定性差)和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)[11-12]。因此篩選具有廣譜、耐酸堿、熱穩(wěn)定性好的乳酸菌細(xì)菌素仍然是目前的首要任務(wù)。

    本研究室從發(fā)酵玉米粉中分離得到一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌C-M2。本實(shí)驗(yàn)主要對該乳酸菌C-M2進(jìn)行16S rDNA分子鑒定、所產(chǎn)的細(xì)菌素進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及生物學(xué)特性的研究,以期為進(jìn)一步研究該細(xì)菌素的合成調(diào)控機(jī)制研究和在食品保鮮、生物防腐提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    乳酸菌C-M2(Lactobacillus panis C-M2)分離于發(fā)酵玉米粉,指示菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923和大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922均保藏于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所食品生物工程研究室。

    H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美國Sigma公司;MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(配方參考文獻(xiàn)[13]) 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、鹽酸等均為國產(chǎn)分析純;乙腈、三氟乙酸和甲醇均為色譜純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-900 AKTA蛋白純化系統(tǒng) 瑞典GE公司;1525高效液相色譜 美國Waters公司;FDU-1200冷凍干燥機(jī)日本Eaely公司;3K15冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司;SW-CJ-2G超凈工作臺、LRH-150生化培養(yǎng)箱 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DSX-280B立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器材廠。

    1.3 方法

    1.3.1 菌種的活化和培養(yǎng)流程[14]

    1.3.2 菌種的16S rDNA鑒定

    參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行分子鑒定。用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bacterial DNA Kit(200),OMEGA)提取菌株C-M2的DNA,以通用的DNA引物作為PCR的模板,反應(yīng)體系為25μL(表1)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,電壓為100 V,電泳結(jié)束后用凝膠成像儀觀察條帶,將觀察到的條帶用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收,并由上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

    表1 PCR擴(kuò)增體系及用量Table 1 Composition of PCR reaction system used in this study

    1.3.3 細(xì)菌素的提取

    采用乙酸乙酯萃取的方法[16]提取細(xì)菌素。將發(fā)酵上清液與乙酸乙酯等體積混合置于搖床(120 r/min,2 h),讓細(xì)菌素充分融入有機(jī)相中,隨后將混合液置于分液漏斗中靜置2 h、收集有機(jī)相(上層液體)、水相(下次液體)重復(fù)上述的操作,共萃取4 次。將4 次萃取獲得的有機(jī)相合并后在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得的細(xì)菌素粗提物用檸檬酸緩 沖液(20 mmol/L,pH 4)進(jìn)行復(fù)溶。以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法[17-18]測定其抑菌活性。

    1.3.4 細(xì)菌素的分離純化

    1.3.4.1 細(xì)菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析[19]

    將用乙酸乙酯萃取獲得的細(xì)菌素用0.22 μm的過濾膜過濾。配制20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液和含有1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液。首先用20 mmol/L、pH 4的檸檬酸緩沖液平衡層析柱,以2.0 mL/min的流速、3 mL的上樣量、含1 mol/L NaCl的檸檬酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。在280 nm波長處紫外檢測收集蛋白峰。將收集的各個(gè)蛋白峰4 ℃透析脫鹽后真空冷凍干燥。以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性。1.3.4.2 半制備高效液相色譜純化[20]

    取適量陽離子層析柱純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中(含有0.1%三氟乙酸)。色譜柱的條件設(shè)定為:平衡液A:超純水+0.1% TFA,洗脫液B:純乙腈+0.1% TFA,流速2.0 mL/min,上樣量0.1 mL,進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序?yàn)椋?~5 min,5% B;5~25 min,5%~25% B;25~35 min,25%~50% B;35~45 min,50% B;45~50 min,50%~0% B。在280 nm波長紫外檢測處收集蛋白峰,將收集的各個(gè)蛋白峰真空冷凍干燥除去乙腈。以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性。

