過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療的工業(yè)研究進(jìn)展與展望

梅義，楊思鳴，白仲虎，戴曉峰

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122

過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療的工業(yè)研究進(jìn)展與展望

梅義1，2，楊思鳴1，2，白仲虎1，2，戴曉峰1，2

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122

戴曉峰，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向主要集中在乳腺癌基礎(chǔ)研究、生物信息及相關(guān)學(xué)科交叉研究。發(fā)表SCI文章17篇（第一作者兼/或通訊作者），影響因子之和57.215。2016年入選“江蘇省六大人才高峰高層次”人才支持計(jì)劃，2015年獲得“無(wú)錫市社會(huì)事業(yè)領(lǐng)軍人才”稱號(hào)。E-mail：xiaofeng.dai@jiangnan.edu.cn

隨著商業(yè)化過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療產(chǎn)品在臨床治療中取得成功，過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為一種治療復(fù)雜疾病的新方法。但是實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化并使其成為多種疾病的可靠、安全、有效的治療方法仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。對(duì)過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)所面臨的問(wèn)題進(jìn)行了探討并提出了相關(guān)意見(jiàn)。

過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療；臨床操作；工業(yè)生產(chǎn)

1 發(fā)展歷程

過(guò)繼T細(xì)胞免疫治療（ACT療法）是通過(guò)收集并改造患者自身的免疫細(xì)胞后將其重新注入病人體內(nèi)達(dá)到治療效果的方法，目前被認(rèn)為是癌癥和病毒感染患者高度有效的免疫治療手段[1]。臨床證明，培養(yǎng)與注射自體腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞達(dá)到了治療效果[2-4]。也有報(bào)道稱T淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因修飾調(diào)節(jié)后可使癌細(xì)胞死亡[5]，如急性淋巴細(xì)胞白血病中特異性靶向CD19分子的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞有著顯著的治療效果[6-7]，又如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL）特異性改造后對(duì)黑色素瘤患者同樣有著顯著的治療效果[8-9]。這些有意義的結(jié)果促使了美國(guó)FDA批準(zhǔn)了大量新藥物的開(kāi)發(fā)研究[10-11]。

ACT療法在制藥行業(yè)引起了極大的關(guān)注，目前已有幾家公司在該領(lǐng)域表現(xiàn)十分突出。Lion Biotechnologies是一家致力于商業(yè)化研發(fā)TIL的新型癌癥免疫療法的美國(guó)公司，已獲得美國(guó)國(guó)家癌癥研究所許可協(xié)議，開(kāi)發(fā)用于治療IV期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的TIL。英 國(guó)生物技術(shù)公司Adaptimmune是一家專注于T細(xì)胞受體研發(fā)的公司，其在美國(guó)的幾個(gè)醫(yī)療中心進(jìn)行了9例第一階段的T細(xì)胞治療試驗(yàn)。瑞士制藥企業(yè)Novartis與賓夕法尼亞大學(xué)開(kāi)展全球獨(dú)家性合作，合作開(kāi)發(fā)了一種新型CAR-T細(xì)胞治療藥物CTL019，并建立了臨床試驗(yàn)，該試驗(yàn)可能在2017年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)。Juno Therapeutics是一家基于CAR和T細(xì)胞受體（TCR）的免疫治療公司，公布了其CAR-T治療藥物JCAR015在急性B淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL）治療中的臨床數(shù)據(jù)。Kite Pharma是一家專注于ACT療法研發(fā)的生物科技公司，已經(jīng)與美國(guó)國(guó)家癌癥研究所簽署協(xié)議，開(kāi)發(fā)商業(yè)化TCR和CAR醫(yī)療藥物。2015年報(bào)道了其CAR-T產(chǎn)品KTE-C19-101（ZUMA-1）關(guān)于急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者在第一和第二階段臨床試驗(yàn)的成功，該產(chǎn)品在NHL患者的第二階段臨床試驗(yàn)中已被美國(guó)FDA授予突破性療法認(rèn)定。日本公司Ono Pharmaceutical已經(jīng)與美國(guó)公司Celyad簽署了許可協(xié)議，在日本和韓國(guó)規(guī)模化開(kāi)發(fā)和商業(yè)化生產(chǎn)NKG2D配體靶向同種異體CAR-T細(xì)胞治療藥物NKR-2。

