CAR-T細(xì)胞療法的自動化設(shè)備及展望

聶簡琪，孫楊，楊艷坤，戴曉峰，劉秀霞，詹錦玲，白仲虎

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122

CAR-T細(xì)胞療法的自動化設(shè)備及展望

聶簡琪1，2，孫楊1，2，楊艷坤1，2，戴曉峰1，2，劉秀霞1，2，詹錦玲1，2，白仲虎1，2

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞療法是近年來發(fā)展非常迅速的一種細(xì)胞治療技術(shù)。通過從患者或者捐獻(xiàn)者外周血分離獲得T細(xì)胞，并進(jìn)一步激活、基因修飾、擴(kuò)增從而獲得CAR-T細(xì)胞，洗滌濃縮后回輸患者體內(nèi)進(jìn)行治療。修飾后的T細(xì)胞腫瘤靶向性、殺傷活性更強(qiáng)，在血液腫瘤疾病臨床試驗(yàn)中療效明顯，在實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中也嶄露頭角。CAR-T細(xì)胞療法整個過程的安全性、無菌性、純度等質(zhì)量控制極其重要。確保CAR-T細(xì)胞療法生產(chǎn)過程的標(biāo)準(zhǔn)化、封閉化與自動化，做到藥效和風(fēng)險可控是首要任務(wù)。對CAR-T細(xì)胞療法工藝與自動化設(shè)備以及面臨的工程化問題進(jìn)行綜述，以期為CAR-T細(xì)胞療法工程化提供參考。

CAR-T細(xì)胞；細(xì)胞治療；自動化設(shè)備；工程化

楊艷坤，博士，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室副教授，碩士生導(dǎo)師。研究內(nèi)容包括哺乳動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)；外源蛋白表達(dá)，特別是生物醫(yī)藥活性蛋白的高效表達(dá)和純化；發(fā)酵工程過程優(yōu)化及放大技術(shù)；通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等研究代謝工程及代謝調(diào)控機(jī)理。主持項目包括“863”子課題1項、國家自然基金項目2項、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目1項、省級項目3項、市級項目1項。發(fā)表學(xué)術(shù)論文20多篇，參編著作2部，申請專利20多項。E-mail：yangyankun@jiangnan.edu.cn

工程化T細(xì)胞在不同共刺激分子的作用下，可能發(fā)揮不同的作用，對某些癌癥的療效也可能比其他治療方法更好，這一觀點(diǎn)已被大眾所接受。過繼T細(xì)胞免疫治療的特點(diǎn)在于平衡免疫系統(tǒng)的各個組成部分，以達(dá)到理想的臨床效果，這為醫(yī)學(xué)界帶來了一種劑量概念化的新方法。因此，為了能夠優(yōu)化治療方案、根據(jù)不同案例具體分析、針對每種類型的惡性腫瘤甚至每個患者都達(dá)到最佳治療效果，就需要科學(xué)工作者和相關(guān)醫(yī)療公司不斷深入研發(fā)。

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，以嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）修飾T細(xì)胞的治療技術(shù)在臨床取得了良好的抗腫瘤效果[1-2]。CAR-T細(xì)胞療法是一種全新的生物免疫治療方法，其通過提取患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)改造，形成嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T），被重新編碼的T細(xì)胞就能獲得特異性識別和攻擊殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有顯著的療效，被認(rèn)為是最有前景的腫瘤治療方式之一[3-4]。

CAR-T細(xì)胞療法治療過程主要包括：從捐獻(xiàn)者或者患者收集外周血、T細(xì)胞分離并激活、T細(xì)胞修飾、T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)達(dá)到治療級別的細(xì)胞數(shù)、CAR-T細(xì)胞回輸。目前大多數(shù)操作仍依靠手工或半自動化操作，無法提供質(zhì)量穩(wěn)定的CAR-T細(xì)胞，而CAR-T細(xì)胞療法真正普及進(jìn)入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵是實(shí)現(xiàn)其過程的標(biāo)準(zhǔn)化、工程化、封閉化與自動化，這也是CAR-T技術(shù)最終被批準(zhǔn)上市的重要環(huán)節(jié)。