    1.3.4.3 細(xì)菌素純度的檢測

    利用分析性高效液相色譜來檢測細(xì)菌素的純度是否達(dá)到95%以上。將經(jīng)過半制備高效液相色譜純化后獲得的活性峰樣品溶于5%的乙腈中(含有0.1%三氟乙酸),流速為0.8 mL/min,上樣量為20 μL,按照1.3.4.2節(jié)洗脫程序進(jìn)行洗脫。

    1.3.5 質(zhì)譜分析

    采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定該細(xì)菌素的分子質(zhì)量和氨基酸序列[21]。將通過冷凍干燥的半制備液相獲得細(xì)菌素樣品懸浮于含0.2%的甲酸的超純水中,以0.3mL/min的流速,上樣量為5μL,洗脫程序?yàn)樵?0min內(nèi)乙腈體積分?jǐn)?shù)從5%升到35%。一級質(zhì)譜在正離子模式下進(jìn)行m/z 300~1 800全掃描,通過DDA(dependent acquisition mode)收集數(shù)據(jù)。二級質(zhì)譜采用CID(collision-induced dissociation)捕捉二級質(zhì)譜中的b和y離子,通過Peaks 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

    1.3.6 細(xì)菌素效價(jià)的測定

    面包乳桿菌細(xì)菌素效價(jià)的測定按照參考文獻(xiàn)[22-23]的方法,采用二倍稀釋法,將發(fā)酵上清液用pH 5.0的檸檬酸緩沖液進(jìn)行二倍稀釋,以金黃色葡萄球菌為指示菌,采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法,吸取100 μL進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),用對指示菌顯示沒有抑菌圈的最高稀釋濃度定義為一個(gè)活力單位(AU),稀釋濃度的倒數(shù)就是細(xì)菌素的效價(jià)(AU/mL)。計(jì)算公式如下所示:

    式中:Y為細(xì)菌素的效價(jià)/(AU/mL);n為對指示菌顯抑菌圈的孔數(shù);x為每孔中的細(xì)菌素液加樣體積/μL。

    1.3.7 細(xì)菌素蛋白含量的測定

    采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[24]測定細(xì)菌素蛋白含量。

    1.3.8 抑菌譜的測定

    采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法,將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素用于測定面包乳桿菌C-M2的抑菌譜。

    1.3.9 細(xì)菌素對溫度、pH值、蛋白酶敏感性的測定

    將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別置于37、60、80、100 ℃水浴鍋中水浴30 min和121 ℃處理15 min,考察不同溫度對細(xì)菌素抑菌活性的影響。

    將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別溶于pH 2~5的檸檬酸緩沖液(20 mmol/L)和 pH 6~9 的磷酸緩沖液(20 mmol/L),然后置于37 ℃水浴鍋中4 h后,測定其殘留活性??疾觳煌膒H值對細(xì)菌素抑菌活性的影響。

    將經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析純化后獲得的細(xì)菌素分別溶于各種酶的最適pH值的緩沖液中。按質(zhì)量濃度1 mg/mL分別加入蛋白酶K(20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,pH 7)、胃蛋白酶(20 mmol/L的醋酸鹽緩沖液,pH 2)、胰蛋白酶(20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,pH 7)、木瓜蛋白酶(20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,pH 7)、脂肪酶(20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,pH 7)、α-淀粉酶和β-淀粉酶(20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,pH 6),在37 ℃水浴2 h后,將上述酶處理過的細(xì)菌素溶液于100 ℃水浴5 min使酶失活??疾觳煌N類的酶對細(xì)菌素抑菌活性的影響。上述經(jīng)過各種處理后的細(xì)菌素溶液采用瓊脂擴(kuò)散牛津杯法測定其抑菌活性,其中以金黃色葡萄球菌為指示菌,以未做任何處理的細(xì)菌素溶液作為空白對照。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,數(shù)據(jù)的結(jié)果表示為 ±s。采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳酸菌菌種的鑒定

    圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR-amplifi ed 16S rDNA

    用1.0%的瓊脂糖凝膠對菌株C-M2的16S rDNA產(chǎn)物進(jìn)行電泳,在1 500 bp附近獲得一條熒光條帶(圖1),回收的DNA片段經(jīng)測序后,共獲得1 485 個(gè)堿基,將該序列通過NCBI中BLAST進(jìn)行同源性分析,發(fā)現(xiàn)該菌與面包乳桿菌Lactobacillus panis strain C17(基因登錄號:EF412978.1)同源性高達(dá)99%,因此可以把該菌鑒定為面包乳桿菌。

    2.2 細(xì)菌素的分離純化

    表2 細(xì)菌素的分離純化Table 2 Summary of purifi cation steps of the bacteriocin

    圖2 細(xì)菌素的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析圖譜Fig. 2 Ion-exchange chromatography of the bacteriocin on SP Sepharose fast fl ow column

    由于大多數(shù)乳酸菌細(xì)菌素帶正電并且在酸性條件下穩(wěn)定,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過乙酸乙酯粗提的細(xì)菌素由SP Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂分離后得到3個(gè)洗脫峰(圖2),S2和S3兩個(gè)洗脫峰相連,分離度很差,對金黃色葡萄球菌的抑制能力很差,故本實(shí)驗(yàn)不對此洗脫條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。而S1洗脫峰較窄且高、分離度較好,能與其他雜質(zhì)蛋白分開。并且S1洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好,故選擇S1洗脫峰做下一步的純化工作。經(jīng)過乙酸乙酯萃取和陽離子交換樹脂分離純化后,細(xì)菌素的比活力達(dá)到3 515.03 AU/mg,純化倍數(shù)為55.6倍,回收率為3.19%(表2)。由于該細(xì)菌素可以被陽離子交換樹脂吸附,說明該細(xì)菌素是一種帶正電的多肽[25]。

    圖3 lactocin C--MM2的半制備高效液相色譜圖Fig. 3 Semi-preparative HPLC chromatrogram of the bacteriocin

    反相高效液相色譜是根據(jù)分子疏水性的不同來達(dá)到分離抗菌肽的目的,具有靈敏度高、速度快、分辨率好,并且經(jīng)反相高效液相色譜分離得到的樣品可以直接進(jìn)行質(zhì)譜分析[26]。本實(shí)驗(yàn)將經(jīng)過陽離子純化后獲得的活性峰S1合并后用節(jié)流分子質(zhì)量為500 D透析袋透析除鹽、真空濃縮后通過半制備液相進(jìn)行分離純化后得到4 個(gè)洗脫峰(圖3),將4個(gè)洗脫峰合并、凍干后測定其活性,結(jié)果顯示H2洗脫峰對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最好。經(jīng)過分析液相分析H2,在9.5 min左右出現(xiàn)一個(gè)單峰(圖4),在其他時(shí)間沒有出現(xiàn)明顯的吸收峰,表明該樣品已為色譜純,并將該細(xì)菌素命名為lacocin C-M2。經(jīng)過半制備液相純化后的細(xì)菌素比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg,純化倍數(shù)為79.8 倍。

    圖4 lactocin C--MM2的反相高效液相色譜圖Fig. 4 Analytical RP-HPLC chromatogram of the bacteriocin