ACT療法不僅在發(fā)達(dá)國(guó)家快速發(fā)展，也在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家快速發(fā)展。以2014年在美國(guó)納斯達(dá)克證券交易所上市的西比曼生物科技公司（CBMG）為例，CBMG與中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院就其CAR-T的臨床試驗(yàn)建立了戰(zhàn)略合作關(guān)系，并于2014年公布了臨床試驗(yàn)結(jié)果（NCT01735604）。該結(jié)果顯示了CD20、CD137和CD3ζ衍生部分共同使用對(duì)晚期彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者有顯著療效[12]。在入選的7例患者中，4例被診斷為腫瘤負(fù)荷可作為有效指標(biāo)用于臨床療效的評(píng)估，3例顯示在3～6個(gè)月后腫瘤明顯消退，治療效率達(dá)到75%[12]。這些結(jié)果首次表明，抗CD20 CAR-T細(xì)胞與減壓調(diào)理方案相結(jié)合可能會(huì)使晚期DLBCL的腫瘤消退。2015年，他們又公布了一項(xiàng)臨床結(jié)果（NCT01864889），該試驗(yàn)使用T細(xì)胞經(jīng)過(guò)修改后表達(dá)B細(xì)胞靶向抗原CD19、4-1BB和CD3ζ衍生部分，用于治療復(fù)發(fā)或化療難治性B-ALL患者[13]。18周后，9例患者（6例患有B-ALL髓外受累、3例患有B-ALL）的總體存活率達(dá)到56%。值得注意的是，7例未接受輔助化療的患者中有4例在造血系統(tǒng)和髓外組織處病情得到明顯緩解。這些結(jié)果證明抗CD19 CAR-T細(xì)胞治療髓外B-ALL有顯著的緩解效果[13]。最近，CBMG的親密合作者Han博士發(fā)表了他們的I期臨床試驗(yàn)結(jié)果，用CAR-CD30 T細(xì)胞治療18例復(fù)發(fā)性或難治性霍奇金淋巴瘤（HL）患者，顯示了CAR-CD30在控制頑固性淋巴瘤病情上的安全性、可行性與療效性[14]。

近年來(lái)，ACT療法在治療癌癥和傳染病方面的重要地位得到了學(xué)術(shù)研究人員和制藥公司的廣泛認(rèn)可。如上所述，幾個(gè)產(chǎn)品的臨床試驗(yàn)和商業(yè)化生產(chǎn)正在進(jìn)行中。然而，鑒于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和不可預(yù)測(cè)的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大產(chǎn)生的潛在危險(xiǎn)性，該療法的異質(zhì)性和特異性要求，以及對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施和個(gè)人生產(chǎn)技能的高要求，使其難以在沒(méi)有持續(xù)研發(fā)以及標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)流程的情況下產(chǎn)生一致和理想的臨床結(jié)果。

2 原 理

ACT療法通過(guò)募集自身的T細(xì)胞來(lái)利用免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)入侵進(jìn)行識(shí)別并組織進(jìn)攻。具有這樣的臨床特征的T細(xì)胞主要有3種：①在體外進(jìn)行分離、活化和擴(kuò)增的TIL；②通過(guò)外周血T淋巴細(xì)胞改造成TCR或特異性識(shí)別腫瘤的CAR；③病毒特異性T細(xì)胞。保證ACT療法成功的關(guān)鍵是避免患者的免疫系統(tǒng)對(duì)重新輸入體內(nèi)的T細(xì)胞進(jìn)行免疫抑制應(yīng)答。因此，常規(guī)方法是在回輸之前對(duì)患者進(jìn)行輔助化學(xué)療法或放射療法，消耗其內(nèi)在免疫細(xì)胞以便體外注入的T細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行繁殖擴(kuò)增[2]。

注射體外擴(kuò)增的TIL已被證明可治療頑固性黑色素瘤[8-9]。具有靶向癌細(xì)胞的T細(xì)胞一般難以收集檢測(cè)，但是在黑色素瘤中這些細(xì)胞能夠輕易地被切片檢測(cè)。近30年來(lái)，TIL治療已經(jīng)被證明可以緩解甚至消除黑色素瘤[15-17]?，F(xiàn)在體外TIL擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)流程方案已經(jīng)確立，包括個(gè)體細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增、收集、洗滌、配制和冷凍保存。然而，這種方案的缺點(diǎn)是多種細(xì)胞的培養(yǎng)以及特異性腫瘤識(shí)別檢測(cè)時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)并且價(jià)格昂貴，因此出現(xiàn)了“簡(jiǎn)化版”TIL培養(yǎng)模式，這種模式的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)大量淋巴細(xì)胞而不是個(gè)體細(xì)胞微量培養(yǎng)，同時(shí)省去了腫瘤識(shí)別篩選步驟。

