分子熒光差異加標(biāo)法快速測(cè)定蛋黃中VB2的含量

高向陽(yáng)，張 娜，郭楠楠，岳希舉，魏 龍

分子熒光差異加標(biāo)法快速測(cè)定蛋黃中VB2的含量

高向陽(yáng)，張 娜，郭楠楠，岳希舉，魏 龍

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程系，河南 鄭州 450064）

為建立一種快速、簡(jiǎn)便定量測(cè)定生物樣品中VB2的新型分析方法，以雞蛋黃為樣品，用分子熒光差異加標(biāo)法測(cè)定。結(jié)果表明：雞蛋黃樣品中VB2的含量為402 μg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.5%（n=6）；加標(biāo)回收率為92.0%～104%；檢出限為5.76×10-3μg/mL，定量限為1.92×10-2μg/mL。該法在實(shí)驗(yàn)條件完全相同的情況下測(cè)定，扣除了背景干擾，不需繪制工作曲線和過(guò)柱去雜質(zhì)，快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用，是適合VB2測(cè)定的新型分析技術(shù)。

分子熒光；差異加標(biāo)法；雞蛋黃；VB2

雞蛋黃含有豐富的ω-3不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[1-2]和VB2，ω-3不飽和脂肪酸可減少腦血栓的形成，有提高人體自身免疫的作用[3-4]。VB2又稱核黃素，紫外線照射下可光解為光黃素[5-6]，是動(dòng)物和人體維持正常機(jī)體功能的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因不會(huì)在人體蓄積，需及時(shí)通過(guò)蛋黃、牛奶、黃豆、酵母等膳食進(jìn)行補(bǔ)充。人體缺乏核黃素時(shí)，代謝容易發(fā)生障礙[7]，所以，蛋黃是人類良好的主要輔助食品。

目前，VB2的測(cè)定方法有核磁共振法[8-9]、高效液相色譜法[10-14]、化學(xué)發(fā)光法[15-18]、電化學(xué)法[19-20]、離子色譜法[21]、質(zhì)譜法[22-24]、超臨界流體色譜[25]、共振光散射法[26]、分光光度法[27]等。這些方法大多數(shù)儀器昂貴、成本較高，需要配制5～7 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，耗費(fèi)時(shí)間且存在作圖誤差；由于標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品試液本底背景常存在較大差異，若試液本底對(duì)測(cè)定信號(hào)產(chǎn)生無(wú)法排除的干擾，測(cè)定準(zhǔn)確度會(huì)降低；標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的溫度、濕度、大氣壓、儀器等測(cè)定條件與樣品試液測(cè)定時(shí)常有極大不同，當(dāng)用之前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定當(dāng)前的樣品結(jié)果時(shí)，試液與標(biāo)準(zhǔn)溶液無(wú)法實(shí)現(xiàn)同步同條件實(shí)時(shí)測(cè)定，不可避免會(huì)引入一定誤差。因此，標(biāo)準(zhǔn)曲線常需要重新繪制或者校正，過(guò)程繁瑣，給工作帶來(lái)不便；如果不能及時(shí)扣除不同樣品的不同本底，所有樣品使用同一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，樣品間的測(cè)定結(jié)果缺乏可比性。

分子熒光法靈敏度高，是一種痕量分析技術(shù)，但用于測(cè)定生物樣品中VB2時(shí)，有基體共存蛋白質(zhì)等背景的干擾[28-30]，因此，減少熒光污染、扣除環(huán)境因素和試液背景的干擾對(duì)準(zhǔn)確、快速測(cè)定VB2具有重要意義。分子熒光差異加標(biāo)法測(cè)定VB2鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，雞蛋黃基體成分復(fù)雜，定量分析時(shí)，無(wú)論是采用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法還是比較法，均易受到共存蛋白質(zhì)的干擾和各種熒光污染的影響，帶來(lái)一定的測(cè)定誤差。分子熒光差異加標(biāo)法是在完全相同的試液背景條件下加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液后測(cè)定被測(cè)物質(zhì)，能有效的扣除背景，消除基體熒光和可能光解等副反應(yīng)的干擾。該法操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確，成本較低，且無(wú)需繪制工作曲線和過(guò)柱除雜，工作效率得到極大提高，適用于基體較為復(fù)雜的蛋黃等生物樣品中VB2含量的測(cè)定，具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋，2016年11月購(gòu)于鄭州市好又多超市，及時(shí)處理 和測(cè)定。