    在純化的過程中發(fā)現(xiàn),最終該細(xì)菌素的回收率非常低,僅有0.35%,回收率低主要的原因是該細(xì)菌素的提取采用有機(jī)溶劑乙酸乙酯萃取的方法,由于乙酸乙酯的極性較正丁醇小,采用該方法致使一部分細(xì)菌素殘留在發(fā)酵的上清液中導(dǎo)致提取率大幅降低,雖可以通過重復(fù)提取實(shí)驗(yàn)提高回收率,但前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著提取重復(fù)次數(shù)的增加,提取效率也在逐漸降低,為了降低工作量和實(shí)驗(yàn)成本,本實(shí)驗(yàn)只提取了4 次,導(dǎo)致回收率降低。又由于乙酸乙酯較正丁醇更容易從細(xì)菌素的混合液中除去且獲得細(xì)菌素純度較高,故本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取該細(xì)菌素。另外一個(gè)原因是通過陽離子交換樹脂純化,陽離子樹脂具有高度的選擇性,而細(xì)菌素在不同的pH值緩沖液中可能帶正電荷或負(fù)電荷以及所帶電荷的數(shù)量不同,并且現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的可以產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌,一般可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素,不同的細(xì)菌素在同一pH值條件下所帶電荷不同,而在實(shí)驗(yàn)過程中只會針對其中的一種細(xì)菌素進(jìn)行分離純化,導(dǎo)致部分細(xì)菌素不能吸附在陽離子柱上,除此之外,離子交換柱在純化的過程中還可以除去很大一部分不帶電的雜蛋白,進(jìn)而使回收率很低。后期可以通過優(yōu)化面包乳桿菌C-M2產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件和純化過程(比如找更合適提取該細(xì)菌素的有機(jī)溶劑)來提高該細(xì)菌素最終的回收率。除此之外,來源于半制備液相分離的組分H3也可以抑制金黃色葡萄球菌的生長,說明面包乳桿菌C-M2可以產(chǎn)生多種細(xì)菌素,這大大地增加了其開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。相類似的結(jié)果也出現(xiàn)在其他產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌中,例如Izquierdo等[27]從軟奶酪中分離的Enterococcus faecium WHE81、Yi Lanhua等[28]從江水白菜中分離的Lactobacillus coryniformis XN8都可以產(chǎn)生至少兩種細(xì)菌素。

    2.3 質(zhì)譜分析

    經(jīng)過高效液相色譜檢測后具有抑菌活性的細(xì)菌素樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析,得到一級質(zhì)譜圖(未列出),顯示該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D。對863.52 D的峰進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,得到二級質(zhì)譜圖(圖4)。通過Peaks 7.0軟件對該細(xì)菌素的二級質(zhì)譜片段進(jìn)行分析得出該細(xì)菌素的氨基酸序列為MVKKTSAV。序列的推斷過程見表3。將該細(xì)菌素的氨基酸序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information)進(jìn)行比對,未找到與該細(xì)菌素完全一樣的序列,說明該細(xì)菌素是一種新型的細(xì)菌素。

    圖5 細(xì)菌素的二級質(zhì)譜圖Fig. 5 Tandem mass spectrum of the bacteriocin

    表3 細(xì)菌素氨基酸序列的推斷Table 3 Predicted b-ion and y-ion fragments and sequence of the bacteriioocciinn

    2.4 lactocin C-M2的抑菌譜

    由表4可知,lactocin C-M2和大多數(shù)的乳酸菌細(xì)菌素具有相類似的特性,對與它們親緣關(guān)系較近的乳酸菌具有抑制作用[29],例如戊糖片球菌、植物乳桿菌、短乳桿菌、瑞士乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌。同時(shí)lactocin C-M2還可以抑制常見的致病菌和腐敗菌,如金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和沙門菌,可廣泛應(yīng)用于食品的防腐殺菌處理。尤其lactocin C-M2可以抑制單核細(xì)胞性李斯特菌的生長,說明lactocin C-M2具有Ⅱ類細(xì)菌素的特性。但是lactocin C-M2對供試的酵母菌和霉菌沒有抑制作用。

    表4 細(xì)菌素的抑菌譜Table 4 Antimicrobial spectrum of the bacteriocin

    2.5 lactocin C-M2對溫度、pH值、蛋白酶敏感性

    表5 細(xì)菌素對溫度、pH值、酶的敏感性Table 5 Effects of heat, pH and enzymes on antibacterial activity of the bacteriocin