雖然TIL在治療黑色素瘤方面取得成功，但是由于腫瘤特異性T細(xì)胞難以收集，同樣的方法應(yīng)用到其他癌癥顯然行不通[9]。通過(guò)遺傳修飾使外周血淋巴細(xì)胞具有抗腫瘤活性是理想的治療方案，即常用的TCR和CAR-T治療方案。如NY-ESO-1 TCR[18-19]與CD19-CAR T細(xì)胞[6，20-21]都已取得令人滿意的治療效果。TCR治療是通過(guò)病毒載體給予T細(xì)胞新的受體，使其特異性識(shí)別癌癥抗原，提高識(shí)別與結(jié)合目標(biāo)的能力。通過(guò)患者腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞[22]、人源小鼠模型[23-24]或使用噬菌體展示技術(shù)[25]達(dá)到克隆擴(kuò)增TCR的目的。目前，TCR療法已證實(shí)可以減緩甚至消除黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌和滑膜肉瘤中的腫瘤[19，26]。不過(guò)這一切的前提是TCR必須與患者的免疫系統(tǒng)相適應(yīng)。

CAR是重組抗原受體，主要由3部分組成，分別是特異性識(shí)別癌抗原的受體部分、激活細(xì)胞應(yīng)答的受體部分以及維持T細(xì)胞活性和快速增殖的刺激因子[2]。通過(guò)遺傳修飾將其導(dǎo)入T細(xì)胞后，使得改造后的T細(xì)胞具有特異性靶向作用、免疫應(yīng)答機(jī)制以及快速擴(kuò)增的特點(diǎn)[3-4]。CAR特異性識(shí)別腫瘤是由一段可變單鏈片段決定的，該可變單鏈片段來(lái)源于單克隆抗體或者人源化Fab[27]。一旦表面受體與抗原作用，CAR就會(huì)開(kāi)啟攻擊模式，因此CAR在T細(xì)胞中穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)至關(guān)重要，同時(shí)這也會(huì)影響下游信號(hào)傳導(dǎo)的強(qiáng)度和表達(dá)質(zhì)量，從而確定CAR修飾的T細(xì)胞的功效性和安全性。理論上，任何細(xì)胞表面分子都可以通過(guò)CAR-T方法添加表面抗原識(shí)別受體來(lái)達(dá)到靶向作用[27]。雖然CAR局限于細(xì)胞表面抗原的識(shí)別，但是由于其靈活性和可操作性而普遍被大家所接受。此外，CAR不需要經(jīng)歷抗原加工和呈遞的過(guò)程，可廣泛地適用于人類白細(xì)胞抗原（HLA）臨床樣組。曾有報(bào)道，CAR-T細(xì)胞靶向CD19使晚期慢性淋巴細(xì)胞性白血病（CLL）患者以及多次化療失敗患者的腫瘤狀態(tài)得到緩解[6-7]。

病毒抗原特異性T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為病毒感染和病毒相關(guān)惡性腫瘤的一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)治療措施，具有完善的生產(chǎn)流程。已有使用單核細(xì)胞和EB病毒（EBV）轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞形成的特異性T細(xì)胞對(duì)EBV、巨細(xì)胞病毒（CMV）和腺病毒（AdV）特異反應(yīng)的成功報(bào)道[28]。另有報(bào)道指出，已生產(chǎn)出對(duì)CMV，AdV，EBV，BK病毒（BK）和人類皰疹病毒6（HHP6）這5種病毒有共同特異性的T細(xì)胞，大大降低了生產(chǎn)難度，縮短了生產(chǎn)時(shí)間[1]。

3 加強(qiáng)研發(fā)

工程化T細(xì)胞在不同的共刺激分子的作用下，可能發(fā)揮不同的作用，對(duì)某些癌癥的療效也可能比其他治療方法更好，這一觀點(diǎn)已被大眾所接受。ACT療法的特點(diǎn)在于平衡免疫系統(tǒng)的各個(gè)組成部分，以達(dá)到理想的臨床效果，這為醫(yī)學(xué)界帶來(lái)了一種劑量概念化的新方法。因此，為了能夠優(yōu)化治療方案，根據(jù)不同案例具體分析，使每種類型的惡性腫瘤甚至每個(gè)患者都達(dá)到最佳治療效果，就需要不斷地深入研發(fā)。

