TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及ROS含量的影響*

殷 俊，譚雪梅，張秀麗，冀萌萌，陶宇昌，劉蔓蔓，余增麗

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及ROS含量的影響*

殷 俊，譚雪梅，張秀麗，冀萌萌，陶宇昌，劉蔓蔓，余增麗#

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

二噁英；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；凋亡相關(guān)蛋白；大鼠

目的：探討2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及ROS 含量的影響。方法用不同劑量TCDD(0、1、5、10、50 nmol/L)處理大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞24 h后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率，利用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞ROS含量，Annexin V-FITC/PI染色聯(lián)合激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，采用Western blot法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、 Bcl-2、 Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果隨著TCDD劑量的增加，細(xì)胞增殖抑制率和ROS含量逐漸升高(P<0.05)，細(xì)胞中Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量逐漸增加，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)。結(jié)論TCDD可誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

近年來，人類生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病率呈逐年升高趨勢，而環(huán)境因素與之密切相關(guān)。二噁英是一類持久性有機(jī)污染物的總稱，包含210種化合物，其中毒性最強(qiáng)的一種為2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(TCDD)[1]。廢棄物的焚燒處理、尾氣排放、冶金化工以及農(nóng)藥生產(chǎn)是TCDD產(chǎn)生的主要來源[2]。研究[3-6]表明，TCDD易在人體蓄積，且對肝臟、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖發(fā)育等都有一定的毒性作用。相較于雌性，雄性生殖系統(tǒng)對TCDD更為敏感，TCDD可通過降低雄性大鼠血清睪酮水平以及精子濃度和質(zhì)量從而導(dǎo)致其生殖系統(tǒng)的損傷[7]，但具體的機(jī)制尚不清楚。睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于曲細(xì)精管間的疏松結(jié)締組織中，占睪丸細(xì)胞總數(shù)的2%～4%[8]。機(jī)體內(nèi)睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌。睪酮是一類由19個(gè)碳原子組成的類固醇激素，可促進(jìn)精子的成熟，促進(jìn)內(nèi)、外生殖器的發(fā)育，刺激第二性征的出現(xiàn)等[9]。在此背景下，作者在查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，觀察了TCDD染毒對體外培養(yǎng)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，以及其對細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2表達(dá)和活性氧(ROS)含量的影響，探討TCDD生殖毒性的可能機(jī)制，為預(yù)防相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物健康清潔級雄性SD大鼠，8～10周齡，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(豫)2015-0004]，于檢疫室隔離觀察1周后，在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)2周。在此期間，嚴(yán)格按照SPF級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(溫度、濕度、飲水飲食模式、晝夜交替時(shí)間)進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2主要儀器及試劑多功能酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司)，JY-SCZ2型SDS-PAGE蛋白電泳儀(北京六一儀器廠)，水平搖床(沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司)，超靈敏凝膠成像儀(美國通用電氣儀器集團(tuán))，徠卡TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司)。DMEM/F-12培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，胎牛血清購于杭州四季青有限公司，二甲基亞砜(DMSO)、膠原酶Ⅳ購于美國Sigma公司。ROS檢測試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI染色法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Genview公司。兔抗大鼠Bax、Caspase-3、Bcl-2、β-actin(內(nèi)參)多克隆抗體以及二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離與分組將大鼠頸椎脫位法處死，于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡消毒5 min,于超凈臺下無菌摘取雙側(cè)睪丸置于無菌PBS培養(yǎng)皿中，除去被膜和血管。將睪丸組織拉散后置于含有膠原酶的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，34 ℃恒溫振蕩10～15 min(90 r/min)，消化完全后加入無血清培養(yǎng)基終止消化，靜止5 min后取上清液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入無血清培養(yǎng)基吹打至單個(gè)細(xì)胞懸液，靜置2 min后，100目鋼網(wǎng)過濾。將過濾后的懸液轉(zhuǎn)移至梯度Percoll分離液中(70%、58%、30%、5%)，1 600 r/min離心20 min。離心結(jié)束后，可看見4條細(xì)胞帶，小心吸取第3條細(xì)胞帶(30%～58%層)于離心管中，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基吹打混勻，并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶和6孔板中，于37 ℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度為5×104mL-1，轉(zhuǎn)入96孔板中，分別加入0(對照)、1、5、10、50 nmol/L TCDD進(jìn)行染毒，每個(gè)劑量設(shè)置6個(gè)平行孔，24 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測。

1.4觀測指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞增殖抑制率的檢測 染毒24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO于37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩20 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測各孔的吸光度(A)值。細(xì)胞增殖抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組A-調(diào)零孔A)/(對照A-調(diào)零孔A)×100%。

1.4.2 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測 染毒24 h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，吸取1×106個(gè)細(xì)胞加入10 nmol/L DCFH-DA工作液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。用一定量PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到96孔板中，使用488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長，酶標(biāo)儀檢測。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測 染毒24 h后收集細(xì)胞，加入1×Annexin V Binding Solution 制成細(xì)胞濃度為1×106mL-1的細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL FITC和5 μL PI，吹打混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，再加入400 μL Binding Solution，吹打混勻，吸取一滴細(xì)胞懸液于玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.4 細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白的檢測 染毒24 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。變性后每組取約30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，220 V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h后用50 g/L脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，TBST洗脫4次，加入稀釋后的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗脫4次，再加入稀釋后的二抗37 ℃孵育2 h，TBST洗脫4次，然后加入ECL發(fā)光液，在超靈敏凝膠成像儀上進(jìn)行曝光，結(jié)果采用Image J軟件進(jìn)行相對定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，若方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett-t3檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的影響見表1。隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增大。