    由表5可知,lactocin C-M2經(jīng)過各種蛋白酶處理后抑菌活性完全消失,但是該細(xì)菌素經(jīng)脂肪酶和淀粉酶處理后抑菌活性基本保持不變,說明lactocin C-M2是蛋白類抑菌物質(zhì),并且可以被蛋白酶降解而不會在體內(nèi)殘留,可以安全地應(yīng)用到食品的防腐方面。

    lactocin C-M2在酸性條件下(pH 2~6)抑菌活性比較穩(wěn)定,在pH 6的條件下,該細(xì)菌素仍保留85.6%的抑菌活性。但lactocin C-M2在堿性條件下抑菌活性喪失比較明顯,在pH 9的條件下,該細(xì)菌素只有初始抑菌活性的40%。結(jié)果顯示lactocin C-M2在酸性條件下抑菌活性升高,而在堿性條件下抑菌活性降低。這可能是有由于在極端pH值條件下,在強(qiáng)的分子內(nèi)靜電相互作用下誘導(dǎo)氨基和羧基基團(tuán)的解離,終導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而使該細(xì)菌素的活性降低[30]。

    lactocin C-M2在37、60、80、100 ℃條件下處理30 min后,抑菌活性保持在90%以上。即使在121 ℃滅菌15 min后,抑菌活性仍保留82.1%。說明細(xì)菌素lactocinC-M2具有良好的熱穩(wěn)定性。由于延長食品保質(zhì)期通常會采取加熱或者創(chuàng)造酸性、堿性環(huán)境的方法,以達(dá)到殺死或抑制腐敗微生物,而細(xì)菌素lactocin C-M2具有良好的穩(wěn)定性和耐酸堿性,該優(yōu)勢使得它在食品加工和食品的生物保鮮中均具有廣泛的應(yīng)用前景。由于lactocin C-M2具有小分子質(zhì)量、熱穩(wěn)定、不含羊毛硫氨酸、可以抑制單核細(xì)胞性李斯特菌的生長等特點(diǎn),因此lactocin C-M2屬于Ⅱ類細(xì)菌素。

    3 討 論

    目前,16S rDNA序列是編碼核糖體RNA小亞基16S rRNA的基因,是當(dāng)今細(xì)菌分類學(xué)中最常用且有效的分子分析方法。本實(shí)驗(yàn)中利用16S rDNA基因序列對從發(fā)酵玉米粉分離出來的一株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌C-M2進(jìn)行鑒定,最終鑒定該菌為面包乳桿菌。根據(jù)目前報(bào)道,盡管已經(jīng)成功的從各種材料中分離出很多面包乳桿菌,其功能也各式各樣,例如Grahame[31]發(fā)現(xiàn)Lactobacillus panis PM1可以產(chǎn)1,3-丙二醇,但是這是第一次發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)細(xì)菌素的面包乳桿菌。

    細(xì)菌素的分離純化與其特性研究密切相關(guān)。乳酸菌細(xì)菌素一般均帶有正電荷、疏水特性等特點(diǎn)。細(xì)菌素的初步分離方法可以采取鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和pH值吸附法等,進(jìn)一步純化方法有凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水相互作用層析,精度純化一般采用反相高效液相色譜。本實(shí)驗(yàn)采取乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和制備液相三步法成功的從菌株C-M2上清液中分理處細(xì)菌素lactocin C-M2,與張瑜[32]所分離細(xì)菌素的純化過程類似,同時(shí)也說明本實(shí)驗(yàn)分離的出細(xì)菌素是小分子質(zhì)量的細(xì)菌素。但細(xì)菌素最終純化倍數(shù)為79.8 倍,回收率為0.35%,說明純化過程中目的蛋白損失較大。今后應(yīng)繼續(xù)對該細(xì)菌素的分離純化條件進(jìn)行優(yōu)化,為將來的精細(xì)純化及應(yīng)用提供理論支持。將lactocin C-M2序列提交到APD數(shù)據(jù)庫(Antimicrobial Peptide Database)進(jìn)行比對,只找到與其相識度為38.46%和37.5%的抗菌肽Uperin 7.1和Fusaricidin A,說明該細(xì)菌素是一種新型抗菌肽。

