HPK1在乳腺癌組織中的表達(dá)及HPK1過表達(dá)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

王嬌嬌，范智蕊，李礪鋒，丁顯飛，周學(xué)良，楊子悅，袁 博，許振濤，馬丙鈞，趙 杰，王留興#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合ICU 鄭州 450052 5)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052#通信作者，男，1952年2月生，本科，教授，主任醫(yī)師，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:lxwang2006@126.com

HPK1在乳腺癌組織中的表達(dá)及HPK1過表達(dá)對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響*

王嬌嬌1)，范智蕊2)，李礪鋒2,3)，丁顯飛2,4)，周學(xué)良2)，楊子悅4)，袁 博2,4)，許振濤2,4)，馬丙鈞5)，趙 杰5)，王留興2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合ICU 鄭州 450052 5)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052#通信作者，男，1952年2月生，本科，教授，主任醫(yī)師，研究方向：乳腺癌和前列腺癌的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:lxwang2006@126.com

HPK1；過表達(dá)；乳腺癌；MCF-7細(xì)胞；增殖；凋亡

目的：檢測造血祖細(xì)胞激酶1(HPK1)在人非特異型浸潤性乳腺癌組織及乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并構(gòu)建HPK1慢病毒載體以探究HPK1過表達(dá)對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法采用Western blot檢測48例乳腺癌組織和配對癌旁組織中HPK1蛋白的表達(dá)，采用Western blot、RT-PCR法檢測正常乳腺上皮細(xì)胞(MCF10A)和乳腺癌MCF-7細(xì)胞中HPK1的表達(dá)水平。PCR擴(kuò)增HPK1序列，構(gòu)建慢病毒pCDH-HPK1-puro重組載體，包裝病毒、轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞(過表達(dá)組)，以感染空載體病毒的MCF-7細(xì)胞作為對照組，分別采用Western blot、RT-PCR檢測2組細(xì)胞HPK1的表達(dá)水平，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。結(jié)果與癌旁組織相比，HPK1蛋白在乳腺癌組織中低表達(dá)(P=0.036)。與MCF10A細(xì)胞相比，HPK1蛋白及mRNA在MCF-7細(xì)胞中低表達(dá)；與對照組相比，過表達(dá)組中HPK1蛋白及mRNA的表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，G0/G1期細(xì)胞比例升高(P均<0.05)。結(jié)論HPK1在乳腺癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，HPK1過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，并使細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。