2.2TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響見表1。結(jié)果顯示，隨著TCDD劑量的增加，胞內(nèi)ROS含量逐漸上升。

表1 5組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖抑制率及ROS含量的比較

*：與0 nmol/L對照組比較，P<0.05。

2.3TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI染色、顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖1。隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞凋亡陽性信號也逐漸增強(qiáng)，說明TCDD可誘導(dǎo)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。

1～5:0、1、5、10、50 nmol/L TCDD組。 圖1 5組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)

2.4TCDD對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見圖2和表2。結(jié)果顯示，隨著TCDD染毒劑量的增加，大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量逐漸升高，而Bcl-2蛋白相對表達(dá)量逐漸降低。

1～5:0、1、5、10、50 nmol/L TCDD組。 圖2 5組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

c(TCDD)/(nmol/L)nBaxCaspase-3Bcl-2030.86±0.020.77±0.041.26±0.05131.00±0.050.87±0.021.11±0.03531.05±0.02*1.02±0.02*0.97±0.02*1031.12±0.05*1.10±0.05*0.93±0.01*5031.52±0.07*1.26±0.03*0.69±0.03*F84.38783.892157.030P<0.001<0.001<0.001

*：與0 nmol/L對照組比較，P<0.05。

3 討論

生命體中，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡處于一個(gè)動態(tài)平衡的狀態(tài)，以此維持機(jī)體正常的生長發(fā)育過程。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因素十分復(fù)雜，涉及物理因素(高溫、射線)，化學(xué)因素(環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿)，生物因素(病毒、細(xì)菌)等多個(gè)方面。在這些因素的刺激下，細(xì)胞增殖會受到抑制，并處于病理性凋亡狀態(tài)。當(dāng)前研究[10]發(fā)現(xiàn)，至少有三條細(xì)胞凋亡通路：線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路。ROS是一類具有極強(qiáng)氧化能力的活性氧簇，在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用[11]。有研究[12]發(fā)現(xiàn)，ROS可破壞線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，而線粒體由于呼吸鏈的斷裂反過來又促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，從而形成一種循環(huán)，因此認(rèn)為ROS參與了線粒體凋亡通路。Bcl-2、Bax是Bcl-2蛋白家族重要成員，Bcl-2為抑制凋亡蛋白，Bax為促進(jìn)凋亡蛋白，兩者通過相互作用參與細(xì)胞色素C和其他凋亡因子釋放的調(diào)節(jié)，從而參與線粒體凋亡通路的調(diào)節(jié)[13]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行因子，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[14-15]。在線粒體通路中，當(dāng)促凋亡蛋白激活后，其通過線粒體途徑誘導(dǎo)Caspase發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，從而進(jìn)入凋亡程序，而Bcl-2等抑制凋亡蛋白則可通過抑制細(xì)胞色素C的表達(dá)，導(dǎo)致Caspase無法激活。

TCDD作為一種污染物，其對雄性生殖系統(tǒng)的影響逐漸受到重視。王亞軍等[16]的研究顯示，隨著玉米赤酶烯酮染毒劑量的增加，大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)量有所增加，而Bcl-2表達(dá)量逐漸降低。該研究結(jié)果顯示，低劑量TCDD染毒24 h對睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖無明顯影響，但隨著染毒劑量的增加，細(xì)胞增殖抑制率顯著增加，凋亡細(xì)胞增多，說明TCDD可誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果還顯示，隨著TCDD染毒劑量的增加，睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS含量也顯著升高，同時(shí)Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)， Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。研究結(jié)果提示，TCDD可能誘導(dǎo)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞線粒體通路的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，TCDD能夠抑制大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡的線粒體通路有關(guān)。

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(2017-02-27收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of TCDD on expressions of apoptosis related proteins and ROS content in leydig cells of rats

YINJun,TANXuemei,ZHANGXiuli,JIMengmeng,TAOYuchang,LIUManman,YUZengli

DepartmentofNutritionandFoodHygiene,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

TCDD;leydig cell;apoptosis related protein;rat

Aim: To explore the effects of TCDD on expressions of apoptosis related proteins and ROS content in leydig cells of rats. Methods: Leydig cells from rats were treated with different doses of TCDD(0,1,5,10,50 nmol/L)for 24 hours, and the proliferation inhibition rate of leydig cells was determined by MTT assay, ROS content in leydig cells was determined by DCFH-DA method, apoptosis was observed by confocal microscopy combined Annexin V-FITC/PI staining, and the expressions of Bax, Caspase-3 and Bcl-2 proteins were detected by Western blot.Results: With the increase of the dose of TCDD, the proliferation inhibition rate and ROS content showed a rising trend(P<0.05), the expressions of Bax and Caspase-3 increased whereas that of Bcl-2 protein decreased(P<0.05).Conclusion: TCDD could significantly induce apoptosis of rat leydig cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.010

R114

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 21577119

#通信作者，女，1970年11月生，博士，教授，研究方向：孕期營養(yǎng)，E-mail:zly@zzu.edu.cn