    由于食品加工過程中對采用熱加工,所以細(xì)菌素對熱的穩(wěn)定性好壞是衡量其潛在應(yīng)用價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)。lactocin C-M2具有良好的熱穩(wěn)性,即使在121 ℃滅菌15 min后,抑菌活性仍保留82.1%,其熱穩(wěn)定性優(yōu)于pentocin LPEM818[8]。不同的細(xì)菌素適用的pH值范圍不同,大多數(shù)在酸性環(huán)境下抑菌活性較好。但在中性或堿性條件下,抑菌活性減弱或喪失。如nisin在低pH值條件下有很強(qiáng)的抑菌活性,但在pH 7以上時(shí),活性喪失。而lactocin C-M2在pH 9的條件下仍保留40.34%的抑菌活性,但該細(xì)菌素耐酸堿性不及步氏乳桿菌KLDS1.0364[33]所產(chǎn)的細(xì)菌素。同時(shí)與步氏乳桿菌KLDS1.0364所產(chǎn)的細(xì)菌素一樣,lactocin C-M2對供試的蛋白酶敏感,對非蛋白酶不敏感,說明其產(chǎn)生的類細(xì)菌素是蛋白類物質(zhì),具有較高的安全性。該細(xì)菌素對供試的大部分G+菌株和G-菌株均具有較強(qiáng)抑制作用,對多數(shù)致病菌和食品腐敗菌抑菌作用明顯,特別是對Listeria mouocytogeues和G-菌株較強(qiáng)的抑制作用,所以其具有作為食品生物防腐劑的潛在應(yīng)用價(jià)值。

    4 結(jié) 論

    面包乳桿菌C-M2分離于發(fā)酵玉米粉,其產(chǎn)生的細(xì)菌素(命名為lactocin C-M2)經(jīng)過乙酸乙酯萃取、陽離子交換層析和半制備液相三步成功的從菌株培養(yǎng)液中提取和純化出該菌所產(chǎn)的細(xì)菌素,最終該細(xì)菌素的比活力達(dá)到5 044.96 AU/mg,純化倍數(shù)為79.8 倍,回收率為0.35%。該細(xì)菌素的分子質(zhì)量為863.52 D,氨基酸序列為MVKKTSAV,并且是一種新的Ⅱ類細(xì)菌素。該細(xì)菌素具有廣泛的抑菌譜,它不僅可以抑制與它親緣關(guān)系較近的乳酸菌的生長,同時(shí)它還可以抑制革蘭氏陽性和陰性的致病菌。該細(xì)菌素對熱、pH值、淀粉酶和脂肪酶具有良好的穩(wěn)定性,但對多種蛋白酶敏感。綜上,面包乳桿菌C-M2所產(chǎn)的細(xì)菌素在食品保鮮和生物防腐具有良好的應(yīng)用前景。

    [1] MILIONI C, MARTíNEZ B, DEGL’INNOCENTI S, et al. A novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LpU4 as a valuable candidate for bio-preservation in artisanal raw milk cheese[J]. Dairy Science & Technology, 2015, 95(4): 479-494.

    [2] GáLVEZ A, ABRIOUEL, LóPEZ R L, et al. Bacteriocin[J].International Journal of Food Microbiology, 2007, 120(1): 51-70.

    [3] 武朋朋, 劉國榮, 暢曉淵, 等. 抗豬鏈球菌戊糖乳桿菌素的純化及特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 16(5): 121-126.

    [4] CLEVELAND J, MONTVILLE T J, NES I F, et al. Bacteriocins: safe,natural antimicrobials for food preservation[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 71(1): 1-20. DOI:10.1016/S0168-1605(01)00560-8.

    [5] 沈雷, 趙乙楨, 劉等. 清酒乳桿菌ZJ220產(chǎn)細(xì)菌素的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015, 15(7): 39-45. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.07.006.

    [6] MALDONADO-BARRAGáN A, CABALLERO-GUERRERO B, MARTíN V, et al. Purification and genetic characterization of gassericin E, a novel co-culture inducible bacteriocin from Lactobacillus gasseri EV1461 isolated from the vagina of a healthy woman[J]. BMC Microbiology, 2016, 16(1): 1.