乳腺癌已經(jīng)成為全球女性癌癥死亡的第二大原因，其死亡人數(shù)占女性癌癥總死亡人數(shù)的14%[1]。美國癌癥協(xié)會(huì)預(yù)計(jì)，2017年美國乳腺癌將新發(fā)約255 180例、死亡41 070例[1]。目前，乳腺癌在手術(shù)治療、放療、化療和內(nèi)分泌治療等方面已經(jīng)取得了明顯的療效，但其5 a生存率依然較低。因此尋找新的改善乳腺癌患者預(yù)后的基因靶點(diǎn)有著重要的意義[2]。造血祖細(xì)胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1)是造血系統(tǒng)特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，哺乳動(dòng)物Ste-20相關(guān)蛋白激酶MAP4K家族成員之一[3]。HPK1在免疫反應(yīng)和炎癥信號通路以及造血細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、增殖、凋亡中發(fā)揮著重要作用[4],且其可能參與腫瘤的免疫治療[5]。近年發(fā)現(xiàn)，HPK1與胰腺癌[6]、肺癌[7-8]、膀胱癌[9]等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。作者的前期研究[10]發(fā)現(xiàn)HPK1在乳腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，與非特異型浸潤性乳腺癌(invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified, IDC-NOS)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。該研究通過構(gòu)建慢病毒載體獲得HPK1過表達(dá)的慢病毒顆粒，并感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，以探究HPK1過表達(dá)對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為未來HPK1應(yīng)用于乳腺癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料MCF-7細(xì)胞、293T細(xì)胞、MCF10A細(xì)胞及慢病毒包裝質(zhì)粒pCDH-puro、pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG均由鄭州大學(xué)腫瘤生物學(xué)研究室儲(chǔ)存。體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液購自HyClone公司。KOD FX DNA聚合酶購自Toyobo公司，核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶購自TaKaRa公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒及PCR相關(guān)引物購自上海生工生物工程有限公司。兔抗人HPK1一抗購自美國Abgent公司，β-actin一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。RNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒、2.5 g/L胰蛋白酶等購自北京索萊寶生物科技有限公司。無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自Tiangen公司。 MTT和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白表達(dá)的檢測采用Western blot法。選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科收治的48例病理證實(shí)為ER陽性的IDC-NOS患者新鮮冰凍的癌組織和癌旁組織，剪碎研磨后，加入裂解液提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量測定，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入一抗HPK1抗體、GAPDH抗體(按11 000稀釋)孵育過夜，TBST沖洗3次，每次10 min。加入二抗(按15 000稀釋)室溫?fù)u床孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min。ECL顯影，蛋白印記采用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.3pCDH-HPK1-puro慢病毒骨架質(zhì)粒的構(gòu)建以HPK1 cDNA為模板進(jìn)行PCR。上游引物5’-TGACCTCCATAGAAGATTCTAGAATGGACGTCGTGGA CCC-3’，下游引物5’-GAGCGATCGCAGATCCTTGCG GCCGCTCATTCCTGGATGTAGA-3’， 產(chǎn)物大小為109 000 bp。反應(yīng)體系參考KOD FX DNA聚合酶使用說明書。反應(yīng)條件: 94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，68 ℃ 2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃ 5 min，12 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓120 V、時(shí)間30 min；電泳后成像觀察，切膠回收，將PCR產(chǎn)物插入pCDH-puro質(zhì)粒EcoRⅠ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)之間，調(diào)節(jié)目的片段及質(zhì)粒片段的酶切產(chǎn)物質(zhì)量濃度至50 mg/L，按質(zhì)量比51于16 ℃連接，轉(zhuǎn)化熱激后，涂板倒置于37 ℃烘箱15 h。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)MCF-7、293T、MCF10A細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d傳代1次，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染包裝：將慢病毒包裝質(zhì)粒pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG、pCDH-HPK1-puro及pCDH-puro分別通過轉(zhuǎn)化擴(kuò)大，使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。將293T細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，12 h后將pCDH-HPK1-puro(過表達(dá)組)或pCDH-puro(對照組)以及pCMV-dR8.2 dvpr、pCMV-VSVG按照質(zhì)量比111共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，8 h后換液，36 h后提取病毒液，1 500 r/min離心5 min后，取上清液采用0.45 μm濾頭過濾,4 ℃保存?zhèn)溆谩?4 h后可二次提取病毒液。

轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前12 h將MCF-7細(xì)胞傳代，使細(xì)胞達(dá)到約40%融合。將2組(過表達(dá)組、對照組)病毒液分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，并加入終質(zhì)量濃度為5 mg/L聚凝胺，轉(zhuǎn)染8 h后，更換為正常培養(yǎng)基。第1次轉(zhuǎn)染24 h后可進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染3 d后，加入終質(zhì)量濃度1 mg/L嘌呤霉素篩選3～5 d。

