• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅鰭東方鲀組織蛋白酶L表達載體的構(gòu)建及表達結(jié)果驗證

    2017-10-11 11:36:02李妍鈺湯奇龍張魯嘉謝靜莉王文利
    食品科學 2017年20期
    關(guān)鍵詞:紅鰭蛋白酶菌落

    李妍鈺,湯奇龍,張魯嘉,謝靜莉,王文利,劉 源,3,*

    紅鰭東方鲀組織蛋白酶L表達載體的構(gòu)建及表達結(jié)果驗證

    李妍鈺1,湯奇龍1,張魯嘉2,謝靜莉2,王文利1,劉 源1,3,*

    (1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.華東理工大學生物工程學院,上海 200237;3.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院,上海 200240)

    紅鰭東方鲀味道鮮美,已從其體內(nèi)發(fā)掘了系列鮮味肽,但其形成機制尚未明確。組織蛋白酶L可通過降解肌原纖維蛋白及肌鈣蛋白發(fā)揮著重要的滋味形 成作用。為了探索其對紅鰭東方鲀呈味肽的形成機制,本研究通過查找NCBI數(shù)據(jù)庫得到一條全長為1 336 bp的紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的序列,從紅鰭東方鲀肌肉中提取RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板克隆,選擇pET-28a(+)作為表達載體、E. coli BL21作為重組工程菌進行克隆表達,成功得到大小為36 kD的重組組織蛋白酶L,并驗證了其可在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功克隆表達。本研究為進一步研究紅鰭東方鲀組織蛋白酶L酶學特性及其對滋味形成提供了理論支持。

    紅鰭東方鲀;組織蛋白酶L;呈味肽;大腸桿菌表達系統(tǒng)

    紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)屬鲀形目、鲀科、鲀屬,因其味道鮮美、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富,素有“百魚之首”的美稱,是河鲀的一種,深受消費者喜愛[1-2]。研究表明呈味肽是決定河鲀鮮美悠長滋味的決定性成分[3]。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對食品風味具有一定貢獻的分子質(zhì)量低于3 000 D的寡肽類[4-5]。目前已從大豆[6]、花生[7]、牛肉湯[8]、雞肉[9]、巴馬火腿[10]等多種食品中鑒定了42 種鮮味肽[11],其中13 種來自河鲀[3,12-14]。生物細胞中含有蛋白質(zhì)降解系統(tǒng),包括蛋白酶體、溶酶體組織蛋白酶、鈣質(zhì)蛋白酶、金屬蛋白酶等。在魚體內(nèi),學者普遍認為鈣蛋白酶和組織蛋白酶的協(xié)同作用對魚宰后肌肉蛋白質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用[15]。在pH值為酸性至中性的條件下,組織蛋白酶L可非?;钴S的參與降解肌球蛋白、α-非輔肌動蛋白、肌鈣蛋白T和I以及I型膠原蛋白[16-18],并且它降解肌球蛋白的能力是組織蛋白酶B的10 倍[19]。組織蛋白酶L在高溫條件下活性較高,Jia Airong等[20]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L是高溫條件下降解箭齒鰈比目魚肌肉的主要蛋白酶。組織蛋白酶有內(nèi)肽酶的活性[16],研究發(fā)現(xiàn)其與干腌火腿[21]、鹽水鴨[22]和干煙香腸[23]中具有呈味特性的氨基酸和小分子肽的形成有關(guān),在食品風味物質(zhì)形成中發(fā)揮了重要作用[24]。

    通過研究紅鰭東方鲀體內(nèi)對呈味肽形成具有重要作用的組織蛋白酶類,可以明確紅鰭東方鲀內(nèi)蛋白質(zhì)降解成為呈味肽的斷裂位點及其酶切位點,探索呈味肽的形成過程。本研究通過查找紅鰭東方鲀體內(nèi)全基因組序列得到組織蛋白酶L的全基因序列,將肌肉及肝臟中的提取的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,并作為模板克隆組織蛋白酶L。選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)克隆表達獲取組織蛋白酶L,從而為進一步分析其對呈味肽的形成提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    4 條2 a生紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)購于大連天正集團;E. coli BL21及pET-28a(+)為華東理工大學生物工程學院實驗室保存;限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NdeⅠ、T4連接酶 賽默飛世爾科技公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Avanti J-26XP冷凍離心機、T10 basic高速分散機、電泳儀 北京六一儀器有限公司;FP-6200熒光分光光度計、HDL型超凈工作臺、WD-9413B凝膠成相分析儀、HD-1核酸蛋白檢測儀、酶標儀 美國BioTek公司。