VB2標(biāo)準(zhǔn)品（CAS編號(hào)83-88-5，純度≥99%） 上海金穗生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（食品級(jí)） 南寧龐博生物工程有限公司；低亞硫酸鈉（分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-SG 41-280A高壓蒸汽滅菌鍋 開封大河機(jī)電廠；970CRT熒光分光光度計(jì)、PXSJ-216離子計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SYZ-135型石英亞沸高純水蒸餾器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；BS-224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

10 g/L木瓜蛋白酶用2.5 mol/L乙酸鈉溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；20 g/100 mL低亞硫酸鈉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，保存于冰水浴中，4 h內(nèi)有效。25 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確稱取于真空干燥器中干燥24 h的VB2標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于2 L容量瓶中，加入2.4 mL冰乙酸和1.5 mL水，溶解后定容，移至棕色試劑瓶中，加少許甲苯于表面，4 ℃冰箱中保存。1 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：吸取25 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.00 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，避光保存于4 ℃冰箱。所用水為二次石英亞沸重蒸高純水。

1.3.2 樣品預(yù)處理

隨機(jī)取鮮雞蛋50 枚，用水清洗后，置于鍋中加熱煮沸10 min，冷卻后剝除蛋殼和蛋白，將蛋黃置于潔凈磁盤中用玻璃棒搗碎后，于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量。用瓷研缽研碎后充分混勻，此為熟雞蛋黃樣品，保存于磨口瓶中，置于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.3.3 VB2含量測(cè)定

稱取20 g（精確至0.000 1 g）熟雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，加0.1 mol/L鹽酸70 mL，混勻，用瓷坩堝扣蓋瓶口，于10.3×104Pa壓力鍋水解30 min，冷卻后用1 moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至 5.5，加3 mL 10 g/L木瓜蛋白酶溶液，39 ℃保溫酶解16 h，干濾紙過(guò)濾除雜后用pH 5.5的二次亞沸水定容至100 mL。取4 份10.00 mL過(guò)濾液分置于25 mL刻度比色管中，于第1份和第2份提取液中分別加1 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL和2.00 mL；第4份加入低亞硫酸鈉0.50 mL，將VB2還原為無(wú)熒光物質(zhì)作為背景空白，第3份不加標(biāo)準(zhǔn)溶液和低亞硫酸鈉，為原過(guò)濾定容試液。各管加水至15 mL后，加0.50 mL冰乙酸，加30 g/L高錳酸鉀溶液0.50 mL，混勻，放置2 min，氧化去雜質(zhì)，滴加3.0 g/100 mL的雙氧水溶液至褪色，振搖使多余氧氣逸出后，加水定容至25 mL，在完全相同條件下進(jìn)行3 次平行測(cè)定，檢驗(yàn)無(wú)可疑值后取平均值，按式（1）計(jì)算樣品中VB2的含量。

式中：w為樣品中VB2含量/（μg/g）；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V標(biāo)1、V標(biāo)2分別為第1份、第2份過(guò)濾液中加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL；I標(biāo)1、I標(biāo)2分別為第1份、第2份加標(biāo)過(guò)濾液的相對(duì)熒光強(qiáng)度；I樣、I0分別為第3份、第4份過(guò)濾液的相對(duì)熒光強(qiáng)度；m樣為取樣質(zhì)量/g；V樣1、V樣2分別為樣品過(guò)濾液定容總體積和測(cè)定時(shí)所用體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[28]選擇最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為440 nm和525 nm。