1.6正常乳腺上皮MCF10A細(xì)胞及乳腺癌MCF-7細(xì)胞HPK1蛋白表達(dá)水平的檢測采用Western blot法。實(shí)驗(yàn)分為3組，即正常乳腺上皮細(xì)胞組(MCF10A組)和乳腺癌MCF-7細(xì)胞無轉(zhuǎn)染組(對照組)、HPK1轉(zhuǎn)染組(過表達(dá)組)，各組分別取5×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后，加入200 μL的RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞全蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE分離蛋白，半干法將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，加入一抗(按11 000稀釋)，室溫下孵育2 h 后，TBST 洗膜，加入二抗(按12 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h 后，ECL顯影，結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7正常乳腺上皮MCF10A細(xì)胞及乳腺癌MCF-7細(xì)胞HPK1mRNA表達(dá)水平的檢測采用RT-PCR法。收集MCF10A組、對照組及過表達(dá)組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后各組取5×105個(gè)細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度及純度。42 ℃ 2 min去除基因組DNA；37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，采用SYBR@Premix Ex TaqTMⅡ進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件: 95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，45個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算HPK1 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1。

1.8對照組和過表達(dá)組MCF-7細(xì)胞增殖的檢測

采用MTT法。分別取對照組及過表達(dá)組對數(shù)生長期細(xì)胞接種在96孔板中，細(xì)胞密度為1×105mL-1，每孔加入100 μL的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)過夜后，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃分別培養(yǎng)24、48、72、96 h，加入5 g/L的MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h后棄上清繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入DMSO 150 μL，室溫振蕩混勻，于酶標(biāo)儀波長450 nm 處測定各孔的吸光度值，計(jì)算2組細(xì)胞的增殖率：細(xì)胞增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.9對照組和過表達(dá)組MCF-7細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測分別取對照組及過表達(dá)組對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶處理后，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作步驟檢測細(xì)胞凋亡率；上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白相對表達(dá)量的比較采用配對資料的t檢驗(yàn)；對照組、MCF10A組、過表達(dá)組HPK1蛋白及mRNA相對表達(dá)量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；對照組及過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌組織和癌旁組織中HPK1蛋白的表達(dá)

結(jié)果見圖1。乳腺癌組織HPK1蛋白的相對表達(dá)量(0.194±0.019)低于癌旁組織(0.426±0.082)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t配對=3.104，P=0.036)。

n：癌旁組織；c：癌組織。 圖1 4例典型患者乳腺癌組織與癌旁組織中HPK1蛋白的表達(dá)

2.2pCDH-HPK1-puro載體構(gòu)建結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示條帶單一，亮度高，引物特異性強(qiáng)，提示載體構(gòu)建成功。

M:Marker;1:HPK1。 圖2 PCR電泳圖

2.3對照組、MCF10A組、過表達(dá)組HPK1蛋白及mRNA相對表達(dá)量的比較結(jié)果見圖3、表2。與MCF10A組相比，對照組HPK1表達(dá)降低；與MCF10A組相比，過表達(dá)組HPK1表達(dá)增加。表明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 3組細(xì)胞Western blot結(jié)果

組別nHPK1蛋白HPK1mRNA對照組335.386±6.7250.980±0.032MCF10A組381.357±13.469*2.019±0.216*過表達(dá)組3187.642±23.426*#4.865±0.491*#F73.520125.800P<0.001<0.001

*：與對照組相比，P<0.05；#：與MCF10組相比，P<0.05。

2.4HPK1過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，過表達(dá)組細(xì)胞增殖率低于對照組。

圖4 對照組和過表達(dá)組細(xì)胞生長曲線

2.5HPK1過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果(表3)顯示，HPK1過表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表3 對照組和過表達(dá)組MCF-7細(xì)胞凋亡率的比較 %

t=4.205,P=0.013。

2.6HPK1過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表4。

表4 對照組和過表達(dá)組MCF-7細(xì)胞周期的比較 %

3 討論

乳腺癌是全世界女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]，IDC-NOS是其最常見的病理類型。目前新輔助化療和靶向治療均取得較大進(jìn)展，但是近處復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及化療藥、靶向藥物耐藥仍嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，其生存期仍有待延長。因此，研究影響乳腺癌治療及預(yù)后的分子靶點(diǎn)具有重要臨床意義。