    1.3 方法

    1.3.1 引物設(shè)計

    根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的紅鰭東方鲀組織蛋白酶L(TrCTSL)的基因序列(登錄號:XM_003962503.2),全長1 336 個核苷酸編碼含335 個氨基酸的蛋白,5’(5’ UTR)有165 個核苷酸,3’(3’ UTR)有166 個核苷酸,由1 005 個核苷酸的開放閱讀框(ORF)可以推斷TrCTSL蛋白的分子質(zhì)量大約為36.87 kD。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴增TrCTSL及重組質(zhì)粒所用的引物。引物由上海捷瑞生物有限公司合成,實驗所用引物見表1。

    表1 構(gòu)建紅鰭東方鲀組織蛋白酶L表達載體所用引物序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used to construct recombinant vector TrCTSL

    1.3.2 紅鰭東方鲀總RNA提取

    參照GB/T 27624—2011《養(yǎng)殖紅鰭東方鲀鮮、凍品加工操作規(guī)范》對紅鰭東方鲀活體進行宰殺,并分別取4 條紅鰭東方鲀的肝臟及肌肉組織[19-20]。將肌肉與肝臟組織剪碎,取1 g放入于裝有200 μL RNA保存液的1.5 mL離心管中,于4 ℃過夜處理,使保存液充分浸潤組織。紅鰭東方鲀肌肉與肝臟中的總RNA提取方法參考華東理工大學生物工程實驗室建立的提取方法[25-26]。

    1.3.3 cDNA的合成及TrCTSL基因序列的擴增

    取出RNA樣品置于冰上,測定抽提RNA的濃度及純度。

    消化RNA:使用Promega公司DNA消化酶進行消化,反應(yīng)體系(10 mL):1 mg RNA,1 mL酶,1 mL 10×緩沖液,加適量DNase/RNase-free去離子水至反應(yīng)體系為10 mL。反應(yīng)條件:將反應(yīng)液置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后加入1 mL終止液,于65 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min。

    逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL):10 μL RNA消化液,1 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I,4 μL 5×PrimeScript?RT Buffer,1 μL Oligo dT Primer,1 μL Random 6 mers,3 μL DNase/RNase-free去離子水。反應(yīng)條件:將反應(yīng)液置于37 ℃恒溫水浴鍋中保溫15 min,隨后放入85 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 s以終止反應(yīng)。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放入-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

    以上述逆轉(zhuǎn)錄后紅鰭東方鲀cDNA為模板,采用設(shè)計好的引物進行PCR擴增,之后采用質(zhì)量分數(shù)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小。

    1.3.4 TrCTSL-pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

    本實驗選取pET-28a(+)作為表達載體,重組質(zhì)粒構(gòu)建見圖1。采用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ分別雙酶切pET-28a(+)與TrCTSL的PCR擴增產(chǎn)物,用1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段,切膠后用DNA回收試劑盒回收酶切片段。將回收酶切后pET-28a(+)與TrCTSL片段放入連接儀16 ℃過夜進行連接。將TrCTSL基因插入到pET-28a(+)的多克隆位點,得到重組質(zhì)粒-20 ℃保存用于后續(xù)表達。

    圖1 紅鰭東方鲀組織蛋白酶L重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程Fig. 1 Flow chart showing the construction of recombinant plasmid

    1.3.5 TrCTSL-pET-28a 重組質(zhì)粒的鑒定

    將1.3.4節(jié)所得連接液通過熱激法轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中。取滅菌1.5 mL EP管并加入10 μL滅菌水,用槍頭挑取LB固體(含1 μL/mL卡那霉素)平板上長出的單菌落,與滅菌水充分混勻,取2 μL作為陽性克隆驗證PCR模板,剩余8 μL加入液體LB(含1 μL/mL卡那霉素)放入搖床培養(yǎng)1~2 h,提取質(zhì)粒并選取通用T7引物對重組質(zhì)粒進行測序并用體積分數(shù)50%甘油保存。

    1.3.6 Tr CTSL-pET-28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21

    取1.3.5節(jié)中測序正確的重組質(zhì)粒1 μL,稀釋10倍后與E. coli表達菌株BL21(DE3)感受態(tài)細胞輕輕混勻,冰浴30 min,42 ℃水浴鍋熱激90 s,冰上放置2 min,加入900 μL液體LB(不含卡那霉素),37 ℃搖床45 min,12 000×g離心30 s后涂布于固體LB(含1 μL/mL卡那霉素)平板,37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)約16 h。

    1.3.7 重組工程菌的構(gòu)建及表達

    隨機挑取8 個轉(zhuǎn)化平板上的單菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基(含1 μL/mL卡那霉素),在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)約10 h后按1%接種量轉(zhuǎn)接新鮮液體LB(含1 μL/mL卡那霉素)中培養(yǎng)約1 h至OD600nm約為1,加入終濃度為0.2 mmol/mL的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