    [7] HU M, ZHAO H, ZHANG C, et al. Purifi cation and characterization of plantaricin 163, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum 163 isolated from traditional Chinese fermented vegetables[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013,61(47): 11676-11682. DOI:10.1021/jf403370y.

    [8] 于雷雷, 王超, 施波, 等. 戊糖乳桿菌素pentocin LPEM818 的初步純化及特性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2013, 39(2): 17-23.

    [9] 吳軼, 貢漢生, 劉文麗, 等. 一株產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌的鑒定及其細(xì)菌素編碼基因的獲得[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(11): 110-113. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201511021.

    [10] LV X, HU P, DANG Y, et al. Purifi cation and partial characterization of a novel bacteriocin produced by Lactobacillus casei TN-2 isolated from fermented camel milk (Shubat) of Xinjiang Uygur Autonomous region, China[J]. Food Control, 2014, 43: 276-283.

    [11] DEEGAN L H, COTTER P D, HILL C, et al. Bacteriocins∶biological tools for bio-preservation and shelf-life extension[J].International Dairy Journal, 2006, 16(9)∶ 1058-1071. DOI∶10.1016/j.idairyj.2005.10.026.

    [12] SHARAFI H, MALEKI H, AHMADIAN G, et al. Antibacterial activity and probiotic potential of Lactobacillus plantarum HKN01∶ a new insight into the morphological changes of antibacterial compoundtreated Escherichia coli by electron microscopy[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2013, 23(2)∶ 225-236. DOI∶10.4014/jmb.1208.08005.

    [13] 胡盼. 酸駝奶中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離及細(xì)菌素特性[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

    [14] 胡彥新, 劉小莉, 王英, 等. 香腸乳桿菌(Lactobacillus farcimini) FMMM4產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵條件和培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2016,37(10): 255-259; 272. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.043.

    [15] 易蘭花. 西鄉(xiāng)漿水產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離及細(xì)菌素的純化[D].楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

    [16] 高鵬, 韓金志, 陸兆新, 等. 廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細(xì)菌素的提取和純化[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 160-166. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201611028.

    [17] CHEN C, CHEN X, JANG M, et al. A newly discovered bacteriocin from Weissella hellenica D1501 associated with Chinese Dong fermented meat (NanxWudl)[J]. Food Control, 2014, 42∶ 116-124.

    [18] 陳岑. 希臘魏斯菌D1501抑菌物質(zhì)研究及其作為保護(hù)性發(fā)酵劑在新型豆腐中的應(yīng)用[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

    [19] TAHIRI I, DESBIENS M, BENECH R, et al. Purification,characterization and amino acid sequencing of divergicin M35: a novel class IIa bacteriocin produced by Carno bacterium divergens M35.[J].International Journal of Food Microbiology, 2004, 97(2): 123-136.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2004.04.013.

    [20] H-KITTIKUM A, BISCOLA V, EL-GHAISH, et al. Bacteriocinproducing Enterococcus faecalis, KT2W2G isolated from mangrove forests in southern Thailand: purifi cation, characterization and safety evaluation[J]. Food Control, 2015, 54: 126-134.

    [21] LEE M H, LEE J, NAM Y D, et al. Characterization of antimicrobial lipopeptides produced by Bacillus sp. LM7 isolated from chungkookjang, a Korean traditional fermented soybean food[J].International Journal of Food Microbiology, 2016, 221: 12-18.

    [22] LIU G, REN L, SONG Z, et al. Purification and characteristics of bifi docin A, a novel bacteriocin produced by Bifi dobacterium animals BB04 from centenarians’ intestine[J]. Food Control, 2015, 50: 889-895. DOI:10.1016/j.foodcont.2014.10.049.

    [23] 胡盼. 酸駝奶中產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離及細(xì)菌素特性[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué), 2014.

    [24] 陸健. 蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005.

    [25] 李亞玲, 周志江, 韓燁, 等. 乳酸片球菌抑菌物質(zhì)細(xì)菌素的分離純化[J].食品科學(xué), 2008, 29(2): 271-274. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.02.054.