2.2 鹽酸體積的確定

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃5 份分置于250 mL錐形瓶中，分別加入0.1 mol/L鹽酸50、60、70、80、90 mL，攪拌均勻后，按1.3.3節(jié)方法水解、酶解、過(guò)濾、氧化去雜質(zhì)，定容至25 mL，平行測(cè)定3 次，取平均值，結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸體積對(duì)雞蛋黃樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig. 1 Effect of hydrochloric acid volume on relative fl uorescence intensity

由圖1可知，加入0.1 mol/L鹽酸70 mL進(jìn)行水解，雞蛋黃樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，為49.87。

2.3 酶解pH值的選擇

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，加入0.1 mol/L鹽酸70 mL，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行水解，水解液冷卻后，滴加1 moL/L氫氧化鈉溶液，分別調(diào)pH值為4.500、5.500、6.500、7.500、8.500。然后按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行酶解和測(cè)定，平行測(cè)定3 次，取平均值，結(jié)果見圖2。

圖2 pH值對(duì)雞蛋黃樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of pH on relative fl uorescence intensity

由圖2可知，酶解液pH 5.500時(shí)，測(cè)得的相對(duì)熒光強(qiáng)度最大，為49.97。實(shí)驗(yàn)選擇pH 5.500為最佳酶解條件控制酸度。

2.4 低亞硫酸鈉溶液加入的體積

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，按1.3節(jié)操作定容至100 mL后，分別置于6 個(gè)25 mL的比色管中加10.00 mL雞蛋黃過(guò)濾液，按1.3.3節(jié)方法氧化去除雜質(zhì)，分別加入0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL和0.60 mL 20 g/100 mL低亞硫酸鈉溶液，定容至25 mL，混勻后，平行測(cè)定3 次，取平均值，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

圖3 低亞硫酸鈉體積對(duì)雞蛋黃樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig. 3 Effect of Na2S2O4 volume on relative fl uorescence intensity

由圖3可知，10.00 mL雞蛋黃過(guò)濾液加入0.50 mL低亞硫酸鈉較為合適。

2.5 VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的確定

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃于250 mL錐形瓶中，按1.3.3節(jié)水解、酶解、過(guò)濾、定容后，分別置于8個(gè)25 mL試管中各加10.00 mL過(guò)濾液，在3、4、5、6、7、8號(hào)管中分別加入1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL 1 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)使用液，1號(hào)和2號(hào)管不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，以下按照1.3.3節(jié)方法操作，定容至25 mL混勻，各管平行測(cè)定3 次，取平均值，代入公式計(jì)算雞蛋黃VB2含量然后和GB/T 5009.85—2016《食品中核黃素的測(cè)定》[28]測(cè)定結(jié)果對(duì)照，如表1所示。

表1 雞蛋黃中VB2含量Table 1 Selection of optimal standard solution volumes added to analyte samples

由表1可知，加標(biāo)1.00、2.00 mL測(cè)得含量和國(guó)標(biāo)法結(jié)果最接近，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)使用液添加量1.00、2.00 mL為最佳差異加標(biāo)體積。

2.6 加標(biāo)回收率

稱取20.0 g（精確至0.000 1 g）雞蛋黃，按照1.3.3節(jié)方法操作，用1 μg/mL VB2進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，各加標(biāo)質(zhì)量濃度分別進(jìn)行3 次平行測(cè)定，由表2可知，樣品的加標(biāo)回收率為92.0%～104%。

表2 加標(biāo)回收率Table 2 Analyte recoveries from spiked yolk

2.7 檢出限和定量限

取0.1 μg/mL VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行11 次平行測(cè)定，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，按3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差得VB2檢出限為5.76×10-3μg/mL，按10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算的定量限為1.92×10-2μg/mL。

2.8 測(cè)定結(jié)果對(duì)照

按1.3.3節(jié)方法和國(guó)標(biāo)法[28]第一法對(duì)照分析，各進(jìn)行6 次平行測(cè)定，檢驗(yàn)無(wú)可疑值后，取平均值，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于1.5%；2 種方法按文獻(xiàn)[31]進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，結(jié)果表明：置信度為95%時(shí)，分子熒光差異加標(biāo)法和國(guó)標(biāo)法的精密度、平均值皆不存在顯著性差異。