    將誘導后的菌液加入50 mL離心管中,4 ℃、7 000 r/min離心5 min,收集菌體,再用生理鹽水清洗菌體,振蕩重復離心,收集菌體于冰上用于破碎。將菌體加入10 mL PBS,振蕩混勻,超聲3 s、間隔5 s破碎,8 000 r/min離心10 min后分別取沉淀和上清液保存驗證。

    1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)檢測重組蛋白酶

    沉淀用超純水等體積溶解,分別取沉淀溶解液與上清液20 μL與等體積SDS-PAGE緩沖液混勻并將樣品煮制5 min,加入配制好的蛋白膠,80 V約30 min待樣品從濃縮膠進入分離膠后調(diào)為120 V進行SDS-PAGE PBS分析。

    1.3.9 重組蛋白酶活性檢測

    重組組織蛋白酶L活性的測定,反應(yīng)體系由50 μL 0.1% Brij35,500 μL 50 mmol/L PBS含5 mmol/L乙二胺四乙酸,5 mmol/L L-Cys(緩沖液pH 5.5)和 100 μL酶液組成。激發(fā)波長設(shè)置為360 nm,發(fā)射波長設(shè)置為460 nm。將熒光分光光度計設(shè)置在40 ℃條件下預熱2 min后加入50 μL 20 μmol/L的底物Z-Phe-Arg-AMC,以20 s為間隔檢測其實時釋放的熒光強度變化。并設(shè)置200 μL純酶液、200 μL純底物與200 μL純緩沖液作為對照組。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TrCTSL基因的擴增

    為得到紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的基因片段,以轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板,進行PCR后得到圖2中約1 000 bp大小的條帶,與數(shù)據(jù)庫中的序列堿基數(shù)1 008 bp幾乎一致。

    圖2 組織蛋白酶L產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoresis analysis of PCR products of TrCTSL gene

    2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

    為了鑒定目的基因是否成功克隆至pET-28a(+)載體,對轉(zhuǎn)化后的菌落進行菌落PCR擴增。圖3為菌落PCR電泳圖,根據(jù)pET-28a(+)和目的基因的序列,克隆成功的陽性轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR后,可以擴增出一條1 008 bp的片段。圖3中轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物泳道顯示,均出現(xiàn)堿基數(shù)大約為1 000的條帶,而以原始pET-28a(+)為模板進行PCR后未出現(xiàn)任何條帶。由此可以初步確定紅鰭東方鲀組織蛋白酶L基因已經(jīng)克隆到pET-28a(+)上。

    圖3 菌落PCR電泳圖Fig. 3 Electrophoresis analysis of PCR products with different plasmids as template

    2.3 重組質(zhì)粒測序鑒定

    將初步確定成功克隆的重組質(zhì)粒進行測序,翻譯后與數(shù)據(jù)庫中的原始序列進行比對,結(jié)果如圖4所示,發(fā)現(xiàn)僅有1 個氨基酸的突變,且離活性中心較遠,有可能是因為個體差異造成,說明紅鰭東方鲀組織蛋白酶L的基因已成功克隆至表達載體pET-28a(+)上。

    圖4 重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L質(zhì)粒序列對比圖Fig. 4 Sequence alignment of recombinant plasmid

    2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21

    將測序成功的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)E. coli BL21以獲得重組蛋白,所得到的菌落平板菌落與原始E. coli BL21平板對比如圖5所示。說明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中。

    圖5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化平板Fig. 5 Transformation of recombinant plasmid

    2.5 SDS-PAGE檢測重組蛋白

    將含重組質(zhì)粒的大腸桿菌誘導表達后,收集菌體經(jīng)破碎離心得到上清液作為樣品進行SDS-PAGE表達檢測,根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的序列可知,目的重組蛋白大小為36 kD,將樣品上清液與誘導后野生型pET-28a(+)上清液進行比對,結(jié)果如圖6所示,野生型pET-28a(+)表達產(chǎn)物在36 kD大小的位置未出現(xiàn)明顯條帶,而重組pET-28a(+)表達產(chǎn)物在36 kD出現(xiàn)了明顯條帶,說明重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L成功胞外分泌表達。所得條帶與原核表達所得重組大黃魚組織蛋白酶L[27],重組中國對蝦組織蛋白酶L[28],重組日本七鰓鰻組織蛋白酶L[29]的大小相似,可以確定實驗所得為重組紅鰭東方鲀組織蛋白酶L,為后續(xù)實驗進一步對比其特性及功能奠定了基礎(chǔ)。

    圖6 重組蛋白酶SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 SDS-PAGE profi le of recombinant protein

