非小細胞肺癌組織中MAGE-A3和MAGE-C2 mRNA的表達*

馬 星，陳新峰，張超奇，喬亞敏，張 毅1,，王麗萍#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052

非小細胞肺癌組織中MAGE-A3和MAGE-C2mRNA的表達*

馬 星1)，陳新峰2)，張超奇2)，喬亞敏2)，張 毅1,2)，王麗萍1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心 鄭州 450052

非小細胞肺癌；MAGE-A3；MAGE-C2

目的：檢測腫瘤相關(guān)抗原惡性黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-A3、MAGE-C2在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達情況，并探討其臨床意義。方法收集206例NSCLC手術(shù)患者腫瘤組織，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測組織中 MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA的表達，并分析其與NSCLC患者臨床病理特征(性別、年齡、組織學(xué)分級、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期)之間的關(guān)系。用基因沉默的方法將肺癌A549細胞MAGE-A3下調(diào)，觀察處理前后MAGE-A3 mRNA表達水平的改變，并分析其對細胞生物學(xué)功能(凋亡率、成球率、穿膜細胞數(shù))的影響。結(jié)果MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA在NSCLC組織中的表達率分別是73.3%(151/206)和52.9%(109/206)；MAGE-A3 mRNA的表達與疾病分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；不同病理特征的NSCLC組織中MAGE-C2 mRNA的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA共表達與年齡和臨床分期有關(guān)(P<0.05)。MAGE-A3表達降低后肺癌A549細胞的成球能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.001)。結(jié)論MAGE-A3、MAGE-C2在NSCLC組織中有較高的表達率， 兩者有望成為肺癌免疫治療的潛在靶點。

肺癌是我國乃至全世界發(fā)病率及病死率最高的的惡性腫瘤之一[1]，其組織亞型主要有非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌兩種，分別占肺癌的85%和15%[2]。早期肺癌常因癥狀不典型而漏診，當患者自感癥狀明顯就醫(yī)時大多數(shù)已經(jīng)發(fā)展到中晚期?；熀?或)放療是這類患者的主要治療方法，但是傳統(tǒng)治療方案療效有限且常引起嚴重的不良反應(yīng)，因此需要探索新的有效且不良反應(yīng)輕的治療模式。目前發(fā)現(xiàn)，腫瘤免疫在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。近年來，各種免疫治療手段層出不窮，顯示出了明顯的抗腫瘤效應(yīng)。已經(jīng)完成的一系列臨床試驗[3]肯定了免疫治療在肺癌治療中的巨大潛力。惡性黑色素瘤相關(guān)抗原(melanoma-associated antigens, MAGE)于1991年首次被發(fā)現(xiàn)[4]。一般情況下，MAGE在惡性腫瘤組織中高表達，而在除睪丸和胎盤外的正常組織中不表達[5-6]。MAGE根據(jù)其染色體位置及組織分布不同，分為6個大家族，包括MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、MAGE-D、MAGE-E和MAGE-F。 MAGE-A3、MAGE-C2 是 MAGE家族中較有特征的代表，在許多惡性腫瘤中表達，但關(guān)于它們在NSCLC中的表達及其與NSCLC生物學(xué)行為的相關(guān)性的研究還較少。作者檢測了206例NSCLC患者腫瘤組織中MAGE-A3、MAGE-C2的表達，并進行了相關(guān)的細胞實驗，為應(yīng)用MAGE及其產(chǎn)物進行肺癌免疫治療提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1NSCLC患者一般情況選取2014年9月至2015年9月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科初治的206例NSCLC手術(shù)患者?；颊呷朐呵拔唇邮苓^化療和放療等輔助手段。排除標準：合并免疫系統(tǒng)疾病或者病理診斷不明確。所有患者均經(jīng)臨床診斷和病理活檢確診。標本獲取均經(jīng)患者知情同意。所有標本均具有完整的臨床病理數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織學(xué)分級、病理類型、臨床分期等。

1.2引物合成與設(shè)計通過檢索GenBank中相關(guān)序列信息，利用Primer Premier 5軟件與美國NCBI網(wǎng)站提供的基因序列進行比對，設(shè)計獲得GAPDH、MAGE-A3、MAGE-C2 3對特異性引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，si-MAGE-A3引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3細胞總RNA的提取與cDNA的合成采用Trizol法抽提總RNA，所得RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測定OD值，確定無降解后，取3 μg總 RNA用逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)合成cDNA。

1.4肺癌組織和肺癌細胞H460、A549MAGE-A3、MAGE-C2mRNA表達的檢測以 cDNA 為模板進行 PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)。繪制融解曲線。應(yīng)用 Agilent Mx3005P 儀器進行定量檢測和融解曲線分析，每個反應(yīng)設(shè)4個復(fù)孔。以GAPDH 作為內(nèi)參，記錄每個反應(yīng)的 Ct值，ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，以公式2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