該研究首先在組織部分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HPK1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織；然后通過Western blot、RT-PCR發(fā)現(xiàn)HPK1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)。為明確其可能機(jī)制，成功構(gòu)建了HPK1過表達(dá)慢病毒并感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，以進(jìn)一步探究HPK1過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。該研究結(jié)果表明， HPK1在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，HPK1過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，使細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。總之，HPK1作為潛在基因靶點(diǎn)未來應(yīng)用于乳腺癌的治療有一定的前景。

研究中作者發(fā)現(xiàn)HPK1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中表達(dá)低，且證明了HPK1過表達(dá)可抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，將細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期。該研究中，MTT法檢測結(jié)果顯示，HPK1過表達(dá)組48、72、96 h的細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制；流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，HPK1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率明顯增加，表明可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HPK1是MAP4K家族的重要成員之一，具有重要的生物學(xué)作用，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)較低，且可能參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等。同樣，Li等[8]證明，HPK1可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和浸潤等。Wang等[6]指出，胰腺癌細(xì)胞中的HPK1經(jīng)蛋白酶介導(dǎo)降解后缺失，提示HPK1降解可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。Alzabin等[7]發(fā)現(xiàn)，HPK1是抑制前列腺素E2介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要組成部分。此外，HPK1可以用于預(yù)測腫瘤進(jìn)展或者復(fù)發(fā)[11-12]。由此可見，HPK1蛋白可能具有抗癌作用，上調(diào)其表達(dá)或增強(qiáng)其活性可能成為治療惡性腫瘤的重要手段[5]。

此外，張艷杰等[13]通過慢病毒表達(dá)載體使全長組織因子過表達(dá)。該研究構(gòu)建了慢病毒pCDH-HPK1-puro重組載體，包裝病毒、轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，成功獲得了HPK1過表達(dá)細(xì)胞；PCR基因擴(kuò)增全長凝膠電泳以及Western blot、RT-PCR檢測過表達(dá)細(xì)胞中HPK1蛋白和mRNA的高表達(dá)都證明了載體構(gòu)建的成功。同時(shí)，隨著技術(shù)進(jìn)步，慢病毒包裝系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展到第4代，具有更強(qiáng)的選擇性、穩(wěn)定性和安全性[14]。因此，通過慢病毒包裝系統(tǒng)過表達(dá)HPK1是一種安全、穩(wěn)定且成熟、有效的手段。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)建立了HPK1慢病毒穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，在MCF-7細(xì)胞中成功過表達(dá)HPK1，并初步探討了HPK1對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為后續(xù)研究HPK1過表達(dá)抑制乳腺癌的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為乳腺癌的治療提供了新方向。但HPK1抗癌的具體機(jī)制需要進(jìn)行更深一步的研究。

[1] SIEGEL RL,MILLER KD,JEMAL A.Cancer statistics, 2017[J].CA Cancer J Clin,2017,67(1):7

[2] 丁顯飛,周學(xué)良,豆萌萌,等.哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白的表達(dá)及其與乳腺癌預(yù)后關(guān)系的Meta分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2016,42(4):783

[3] LING P,YAO Z,MEYER CF,et al.Interaction of hematopoietic progenitor kinase 1 with adapter proteins Crk and CrkL leads to synergistic activation of c-Jun N-terminal kinase[J].Mol Cell Biol,1999,19(2):1359

[4] CHUANG HC,WANG X,TAN TH.MAP4K family kinases in immunity and inflammation[J].Adv Immunol,2016,129:277

[5] SAWASDIKOSOL S,ZHA R,YANG B,et al.HPK1 as a novel target for cancer immunotherapy[J].Immunol Res,2012,54(1/3):262

[6] WANG H,SONG X,LOGSDON C,et al.Proteasome-mediated degradation and functions of hematopoietic progenitor kinase 1 in pancreatic cancer[J].Cancer Res,2009,69(3):1063