    2.6 重組蛋白酶活性檢測結(jié)果

    圖7 重組蛋白酶活性測定Fig. 7 Enzymatic activity of recombinant cathepsin L

    將誘導后破碎離心的上清液樣品用熒光分光光度計進行酶活性檢測,由圖7可知,只有重組蛋白酶L與底物的反應(yīng)液隨著時間的變化所釋放的熒光強度不斷增加。初步證明了重組表達組織蛋白酶L有活性,為之后的純化以及酶學性質(zhì)研究提供依據(jù)。

    3 結(jié) 論

    為了探究紅鰭東方鲀體內(nèi)呈味肽的形成機制,以組織蛋白酶類中的組織蛋白酶L為研究對象,從GenBank中查找序列,并用從鮮活的紅鰭東方鲀中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為模板進行PCR,并成功將其克隆在pET-28a(+)載體上,轉(zhuǎn)入E. coli BL21建立大腸桿菌異源表達系統(tǒng),誘導后成功分泌表達并有活性為之后的純化、酶學特性的鑒定以及呈味肽與內(nèi)源蛋白酶之間的相互作用關(guān)系研究提供了依據(jù)。

    [1] 鄧捷春, 王錫昌, 劉源. 暗紋東方鲀與紅鰭東方鲀氣味成分差異研究[J]. 食品科學, 2009, 30(22)∶ 335-339. DOI∶10.3321/j.issn∶1002-6630.2009.22.080.

    [2] 苗曉丹, 劉源, 馬壘, 等. 結(jié)合感官評價與電子舌技術(shù)優(yōu)化酶水解養(yǎng)殖暗紋東方鲀肌肉制備呈味肽[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015(8)∶ 268-272.

    [3] ZHANG M X, WANG X C, LIU Y, et al. Isolation and identifi cation of flavour peptides from puffer fish (Takifugu obscurus) muscle using an electronic tongue and MALDI-TOF/TOF MS/MS[J].Food Chemistry, 2012, 135(3)∶ 1463-1470. DOI∶10.1016/j.foodchem.2012.06.026.

    [4] 仇春泱, 王錫昌, 劉源. 食品中的呈味肽及其分離鑒定方法研究進展[J]. 中國食品學報, 2013, 13(12)∶ 129-138.

    [5] WU H C, CHEN H M, SHIAU C Y. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel(Scomber austriasicus)[J]. Food Research International, 2003,36(9/10)∶ 949-957. DOI∶10.1016/S0963-9969(03)00104-2.

    [6] ARAI S, YAMASHITA M, FUJIMAKI M. Glutamyl oligopeptides as factors responsible for tastes of a proteinase-modifi ed soybean protein[J].Agricultural & Biological Chemistry, 1972, 36(7)∶ 1253-1256.DOI∶10.1271/bbb1961.36.1253.

    [7] SU G, CUI C, ZHENG L, et al. Isolation and identification of two novel umami and umami-enhancing peptides from peanut hydrolysate by consecutive chromatography and MALDI-TOF/TOF MS[J]. Food Chemistry, 2012, 135(2)∶ 479-485. DOI∶10.1016/j.foodchem.2012.04.130.

    [8] YAMASAKI Y, MAEKAWA K. A peptide with delicious taste[J].Agricultural & Biological Chemistry, 1978, 42(9)∶ 1761-1765.DOI∶10.1271/bbb1961.42.1761.

    [9] MAEHASHI K, MATSUZAKI M, YAMAMOTO Y, et al. Isolation of peptides from an enzymatic hydrolysate of food proteins and characterization of their taste properties[J]. Bioscience Biotechnology& Biochemistry, 1999, 63(3)∶ 555-559. DOI∶10.1271/bbb.63.555.

    [10] 黨亞麗, 張中健, 閆小偉, 等. 巴馬火腿酶解物中呈味肽的分離純化及其結(jié)構(gòu)研究[J]. 食品科學, 2010, 31(13)∶ 127-131.

    [11] YU X, ZHANG L, MIAO X, et al. The structure features of umami hexapeptides for the T1R1/T1R3 receptor[J]. Food Chemistry, 2016,221∶ 599-605. DOI∶10.1016/j.foodchem.2016.11.133.

    [12] ZHANG M, WANG X, LIU Y, et al. Species discrimination among three kinds of puffer fish using an electronic nose combined with olfactory sensory evaluation[J]. Sensors, 2012, 12(9)∶ 12562-12571.DOI∶10.3390/s120912562.

    [13] 劉源, 仇春泱, 王錫昌, 等. 養(yǎng)殖暗紋東方鲀肌肉中呈味肽的分離鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(8)∶ 38-42.

    [14] 劉源, 馬壘, 仇春泱, 等. 熱加工暗紋東方鲀肌肉中呈 味肽分離鑒定及呈味特性研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2016(3)∶ 152-157.