    [26] 王嘉琦. 一株植物乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化及其特性分析[D].楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2015.

    [27] IZQUIERDO E, MARCHIONI E, AOUDE-WEMER D, et al.Smearing of soft cheese with Enterococcus faecium WHE 81, a multi-bacteriocin producer, against Listeria monocytogenes[J]. Food Microbiology, 2009, 26(1): 16-20. DOI:10.1016/j.fm.2008.08.002.

    [28] YI L H, DANG J, ZHANG L H, et al. Purifi cation, characterization and bactericidal mechanism of a broad spectrum bacteriocin with antimicrobial activity against multidrug-resistant strains produced by Lactobacillus coryniformis XN8[J]. Food Control, 2016, 67: 53-62.DOI:10.1016/j.foodcont.2016.02.008.

    [29] WANNUM P, PIWAT S, TEANPAISAN R. Purification,characterization, and optimum conditions of fermencin SD11, a bacteriocin produced by human orally Lactobacillus fermentum SD11[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2016: 1-11.

    [30] JANICKE R. Protein stability and molecular adaptation to extreme conditions[J]. The FEBS Journal, 1991, 202(3)∶ 715-728.

    [31] GRAHAME D. Microbial production and characterization of 1,3-PDO,by a novel Lactobacillus panis Strain[D]. Canada, Saskatoon:University of Saskatchewan, 2012.

    [32] 張瑜. LS-8乳酸菌細(xì)菌素的分離純化[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2013.

    [33] 貢漢生, 孟祥晨, 劉紅娟. 一株布氏乳桿菌所產(chǎn)類細(xì)菌素的初步純化與部分特性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(2): 193-199.DOI:10.3969/j.issn.0253-2654.2008.02.007.

    Purifi cation and Characterization of the Bacteriocin Produced by Lactobacillus panis C-M2

    SHAN Chengjun1,2, HU Yanxin1,2, XIA Xiudong2, LIU Xiaoli2, LI Ying2, WANG Ying2, ZHANG Jianhao1, ZHOU Jianzhong1,2,*
    (1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. Research Institute of Agricultural Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

    The present study aimed to purify and characterize a novel bacteriocin produced by Lactobacil lus panis C-M2.The bacteriocin was purified through sequential ethyl acetate extraction, cation exchange chromatography and semipreparative high-performance liquid ch romatography (RP-HPLC). Finally, the specifi c activity reached 5 044.96 AU/mg and the purifi cation fold was 79.8, but the recovery was only 0.35%. The bacteriocin had a molecular mass of 863.52 D and its N-terminal sequence was MVKKTSAV as determined by LC-MS/MS, showing low similarity with other class II bacteriocins reported earlier. It showed a good stability to heat and pH and retained 82.1% of the original antibacterial activity even after exposure to 121 ℃ for 15 min and retained 85.6% of the original activity at pH 6. The bacteriocin could be totally inactivat e d after treatment with protease, but it was not sensitive to lipase or amylase. These results indicate the potential of the bacteriocin for application in food preservation.

    Lactobacillus panis; bacteriocin; purifi cation; antimicrobial activity

    10.7506/spkx1002-6630-201720004

    R996.1

    A

    1002-6630(2017)20-0020-07

    單成俊, 胡彥新, 夏秀東, 等. 面包乳桿菌(Lactobacillus panis) C-M2細(xì)菌素的分離純化及特性分析[J]. 食品科學(xué), 2017,38(20): 20-26. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720004. http://www.spkx.net.cn

    SHAN Chengjun, HU Yanxin, XIA Xiudong, et al. Purification and characterization of the bacteriocin produced by Lactobacillus panis C-M2[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 20-26. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720004. http∶//www.spkx.net.cn

    2016-11-14

    江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目(Y2015-29)

    單成?。?978—),男,博士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:chengjun_shan@163.com

    *通信作者:周劍忠(1965—),男,研究員,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:zjzluck@126.com

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