在CAR-T細(xì)胞療法的開發(fā)上，美國處于領(lǐng)先水平，我國在此領(lǐng)域開展的CAR-T臨床試驗(yàn)數(shù)量多達(dá)23項，僅次于美國，已然走在了國際前列。2016年11月7日，我國發(fā)布的“十三五”時期的《醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃指南》，CAR-T細(xì)胞治療正式被列入其中。目前，盡管CAR-T細(xì)胞治療尚未進(jìn)入市場[5]，但美國各大分析機(jī)構(gòu)預(yù)測，其基于CAR-T細(xì)胞療法的腫瘤治療市場空間可能達(dá)到350億～1000億美元，中國市場可能達(dá)到1000億元。

1 T細(xì)胞分離

外周血單個核細(xì)胞（PBMC）即外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。T細(xì)胞主要從捐獻(xiàn)者或者患者收集外周血中分離獲得，分離方法主要為密度梯度離心法和免疫吸附法。

1.1 離心法——全自動血細(xì)胞分離機(jī)

離心法主要原理為利用血液中成分的比重差異，經(jīng)過離心分層，將不同組分分別收集，從而獲得所需的成分。20世紀(jì)50年代初開發(fā)出了第一臺封閉式的血液分離機(jī)，經(jīng)過逐步改進(jìn)，血細(xì)胞分離機(jī)已可以實(shí)現(xiàn)全自動化操作。全自動血細(xì)胞分離機(jī)工作的基本步驟是：在泵的抽取和驅(qū)動下，抽取供血者部分全血并導(dǎo)入分離腔中，根據(jù)血液成分密度、體積、黏度等的不同通過離心形成不同血液成分層，分離機(jī)通過不同蠕動泵的動作配合采集所需成分血，并將其余成分回輸人體[6-7]（圖1）。

分選的PBMC細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后可直接進(jìn)行后期的T細(xì)胞激活[8]。由于單核細(xì)胞在37℃能夠快速吞噬磁珠，降低了T細(xì)胞活化和擴(kuò)增的能力，可對PBMC進(jìn)行CD3+T細(xì)胞分選，去除單核細(xì)胞，提高T細(xì)胞純度。

圖1 MCS+9000 全自動血細(xì)胞分離機(jī)及其原理

1.2 免疫吸附法——細(xì)胞分選儀

離心法通過梯度離心將外周血分層從而獲得的外周血單個核細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。但該方法只能對T細(xì)胞進(jìn)行初步的分離以及富集，收獲的細(xì)胞仍含有單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等。體外擴(kuò)增前，對潛在的最有效的T細(xì)胞亞群進(jìn)行精確檢測和分離可提高治療的效果[2]。免疫吸附法基于磁珠分離技術(shù)，在CAR-T細(xì)胞療法中有十分廣泛的應(yīng)用[9-10]，原理為將包被有抗體的磁珠與處理樣品孵育，再利用磁選法進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞的富集或者去除不需要的細(xì)胞[11]。免疫吸附法的自動化設(shè)備為細(xì)胞分選儀。如STEMCELL Technologies公司研發(fā)的RoboSepTM-S全自動磁性細(xì)胞分選儀（圖2）非常適合進(jìn)行多樣本處理，可一次同時分選4個樣本，也可以從一個樣本中依次分選出4種不同類型的細(xì)胞，設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定可靠。

圖2 RoboSepTM-S全自動磁性細(xì)胞分選儀

2 T細(xì)胞激活與修飾

T細(xì)胞是原代血液系統(tǒng)細(xì)胞，懸浮生長，無法于體外增殖，無外界細(xì)胞因子作用下僅能短期（3～4d）體外培養(yǎng)[8]，激活后T細(xì)胞可進(jìn)行增殖，擴(kuò)增到8倍左右[6]。T細(xì)胞的完全活化基于雙信號和細(xì)胞因子的作用，T細(xì)胞活化的第一信號由TCR（T細(xì)胞受體）識別抗原-MHC（主要組織相容性抗原）復(fù)合物啟動；T細(xì)胞活化的第二信號來自協(xié)同刺激分子，即APC（抗原呈遞細(xì)胞）表達(dá)的協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體或配體相互作用介導(dǎo)的信號。這些信號被傳送到細(xì)胞核后，會引起T細(xì)胞的克隆性增殖、細(xì)胞表面活化標(biāo)記物的上調(diào)、效應(yīng)細(xì)胞的分化、細(xì)胞毒性誘導(dǎo)或細(xì)胞因子分泌、凋亡誘導(dǎo)反應(yīng)等。共刺激分子包括CD28、CD137（4-1BB）、CD134（OX40）等多種，而應(yīng)用最廣泛的共刺激分子是 CD28[8，12-13]。