    [15] DELBARRE-LADRAT C, VERREZ-BAGNIS V, NO?L J, et al.Relative contribution of calpain and cathepsins to protein degradation in muscle of sea bass (Dicentrarchus labrax L.)[J]. Food Chemistry,2004, 88(3)∶ 389-395. DOI∶10.1016/j.foodchem.2004.01.053.

    [16] HUGHES M C, O’NEILL E E, MCSWEENEY P L H, et al.Proteolysis of bovine F-actin by cathepsin B[J]. Food Chemistry,1999, 64(4)∶ 525-530. DOI∶10.1016/S0308-8146(98)00161-7.

    [17] SHAHIDI F, KAMIL Y V A J. Enzymes from fish and aquatic invertebrates and their application in the food industry[J]. Trends in Food Science & Technology, 2001, 12(12)∶ 435-464. DOI∶10.1016/S0924-2244(02)00021-3.

    [18] 李琳, 王正全, 張晶晶, 等. 暗紋東方鲀肌肉組織蛋白酶B提取工藝優(yōu)化[J]. 食品科學, 2016, 37(3)∶ 91-96. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201603018.

    [19] 李琳, 王正全, 張晶晶, 等. 內(nèi)源蛋白酶對肉類食品風味的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(2)∶ 237-241. DOI∶10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201502042.

    [20] JIA A R, ZHANG X H. cDNA cloning, characterization, and expression analysis of the Rac1 gene from Scophthalmus maximus[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2009, 154(1)∶ 80. DOI∶10.1016/j.cbpb.2009.05.002.

    [21] TOLDRá F, FLORES M. The role of muscle proteases and lipases in flavor development during the processing of dry-cured ham[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1998, 38(4)∶ 331-352.DOI∶10.1080/10408699891274237.

    [22] 李艷逢. 鹽水鴨復鹵鹵水基本品質(zhì)特性的研究[D]. 南京∶ 南京農(nóng)業(yè)大學, 2009∶ 23.

    [23] 張紅梅. 蛋白酶在發(fā)酵香腸成熟中的作用[J]. 肉類工業(yè), 2009(10)∶52-53. DOI∶10.3969/j.issn.1008-5467.2009.10.020.

    [24] CHERET R, DELBARRELADRAT C, MDE L A, et al. Calpain and cathepsin activities in post mortem fish and meat muscles[J].Food Chemistry, 2007, 101(4)∶ 1474-1479. DOI∶10.1016/j.foodchem.2006.04.023.

    [25] 劉曉紅. 兩種重要魚類致病菌感染及減毒活疫苗接種途徑的研究[D].上?!?華東理工大學, 2014∶ 11-34.

    [26] BAOPRASERTKUL P, PEATMAN E, ABERNATHY J, et al.Structural characterisation and expression analysis of toll-like receptor 2 gene from catfish[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2007, 22(4)∶418-426. DOI∶10.1016/j.fsi.2006.04.005.

    [27] 楊志軍. 大黃魚組織蛋白酶B、L、S的分子克隆和半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatins的初步功能研究[D]. 青島∶ 國家海洋局第三海洋研究所, 2011∶ 44-61.

    [28] 卜興江. 中國對蝦組織蛋白酶L和溶菌酶的重組表達及性質(zhì)研究[D].濟南∶ 山東大學, 2006∶ 3-23.

    [29] 楊東輝. 日本七鰓鰻組織蛋白酶L的克隆表達及功能分析[D]. 大連∶遼寧師范大學, 2013∶ 17-21.

    Construction and Verifi cation of Expression Vector for Takifugu rubripes Cathepsin L Gene

    LI Yanyu1, TANG Qilong1, ZHANG Lujia2, XIE Jingli2, WANG Wenli1, LIU Yuan1,3,*
    (1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;3. College of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

    Takifugu rubripes has a delicious taste. To date, a series of umami peptides have been separated and identifi ed from T. rubripes, but their formation mechanism is not yet clear. Cathepsin L degrades myofi brillar protein and troponin during muscle degradation and thus plays an important role in the flavor formation. This study aimed to elucidate the possible mechanism of flavor peptide formation. We obtained a 1 336 bp sequence of cathepsin L gene from the NCBI database, and extracted RNA from the muscle of T. rubripes, and then reverse-transcribed it into cDNA. PET-28a (+) as the expression vector and E. coli BL21 as engineering bacteria was used to clone and express the cathepsin L gene. Recombinant cathepsin L was obtained with a molecular mass of 36 kD, and the E. coli expression system was also successfully validated.This study can provide useful information for further studies on enzymatic characteristics and of cathepsin L and its role in taste formation in T. rubripes.