[7] ALZABIN S,PYARAJAN S,YEE H,et al.Hematopoietic progenitor kinase 1 is a critical component of prostaglandin E2-mediated suppression of the anti-tumor immune response[J].Cancer Immunol Immunother,2010,59(3):419

[8] LI Z,PARK HR,SHI Z,et al.Pro-oncogenic function of HIP-55/Drebrin-like (DBNL) through Ser269/Thr291-phospho-sensor motifs[J].Oncotarget,2014,5(10):3197

[9] WANG Y,LUO H,LI Y,et al.hsa-miR-96 up-regulates MAP4K1 and IRS1 and may function as a promising diagnostic marker in human bladder urothelial carcinomas[J].Mol Med Rep,2012,5(1):260

[10]王嬌嬌,宋麗杰,楊森,等.造血祖細(xì)胞激酶1在雌激素受體陽性乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2016,33(8):2022

[11]VAN DER HEIJDEN AG,MENGUAL L,LOZANO JJ,et al.A five-gene expression signature to predict progression in T1G3 bladder cancer[J].Eur J Cancer,2016,64:127

[12]LIN M,ZHANG Y,LI A,et al.High-throughput RNAi screening of human kinases identifies predictors of clinical outcome in colorectal cancer patients treated with oxaliplatin[J].Oncotarget,2015,6(18):16774

[13]張艷杰,武敏,蔣賢杰,等.慢病毒表達(dá)載體研究全長組織因子對乳腺癌的作用[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2015,41(3):1

[14]孟凡榮,陳琛,萬海粟,等.慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J].中國肺癌雜志,2014,17(12):870

(2017-06-10收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Expression of HPK1 in breast carcinoma tissue and effects of HPK1 overexpression on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cell MCF-7

WANGJiaojiao1),FANZhirui2),LILifeng2,3),DINGXianfei2,4),ZHOUXueliang2),YANGZiyue4),YUANBo2,4),XUZhentao2,4),MABingjun5),ZHAOJie5),WANGLiuxing2)

1)DepartmentofUltrasound,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 3)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 4)DepartmentofGeneralICU,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 5)DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

HPK1;overexpression;breast carcinoma;MCF-7 cell;proliferation;apoptosis

Aim: To detect the expression of hematopoietic progenitor kinase 1(HPK1) in carcinoma tissue of human invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified and breast carcinoma cells, and to investigate the effects of HPK1 overexpression on proliferation and apoptosis of human breast carcinoma cells by constructing HPK1 lentiviral vector. Methods: The expression level of HPK1 protein in carcinoma tissue and paired adjacent tissue from 48 cases of breast carcinoma was detected by Western blot. The expression level of HPK1 in MCF10A and MCF-7 cells was detected by Western blot and RT-PCR. The HPK1 sequence was amplified by PCR, lentivirus recombinant vector pCDH-HPK1-puro was constructed, virus was packaged and MCF-7 cells were transfected(overexpression group). The MCF-7 cells infected with empty vector virus was used as control group. The expression level of HPK1 protein and mRNA was detected by Western blot and RT-PCR, respectively. The cell proliferation ability, cell apoptosis and cell cycle were detected by MTT assay and flow cytometry, respectively. Results: The expression level of HPK1 protein was lower in breast carcinoma tissue compared with adjacent tissue(P=0.036). The level of HPK1 protein and mRNA was lower in MCF-7 cells, compared with that of MCF10A cells(P<0.05). Compared with the control group, the expression level of HPK1 in the overexpression group was up-regulated, cell proliferation ability was decreased significantly, while the apoptosis rate and the proportion of G0/G1 were significantly increased(P<0.05). Conclusion: The expression of HPK1 in both breast carcinoma tissue and cell line is low, and overexpression of HPK1 could inhibit proliferation and induce apoptosis and block the cells in G0/G1 phase.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.005

*科技部科技惠民計(jì)劃專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目 2013GS410101；河南省重大科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目 151100310800

R737.9