表3 分子熒光加標(biāo)法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定雞蛋黃中VB2結(jié)果Table 3 Comparison of VB2contents in yolk determined by the developed method and the fi rst method described in the national standard

3 結(jié) 論

利用差異加標(biāo)新技術(shù)在最佳條件下測(cè)定雞蛋黃樣品中VB2含量為402 μg/100 g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%（n=6），加標(biāo)回收率為92.0%～104%，檢出限為5.76×10-3μg/mL，定量限為1.92×10-2μg/mL。該法與國(guó)標(biāo)法對(duì)照測(cè)定，樣品測(cè)定結(jié)果經(jīng)過(guò)F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)表明：2 種方法間的精密度和平均值均不存在顯著性差異。該方法只需用2個(gè)加標(biāo)質(zhì)量濃度不同的試液，在條件完全相同下測(cè)定同體積試液的發(fā)光信號(hào)，即可按公式快速獲得測(cè)定結(jié)果，無(wú)需繪制工作曲線和過(guò)柱去雜質(zhì)。差異加標(biāo)法扣除了樣品試液中背景發(fā)光值以及質(zhì)量濃度差異所可能帶來(lái)的干擾，克服了標(biāo)準(zhǔn)曲線法的諸多缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了待測(cè)試液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的同步實(shí)時(shí)測(cè)定，提高了測(cè)定準(zhǔn)確度和工作效率，簡(jiǎn)便、快速，是適合蛋黃等較為復(fù)雜生物樣品中VB2測(cè)定的新型分析技術(shù)，該技術(shù)不但適用于分子熒光分析，也適用于分子磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和原子熒光、原子發(fā)射光譜等其他定量分析發(fā)光體系，有較強(qiáng)的創(chuàng)新性、實(shí)用性和推廣應(yīng)用價(jià)值。

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Rapid Determination of Vitamin B2in Egg Yolks by Molecular Fluorescence Differential Standard Addition Method

GAO Xiangyang, ZHANG Na, GUO Nannan, YUE Xiju, WEI Long
(Department of Food Science and Engineering, Zhengzhou University of Science and Technology, Zhengzhou 450064, China)

This study aimed to establish a new rapid and simple method for the quantitative determination of riboflavin in biological samples, namely molecular fl uorescence differential standard addition method. The results showed that the ribofl avin content in yolks determined by the method was 402 μg/100 g with relative standard deviation (RSD) of less than or equal to 1.5% (n = 6). The recoveries of the analyte from spiked samples ranged between 92.0% and 104%. The limit of detection (LOD) of the method was 5.76 × 10-3μg/mL and the limit of quantitation (LOQ) was 1.92 × 10-2μg/mL. This method was tested under the same conditions without background interference and without the need to prepare a working curve and to remove impurities by column chromatography. It was rapid, accurate, simple, practical and suitable for the determination of vitamin B2in egg yolks.

molecular fl uorescence; differential standard addition method; egg yolks; vitamin B2

O657.3

A

1002-6630（2017）20-0318-04

高向陽(yáng), 張娜, 郭楠楠, 等. 分子熒光差異加標(biāo)法快速測(cè)定蛋黃中VB2的含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶ 318-321.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047. http∶//www.spkx.net.cn

GAO Xiangyang, ZHANG Na, GUO Nannan, et al. Rapid determination of vitamin B2in egg yolks by molecular fluorescence differential standard addition method[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 318-321. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047. http∶//www.spkx.net.cn

2017-01-13

鄭州市科技局新興產(chǎn)業(yè)研究與開發(fā)基金資助項(xiàng)目（153PXXCY186）

高向陽(yáng)（1949—），男，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)槭称钒踩焖俜治雠c檢驗(yàn)。E-mail：ndgaoxy@163.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720047