1.5MAGE-A3下調(diào)對A549細胞生物學(xué)特性的影響

1.5.1 siRNA的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將處于對數(shù)生長期的A549細胞接種于24孔板中。轉(zhuǎn)染當天，小心吸走上清，并用無血清RPMI 1640洗2次，取1 μL/孔Lipofectamine 3000用50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋，輕輕混勻后室溫靜置5 min。取2 μL siRNA/孔，用50 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋，輕輕混勻。將配置好的Lipofectamin 3000和siRNA混合，充分混勻，室溫放置 20 min后加入到含有細胞和培養(yǎng)基的孔中，輕柔搖晃細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24～48 h后檢測干擾效率。以未轉(zhuǎn)染的A549細胞作為對照。

1.5.2 細胞凋亡檢測 采用PI-Annexin V雙染法。胰蛋白酶消化目的細胞、離心，棄上清。加入預(yù)冷的PBS洗2次，將PBS棄凈，冰上加入200 μL Binding Buffer，重懸至細胞密度為1×106mL-1。避光加入1.5 μL Annexin V抗體，振蕩混勻。4 ℃避光孵育15 min。轉(zhuǎn)到上樣管中，上機前加入2 μL PI并輕輕混勻。檢測時要低速收集細胞，檢測細胞凋亡率。實驗重復(fù)6次。

1.5.3 細胞成球能力檢測 胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的A549細胞，加入無血清干細胞條件培養(yǎng)基，吹打成單細胞懸液。鋪入6孔低黏附板，1 000～5 000個 mL-1，每孔5 mL。5～7 d后觀察細胞成球情況及細胞球的大小。顯微鏡下拍照，根據(jù)細胞球的直徑進行計數(shù)并計算成球率。實驗重復(fù)6次。

1.5.4 Transwell細胞遷移實驗 消化A549細胞，離心并棄去上清液，用 PBS 洗1～2 遍后計數(shù)細胞。取1×105個細胞，用200 μL無血清培養(yǎng)基重懸。將200 μL細胞懸液加入Transwell小室。24孔板下室加入 600 μL含血清的培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽輕拭去上室內(nèi)未遷移的細胞，用PBS 洗3遍。40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3遍。結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗3遍。選取 10個100倍視野，照相后計數(shù)每個視野中穿膜細胞數(shù)，結(jié)果取平均值。實驗重復(fù)6次。

1.5.5 細胞MAGE-A3 mRNA表達的檢測 方法同1.4。實驗重復(fù)6次。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗進行分析；H460細胞、A549細胞MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA相對表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；si-MAGE-A3組、對照組細胞凋亡率、成球率、穿膜細胞數(shù)、MAGE-A3 mRNA相對表達量的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1MAGE-A3、MAGE-C2mRNA在NSCLC組織中的表達206例NSCLC組織中81.6%(168/206)至少表達1種MAGE(MAGE-A3或MAGE-C2)，MAGE-A3、MAGE-C2表達率分別為73.3%(151/206)、52.9%(109/206)，兩者均表達的有92例(44.7%)，兩者均不表達的有38例(18.4%)。PCR代表性結(jié)果見圖 1。

M：Marker;1：陽性對照；2：陰性對照；3～7：NSCLC組織。 圖1 MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA在NSCLC組織中的表達

2.2MAGE-A3、MAGE-C2mRNA表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。

2.3MAGE-A3、MAGE-C2mRNA在肺癌細胞中的表達A549和H460肺癌細胞中MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA相對表達量的比較見表3。由表3可知，A549細胞表達MAGE-A3、MAGE-C2較高。

表2 MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA 表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表3 肺癌細胞 MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA相對表達量的比較

2.4MAGE-A3下調(diào)對A549細胞生物學(xué)特性的影響結(jié)果見圖2、表4。

3 討論

免疫治療使肺癌患者的生存期及生存質(zhì)量都得到了質(zhì)的飛躍[7]。腫瘤-睪丸抗原是特異性免疫治療的理想靶點之一，是包含MAGE、NY-ESO-1、SSX、LAGE等的一個基因大家族，在腫瘤的綜合治療中占重要地位[8]。MAGE于1991年被發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤患者體內(nèi)，后于不同腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)多個MAGE基因。細胞毒性T淋巴細胞能通過識別MAGE基因的產(chǎn)物而殺傷腫瘤細胞，為腫瘤的特異性免疫治療提供了一種新的方法[9]。Thurner等[10]用MAGE-A3編碼的抗原肽MAGE-3A1(EVDPIGHLY)負載樹突狀細胞，用于治療Ⅳ期黑色素瘤患者，可使患者腫瘤消退。檢測黑色素瘤患者外周血腫瘤標志物表達水平變化來評估患者預(yù)后因素的研究[11]發(fā)現(xiàn)，MAGE-A3表達陽性組比陰性組預(yù)后差，且表達水平高的患者比表達水平低的患者預(yù)后差。Gure等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MAGE-A3表達陽性的NSCLC患者臨床治療效果較差，MAGE-A3表達水平高低也同樣影響患者的預(yù)后。作者采用real-time PCR方法檢測肺癌組織中 MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)73.3%的NSCLC患者表達MAGE-A3，52.9%表達MAGE-C2，說明MAGE-A3、MAGE-C2可作為NSCLC患者免疫學(xué)檢測的分子標志物。MAGE-A3 mRNA表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明其具有影響腫瘤細胞擴散和轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的能力。且MAGE-A3 mRNA表達與患者臨床分期有關(guān)，提示MAGE-A3表達與不良預(yù)后相關(guān)并且是NSCLC更差預(yù)后的標志物。