利用DC細(xì)胞（樹突狀細(xì)胞）以及抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞的激活在臨床應(yīng)用中有諸多困難[14]。利用包被CD3/CD28單克隆抗體的磁珠來激活T細(xì)胞可不需要抗原呈遞細(xì)胞和抗原就能激活和擴(kuò)增調(diào)節(jié)T細(xì)胞。固相結(jié)合的高密度抗CD3抗體可引起T細(xì)胞TCR-CD3復(fù)合體的交聯(lián)，直接產(chǎn)生活化信號，用CD28這一最重要的第二信號來增強(qiáng)T細(xì)胞的活化與增殖[15]（圖3），磁珠通過磁選即可從培養(yǎng)物中分離出來[16]。目前商業(yè)化的CD3/CD28偶聯(lián)磁珠主要為DynabeadsTM系列（Life Technologies公司），也是目前應(yīng)用最為廣泛的產(chǎn)品[17]。

圖3 CD3/CD28單克隆抗體的磁珠激活T細(xì)胞原理

慢病毒可感染增殖及靜止期的多種類型細(xì)胞，感染效率接近100%，是CAR-T基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱門載體[2]。利用基因工程方法將胞外抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)序列整合成一個完整的序列；將片段克隆至慢病毒載體，將病毒載體轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增；收集上清液并通過過濾、超速離心收集病毒，用于后續(xù)的T細(xì)胞修飾。病毒載體的構(gòu)建主要通過分子操作完成。不同供應(yīng)者的載體純度、穩(wěn)定性等參差不齊，臨床中使用單一來源的質(zhì)?？杀苊膺@一問題，但載體的供應(yīng)商需要符合GMP標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)的量產(chǎn)能力。如Oxford BioMedica公司生產(chǎn)的慢病毒載體，通過多個細(xì)胞工廠生產(chǎn)保證產(chǎn)量，經(jīng)過多輪的過濾與檢測，確保產(chǎn)品的高質(zhì)量[18]。

將分離的T細(xì)胞、培養(yǎng)基、CD3/CD28偶聯(lián)磁珠、病毒混合后加入培養(yǎng)容器中進(jìn)行細(xì)胞激活與修飾，未侵入細(xì)胞的病毒載體可通過換液從培養(yǎng)基中去除[19]。通過補(bǔ)加T細(xì)胞生長因子（如IL-2）促進(jìn)和維持T細(xì)胞的培養(yǎng)效率[17，20]。離心轉(zhuǎn)染法可增加病毒和靶細(xì)胞接觸從而提高轉(zhuǎn)染效率，也是T細(xì)胞修飾的常用方法[8，21]。

3 T細(xì)胞擴(kuò)增

通常1名患者需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細(xì)胞（一般患者體形越大需要的細(xì)胞越多）。為了擴(kuò)增獲得大量用于臨床的CAR-T細(xì)胞，生物反應(yīng)器需要具備良好的氣體傳質(zhì)以及培養(yǎng)基混合性能[18]。用于CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器主要為WAVE bioreactorTM（GE Healthcare Life Sciences公司）[11，18，22-23]，其培養(yǎng)容器為一個已預(yù)先消毒的無菌塑料袋，而袋子被置于一個搖動平臺上。隨著搖動平臺的左右搖動，培養(yǎng)基液體在袋子中形成波浪式的運(yùn)動，起到良好的混合作用，同時這種運(yùn)動方式所產(chǎn)生的剪切力也很小，可以獲得較高的細(xì)胞密度。VueLife?細(xì)胞培養(yǎng)袋（CellGenix GmbH公司）由于符合GMP法規(guī)、無滲出物與浸出物、良好的氣體交換能力，也被應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增[10]。

4 T細(xì)胞收獲與回輸

當(dāng)CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)束后，需要對擴(kuò)增的細(xì)胞進(jìn)行清洗與濃縮，主要利用血液回收機(jī)完成[18]。血液回收機(jī)工作原理與離心法全自動血細(xì)胞分離機(jī)相同，利用梯度離心法將細(xì)胞分離出來，廢液、破碎細(xì)胞及有害成分分流到廢液袋中，用生理鹽水對血細(xì)胞進(jìn)行清洗、凈化和濃縮，最后再把純凈、濃縮的血細(xì)胞保存在血液袋中回輸給病人。血液回收機(jī)也可對分離的外周血單個核細(xì)胞清洗去除分離緩沖液[11]。目前我國市場中國產(chǎn)的血液回收機(jī)（如自體-2000型血液回收機(jī)，北京京精醫(yī)療設(shè)備有限公司，圖4）占有率較高，由于血液回收機(jī)與全自動血細(xì)胞分離機(jī)相同，部分全自動血細(xì)胞分離機(jī)也可實(shí)現(xiàn)該功能。