    Takifugu rubripes; cathepsin L; fl avor peptide; E. coli expression system

    TS254.5

    A

    1002-6630(2017)20-0001-05

    李妍鈺, 湯奇龍, 張魯嘉, 等. 紅鰭東方鲀組織蛋白酶L 表達載體的構(gòu)建及表達結(jié)果驗證[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 1-5.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001. http∶//www.spkx.net.cn

    LI Yanyu, TANG Qilong, ZHANG Lujia, et al. Construction and verifi cation of expression vector for Takifugu rubripes cathepsin L gene[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 1-5. (in Chi nese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001. http∶//www.spkx.net.cn

    2017-04-01

    國家自然科學基金青年科學基金項目(31622042;31371790;31271900);

    “十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項(2016YFD040083)

    李妍鈺(1992—),女,碩士研究生,研究方向為肉品風味與品質(zhì)評價。E-mail:sosalee92@hotmail.com

    *通信作者:劉源(1979—),男,教授,博士,研究方向為肉品風味與品質(zhì)評價。E-mail:509925@qq.com

    DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720001

    猜你喜歡
    紅鰭蛋白酶菌落
    紅鰭原鲌
    垂釣(2023年10期)2024-01-02 08:47:05
    不同emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)
    紅鰭原鲌的人工繁殖及夏花培育技術(shù)
    思鄉(xiāng)與蛋白酶
    文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
    野生和養(yǎng)殖紅鰭東方鲀營養(yǎng)品質(zhì)的比較分析
    多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
    食品微生物檢驗中菌落總數(shù)測定的注意事項
    IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
    SPC在壓縮干糧菌落總數(shù)監(jiān)測過程中的應(yīng)用
    食品工程(2015年3期)2015-12-07 10:20:53
    基于細菌菌落優(yōu)化算法含分布式電源的無功優(yōu)化
    亚洲精品一区蜜桃| 午夜福利在线观看吧| 黄片wwwwww| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产一级毛片在线| 日本一二三区视频观看| 午夜免费激情av| 插阴视频在线观看视频| 1024手机看黄色片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜爱爱视频在线播放| 水蜜桃什么品种好| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美成人午夜免费资源| 麻豆一二三区av精品| 国产探花极品一区二区| 亚洲色图av天堂| 高清午夜精品一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 成年av动漫网址| 国产在视频线在精品| 久久久精品大字幕| 欧美潮喷喷水| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲色图av天堂| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费观看精品视频网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产av一区在线观看免费| 欧美成人午夜免费资源| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产乱人偷精品视频| 内地一区二区视频在线| 国产在视频线在精品| 亚洲人成网站高清观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲成av人片在线播放无| 黄色配什么色好看| 小说图片视频综合网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲自偷自拍三级| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品.久久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲不卡免费看| 日韩国内少妇激情av| 国产av在哪里看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 欧美三级亚洲精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 插阴视频在线观看视频| 日韩欧美国产在线观看| 国内精品美女久久久久久| 最近最新中文字幕免费大全7| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人二区视频| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲最大成人av| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 嫩草影院新地址| 女人被狂操c到高潮| 久久久欧美国产精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 欧美精品国产亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲中文字幕日韩| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 插阴视频在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲精品自拍成人| 成人漫画全彩无遮挡| 久久精品国产亚洲网站| 国产免费男女视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 我要搜黄色片| 欧美成人午夜免费资源| 日本黄色视频三级网站网址| 国产免费福利视频在线观看| 99热网站在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 免费av观看视频| 男人舔奶头视频| av在线天堂中文字幕| 国产乱来视频区| 国产精品人妻久久久久久| 欧美精品一区二区大全| 观看美女的网站| 亚洲av不卡在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 岛国在线免费视频观看| videos熟女内射| 三级经典国产精品| 99视频精品全部免费 在线| www日本黄色视频网| 天堂√8在线中文| 狠狠狠狠99中文字幕| 99在线视频只有这里精品首页| 美女高潮的动态| 免费在线观看成人毛片| 日韩欧美精品v在线| 精品久久久久久久久av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 午夜爱爱视频在线播放| 久久久a久久爽久久v久久| 国产毛片a区久久久久| 国产高潮美女av| 在线观看一区二区三区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国模一区二区三区四区视频| 国产在线一区二区三区精 | av天堂中文字幕网| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久99精品国语久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 日韩高清综合在线| 91精品国产九色| 丝袜喷水一区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 91av网一区二区| 美女国产视频在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 精品欧美国产一区二区三| 国产视频内射| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产黄片美女视频| 国产高潮美女av| 99久久精品热视频| 青春草亚洲视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品自拍成人| av在线播放精品| 