上排：與對照組相比，si-MAGE-A3組細胞成球數(shù)目減少；下排:與對照組相比，si-MAGE-A3組細胞體外遷移能力下降(結(jié)晶紫染色，×100)。 圖2 特異性si-MAGE-A3 對A549細胞成球(上排)和遷移(下排)能力的影響

組別n細胞凋亡率/%成球率/%穿膜細胞數(shù)MAGE-A3mRNA相對表達量si-MAGE-A3組66.6±0.945.8±5.736.6±6.60.30±0.05對照組65.9±0.393.8±4.786.8±5.40.93±0.03t1.80314.55213.18322.168P0.102<0.001<0.001<0.001

MAGE-C2 mRNA的表達與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期等臨床特征無關(guān)，說明其表達與NSCLC的惡性程度及疾病的進展無關(guān)。由于該研究所選取的樣本量較小，尚需進一步擴大樣本量以證實該研究結(jié)果的準確性。

MAGE-A3、MAGE-C2 mRNA的共表達與年齡和分期有關(guān)，MAGE-A3、MAGE-C2共表達多見于晚期患者和年輕患者中。據(jù)文獻[13]報道，許多腫瘤往往不是單一表達一種MAGE，因此應(yīng)用聯(lián)合性肽疫苗能靶向消滅表達不同抗原的腫瘤細胞，從而起到治療作用。

作者猜測MAGE-A3對NSCLC分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響是通過促進肺癌細胞的惡性生物學(xué)功能如侵襲、轉(zhuǎn)移來發(fā)揮的。體外實驗結(jié)果顯示，MAGE-A3、MAGE-C2在2種肺癌細胞中均表達，且在A549細胞表達較高，因此作者選擇了A549細胞進行下一步研究。作者采用基因沉默技術(shù)使肺癌細胞本體表達的MAGE-A3下調(diào)后體外實驗檢測其凋亡、成球及侵襲能力。實驗結(jié)果證明，MAGE-A3表達降低對細胞凋亡率沒有影響，細胞成球能力和侵襲能力受抑制。結(jié)果表明MAGE-A3通過增強肺癌細胞惡性增殖及浸潤轉(zhuǎn)移能力來參與疾病進展。

綜上所述，該研究結(jié)果提示MAGE-A3或MAGE-C2在NSCLC組織中具有較高的表達率。檢測患者腫瘤組織中MAGE-A3、MAGE-C2的表達能夠判斷NSCLC患者的預(yù)后。該研究結(jié)果對于下一步針對肺癌進行MAGE-A3或MAGE-C2基因靶向治療及免疫治療研究具有指導(dǎo)意義。

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(2017-04-07收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Expressions of MAGE-A3 and MAGE-C2 mRNA in non-small cell lung carcinoma tissue

MAXing1),CHENXinfeng2),ZHANGChaoqi2),QIAOYamin2),ZHANGYi1,2),WANGLiping1)

1)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)BiotherapyCenter,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

non-small cell lung cancer;MAGE-A3;MAGE-C2

Aim: To analyze the expressions of MAGE-A3 and MAGE-C2 mRNA in non-small cell lung cancer(NSCLC) tissue and the relationship between their expressions and clinical pathological characteristics. Methods: Tumor tissue was collected from 206 patients diagnozed as NSCLC. Real-time PCR was performed to detect the expressions of MAGE-A3 and MAGE-C2 mRNA. The correlation of clinicopathological characteristics(gender, age, histologic grading, pathological type, lymph node metastasis, clinical stage) with the expressions of MAGE-A3 and MAGE-C2 mRNA in NSCLC tissue was evaluated. Then siRNA was used to down-regulate the expression of MAGE-A3 in A549 cells and the effects of MAGE-A3 knockdown on biology behavior of A549 cells were observed.Results: The mRNA expression rates of MAGE-A3 and MAGE-C2 in NSCLC tissue were 73.3%(151/206) and 52.9%(109/206), respectively. The mRNA expression of MAGE-A3 was associated with clinical stage and lymph node metastasis(P<0.05). However, there was no relation between MAGE-C2 mRNA expression and clinical characteristics(P>0.05). The mRNA coexpression of MAGE-A3 and MAGE-C2 was associated with age and clinical stage(P<0.05).MAGE-A3 knockdown led to decrease of sphere formation, invasion, and metastasis abilities of cells(P<0.001).Conclusion: MAGE-A3 and MAGE-C2 are expressed in NSCLC at high level; MAGE-A3 and MAGE-C2 might be potential target antigens for immunotherapy of NSCLC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.016

R734.2

*國家自然科學(xué)基金資助項目 81171986，81271815；科技部國家重點研發(fā)計劃 2016YFC1303500

#通信作者，女，1963年5月生，博士，教授，研究方向：腫瘤的化療和免疫治療，E-mail：wlp@zzu.edu.cn