圖4 自體-2000型血液回收機(jī)

5 討 論

CAR-T細(xì)胞療法是一種非常個性化的療法，產(chǎn)品的供應(yīng)方式與傳統(tǒng)藥物有著根本性的區(qū)別。分離收集T細(xì)胞并進(jìn)行激活，基因修飾和擴(kuò)增細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)是一套復(fù)雜的操作流程。目前大多數(shù)研究采用的是全手工技術(shù)，多數(shù)技術(shù)仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，產(chǎn)品批次不穩(wěn)定，且容易污染。CAR-T細(xì)胞療法整個過程的安全性、無菌性、純度等質(zhì)量控制極其重要[14，19]。因此，實(shí)現(xiàn)CAR-T產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化，做到藥效和風(fēng)險可控是首要任務(wù)。

操作單元的全封閉以及操作單元之間無菌銜接可在最大程度上防止外源物質(zhì)污染。一次性醫(yī)用產(chǎn)品、一次性生物制品相關(guān)技術(shù)的飛速發(fā)展為操作單元之間無菌銜接提供保障。符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的一次性儲液袋、管線、快接頭等產(chǎn)品使得液體轉(zhuǎn)移變得更加有保障，也極大地降低了細(xì)胞在不同處理設(shè)備之間轉(zhuǎn)換的污染風(fēng)險。

2017年7月12日，美國FDA腫瘤藥物專家咨詢委員會（ODAC）以10∶0的投票結(jié)果一致推薦批準(zhǔn)諾華CAR-T療法CTL-019（tisagenlecleucel）上市，CTL-019或?qū)⒊蔀槿蚴讉€獲批上市的CAR-T細(xì)胞療法，這將意味著CAR-T治療時代的到來。與之相配備的設(shè)備、耗材、試劑等產(chǎn)品的銷量也會進(jìn)入爆發(fā)階段。目前CAR-T細(xì)胞療法過程涉及的全自動血細(xì)胞分離機(jī)、細(xì)胞分選儀、T細(xì)胞擴(kuò)增設(shè)備等均為國外品牌，幾乎處于壟斷地位。我國僅在全自動血細(xì)胞分離機(jī)、血液回收機(jī)有國產(chǎn)化設(shè)備，核心的細(xì)胞分選儀、T細(xì)胞擴(kuò)增設(shè)備仍處于空白。我國應(yīng)在CAR-T細(xì)胞療法過程設(shè)備投入研發(fā)精力，研發(fā)具有自主產(chǎn)權(quán)的設(shè)備，尤其是全過程自動化設(shè)備，提高我國的核心競爭力。

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Current automatic devices and outlook for CAR-T cell therapy

NIE Jianqi1，2，SUN Yang1，2，YANG Yankun1，2，DAI Xiaofeng1，2，LIU Xiuxia1，2，ZHAN Jinling1，2，BAI Zhonghu1，2
1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

Chimeric antigen receptor（CAR）-T cell therapy has been a rapidly developing cell therapy technique in recent years. CAR-T cells are generated from the T cells of patients’ or donations’ peripheral blood, followed with activation, genetically modification and expansion. CAR-T cells are washed and concentrated prior to reinfuse into the patients. The modi fi ed T cell with stronger tumor-orientated targeting ability and killing activity has achieved a remarkable effect on the treatment of hematologic tumors and clinical trials of solid tumors. Quality control on the safety, sterility and purity throughout the entire protocol is absolutely crucial. Therefore, the primary task is to ensure the standardization,closing and automation of CAR-T product process. This paper mainly reviewed the process and automatic devices for CAR-T and the problem for engineering, which could provide a reference for the CAR-T cell therapy engineering.

CAR-T cells; cell therapy; automatic devices; engineering

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.006

聶簡琪，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室碩士研究生。研究方向：動物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器的設(shè)計以及培養(yǎng)過程工藝研究

國家自然科學(xué)基金（31570034），國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2013CB733602），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2015AA020802），江蘇省自然科學(xué)基金（BK20150148）