久久精品久久久久久久性| 国产伦一二天堂av在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 老司机影院成人| 久久久欧美国产精品| 黄片wwwwww| 男人的好看免费观看在线视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品人妻视频免费看| 岛国在线免费视频观看| 成人欧美大片| 精品人妻视频免费看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 高清在线视频一区二区三区 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 极品教师在线视频| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av福利一区| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲最大成人中文| 精品久久久久久久久av| av线在线观看网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 免费搜索国产男女视频| 国产精品人妻久久久久久| 久久久久精品久久久久真实原创| 在线免费十八禁| 国产免费男女视频| 国产黄a三级三级三级人| 99热这里只有是精品在线观看| 九草在线视频观看| 有码 亚洲区| 久热久热在线精品观看| 三级国产精品欧美在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产成人精品一,二区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 嫩草影院新地址| av黄色大香蕉| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲五月天丁香| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 成人av在线播放网站| 亚洲最大成人中文| 一级毛片电影观看 | 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲最大成人av| 国产av一区在线观看免费| 日韩av在线免费看完整版不卡| 91久久精品国产一区二区成人| 国产免费又黄又爽又色| 久久亚洲精品不卡| 久久久久性生活片| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 99久久九九国产精品国产免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美潮喷喷水| 国产精品,欧美在线| a级毛色黄片| 成人亚洲欧美一区二区av| 男女国产视频网站| av在线老鸭窝| 免费播放大片免费观看视频在线观看 | 欧美一区二区亚洲| 日本一本二区三区精品| 少妇丰满av| av女优亚洲男人天堂| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲综合色惰| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲成色77777| 一边亲一边摸免费视频| 色哟哟·www| 国产91av在线免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 国产精华一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 黄片wwwwww| 国产成人aa在线观看| 国产精品.久久久| 变态另类丝袜制服| 亚洲国产精品久久男人天堂| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 午夜视频国产福利| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品综合久久久久久久免费| av在线播放精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩制服骚丝袜av| 国产一级毛片在线| 只有这里有精品99| 亚洲人与动物交配视频| av.在线天堂| 久久99热这里只频精品6学生 | 99热网站在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩人妻高清精品专区| 美女cb高潮喷水在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人a区在线观看| 免费观看a级毛片全部| 成人性生交大片免费视频hd| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产成人一区二区在线| 亚洲av免费在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 深夜a级毛片| 水蜜桃什么品种好| 我的老师免费观看完整版| 嫩草影院入口| 日韩国内少妇激情av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美97在线视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 桃色一区二区三区在线观看| 男人舔奶头视频| 毛片女人毛片| 九九在线视频观看精品| 色播亚洲综合网| 久久久久免费精品人妻一区二区| 97在线视频观看| 天堂影院成人在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产爱豆传媒在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲色图av天堂| 欧美性感艳星| 免费av观看视频| 国产成人精品婷婷| 亚洲在线自拍视频| 亚洲av.av天堂| 99久国产av精品| 久久热精品热| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久久久久免费av| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 男女国产视频网站| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 丝袜喷水一区| 国产精品一及| av黄色大香蕉| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品久久久久久久久免| 成人三级黄色视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲欧美日韩高清专用| 免费观看在线日韩| 亚洲av熟女| 麻豆成人av视频| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲在线自拍视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品电影一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| 久久久精品大字幕| 国产精品一及| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩欧美三级三区| 久久人妻av系列| 在线观看一区二区三区| 国产视频内射| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 乱系列少妇在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久鲁丝午夜福利片| 有码 亚洲区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 男女下面进入的视频免费午夜| av国产久精品久网站免费入址| 日本av手机在线免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲在线观看片| 亚洲真实伦在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 插逼视频在线观看| 国产一区亚洲一区在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日韩成人伦理影院| 国产一区二区三区av在线| 日韩欧美精品免费久久| 精品久久久噜噜| 2021天堂中文幕一二区在线观| 欧美成人a在线观看| 99热这里只有是精品50| 91久久精品电影网| 国产高清有码在线观看视频| 在线播放国产精品三级| 人妻夜夜爽99麻豆av| av在线天堂中文字幕| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 永久免费av网站大全| 久久99热这里只频精品6学生 | 亚洲精品色激情综合| 久久精品国产亚洲av天美| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产69精品久久久久777片| 国产乱人视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 成人无遮挡网站| 大香蕉久久网| 亚洲高清免费不卡视频| 熟女电影av网| 好男人在线观看高清免费视频| 大话2 男鬼变身卡| 精品人妻熟女av久视频| 婷婷色麻豆天堂久久 | 日韩欧美精品v在线| 欧美3d第一页| 欧美bdsm另类| 亚洲美女搞黄在线观看| av免费在线看不卡| 成人综合一区亚洲| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 可以在线观看毛片的网站| 久久精品影院6| 亚洲三级黄色毛片| 长腿黑丝高跟| 天堂网av新在线| av播播在线观看一区| 午夜精品在线福利| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩中字成人| 欧美成人午夜免费资源| 免费电影在线观看免费观看| 国产高清三级在线| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美97在线视频| 少妇的逼好多水| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 成人三级黄色视频| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲伊人久久精品综合 | av在线观看视频网站免费| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲av电影不卡..在线观看| 99久久精品热视频| 天堂网av新在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产综合懂色| 国产一区二区在线观看日韩| 直男gayav资源| 国产精品久久久久久精品电影| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲av福利一区| 免费观看精品视频网站| 国产av不卡久久| 国产精品电影一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 亚洲无线观看免费| av视频在线观看入口| 成年版毛片免费区| 免费观看的影片在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲国产色片| 男人舔奶头视频| 欧美3d第一页| 国内揄拍国产精品人妻在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 变态另类丝袜制服| av在线亚洲专区| 免费大片18禁| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 午夜精品在线福利| 在线观看av片永久免费下载| 久久99热6这里只有精品| av国产免费在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 97超视频在线观看视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 一区二区三区高清视频在线| 欧美丝袜亚洲另类| av国产免费在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| av免费在线看不卡| 国产激情偷乱视频一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲欧美日韩东京热| 91精品伊人久久大香线蕉| 日本免费在线观看一区| 国产真实乱freesex| 国产极品天堂在线| 国产精品一二三区在线看| www日本黄色视频网| 日本三级黄在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品野战在线观看| 日韩强制内射视频| 天天一区二区日本电影三级| 欧美成人a在线观看| 永久网站在线| 韩国av在线不卡| 亚洲精品成人久久久久久| 国产老妇女一区| 能在线免费观看的黄片| 国产午夜精品一二区理论片| 观看美女的网站| 黄色日韩在线| 大香蕉97超碰在线| 永久免费av网站大全| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 黄片无遮挡物在线观看| 老司机福利观看| 国产精品,欧美在线| 国产高清三级在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 色5月婷婷丁香| 丝袜美腿在线中文| 成年女人看的毛片在线观看| 能在线免费观看的黄片| 欧美日韩在线观看h| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲18禁久久av| 中文字幕av在线有码专区| 国产亚洲最大av| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美zozozo另类| 高清午夜精品一区二区三区| 国产真实乱freesex| 久久99精品国语久久久| 免费看日本二区| 久久久成人免费电影| videos熟女内射| 亚洲18禁久久av| 久久久欧美国产精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线观看66精品国产| 国产片特级美女逼逼视频| 中文字幕av成人在线电影| 欧美3d第一页| 免费av毛片视频| 日本一本二区三区精品| 国产高清国产精品国产三级 | 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲欧美日韩东京热| 一级毛片我不卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 91狼人影院| 国产高清有码在线观看视频| 欧美最新免费一区二区三区| 人妻少妇偷人精品九色| 日本午夜av视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 丰满乱子伦码专区| 日本熟妇午夜| 1024手机看黄色片| 美女大奶头视频| 国产精品永久免费网站| 久久精品影院6| 欧美+日韩+精品| 日本一二三区视频观看| 国产三级中文精品| 成年av动漫网址| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美激情在线99| 免费无遮挡裸体视频| 午夜免费激情av| 国产av在哪里看| 天堂影院成人在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 日本熟妇午夜| 国产精华一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 丰满乱子伦码专区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产麻豆成人av免费视频| 国产不卡一卡二| 国产免费又黄又爽又色| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久久精品大字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国产三级普通话版| 青春草视频在线免费观看| av视频在线观看入口| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲av不卡在线观看| 精品久久久久久久久av| www.av在线官网国产| 成人性生交大片免费视频hd| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 乱系列少妇在线播放| 日本wwww免费看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 插阴视频在线观看视频| 日本与韩国留学比较| 观看免费一级毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产一级毛片在线| 国产黄a三级三级三级人| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 亚洲精品,欧美精品| 日韩欧美国产在线观看| 综合色丁香网| 国产一级毛片七仙女欲春2| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品三级大全| 亚洲经典国产精华液单| 99热6这里只有精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 久久精品影院6| 伦精品一区二区三区| 99久国产av精品国产电影| 精品久久久久久久久亚洲| a级一级毛片免费在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 久久99精品国语久久久| av在线老鸭窝| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜日本视频在线| 国产乱人偷精品视频| 超碰av人人做人人爽久久| 两个人的视频大全免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 成人鲁丝片一二三区免费| 变态另类丝袜制服| 一个人看的www免费观看视频| a级毛色黄片| 久久人人爽人人爽人人片va| 精品酒店卫生间| 麻豆乱淫一区二区| 久久99热这里只有精品18| av在线亚洲专区| 亚洲国产色片| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 色5月婷婷丁香| 简卡轻食公司| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美在线乱码| 男人的好看免费观看在线视频| 国产一区二区在线观看日韩|