ACT療法的局限在于通過(guò)識(shí)別癌細(xì)胞表面抗原達(dá)到靶向治療效果的同時(shí)不與自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)[29]。但實(shí)際上很多癌細(xì)胞中的抗原同樣在正常組織中存在。如用于乳腺癌治療的靶標(biāo)HER2也在心臟細(xì)胞表面表達(dá)。使用低特異性靶向抗原可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，在TCR工程化T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)中，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)，9例患者中有2例在以MAGE-A3為靶標(biāo)后出現(xiàn)了昏迷狀況并致死亡，事后發(fā)現(xiàn)MAGE-A3在腦組織中低水平表達(dá)[2]。Adaptimmune已經(jīng)率先實(shí)施了安全測(cè)試技術(shù)，以防止意外的發(fā)生。同時(shí)，尋找有效的靶向生物標(biāo)志物也變得越來(lái)越重要[29]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，需要進(jìn)一步深入研究以確定新的候選標(biāo)志物，并需要了解每一個(gè)候選標(biāo)志物在全身各處的表達(dá)機(jī)制，以改善ACT療法使其獲得更好的療效。

若想達(dá)到良好的治療效果就需要有足夠量的T細(xì)胞被注入患者體內(nèi)。然而，改造后的CAR-T細(xì)胞會(huì)一直存留患者體內(nèi)造成很多的副作用，甚至觸發(fā)生命危險(xiǎn)。如一名直腸癌患者在CAR-T治療后引發(fā)了一種被稱為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”的不受控制的免疫反應(yīng)使其死亡。另外，一種由CAR-T細(xì)胞引起的免疫雪崩現(xiàn)象也容易引起腫瘤溶解綜合征，其后果是大量的腫瘤死亡后的碎片組織進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，造成更深層次的隱患。ACT療法的安全問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注，專家們已提出了幾種控制ACT療法的副作用的有效策略，并已經(jīng)取得臨床試驗(yàn)的成功，如“自殺基因的設(shè)計(jì)”[30]和“靶向雙重腫瘤抗原”[31]。盡管有這些策略的提出，仍需要進(jìn)一步深入研究才能確保ACT療法成為一項(xiàng)既強(qiáng)大又安全的治療方法。

在進(jìn)行ACT治療前，需要抑制患者的內(nèi)源性免疫應(yīng)答，確保注入體內(nèi)的T細(xì)胞能夠增殖擴(kuò)散。為了達(dá)到更好的效果，通常會(huì)給CAR-T細(xì)胞修飾上共刺激結(jié)構(gòu)域，以增強(qiáng)其增殖能力，強(qiáng)化免疫應(yīng)答的效果。但是這種改造使得發(fā)生不可控副作用的可能性隨之大增[32]。因此，為了在減少副作用的同時(shí)又盡可能地發(fā)揮各種治療效果，還需要不斷深入的研究來(lái)推進(jìn)CAR的設(shè)計(jì)，提高工程T細(xì)胞的穩(wěn)定性。

雖然CAR-T細(xì)胞可以在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存留使其有著預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的功能[33]，但是不可避免地引起了骨髓抑制和肝毒性問(wèn)題。Han等[34]報(bào)道了在臨床病例研究中的白血病患者接受靶向CD33的CAR-T治療后，在后期骨髓中的CD33+白血病細(xì)胞反而逐漸增多出現(xiàn)病情惡化。這警醒著人們必須進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步根據(jù)每個(gè)病人的情況調(diào)整CAR-T產(chǎn)品的有效藥物作用時(shí)間。

最令人期待的是ACT在實(shí)體腫瘤治療中的效果。盡管T細(xì)胞有靶向癌細(xì)胞的功能，但仍需到達(dá)腫瘤部位才能起作用。許多臨床實(shí)例證明對(duì)于白血病來(lái)說(shuō)，運(yùn)輸并不是問(wèn)題，但對(duì)于實(shí)體腫瘤的治療，運(yùn)輸是一道瓶頸[35]。現(xiàn)已表明，將趨化因子受體引入CAR-T細(xì)胞可以提高其運(yùn)輸擴(kuò)散能力[35-37]。最新研究證實(shí)了使用CAR-T混合免疫療法對(duì)于治療膽管癌的可行性[38]，該方法使用了EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）特異性和CD133特異性嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞。2017年同時(shí)啟動(dòng)了一項(xiàng)涉及23例轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者的I期臨床試驗(yàn)，以測(cè)試CAR-T產(chǎn)品靶向腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG-72卷曲CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的功效性和安全性。結(jié)果顯示，CAR-T細(xì)胞成功運(yùn)輸至腫瘤部位并降低了TAG-72表達(dá)，盡管沒(méi)有明確的啟動(dòng)/關(guān)閉腫瘤毒性的證據(jù)，但出現(xiàn)了抗CAR免疫反應(yīng)癥狀[39]。相關(guān)專家現(xiàn)已提出一些特定類型的免疫細(xì)胞，如γδT細(xì)胞，將有希望用于靶向腫瘤的細(xì)胞治療[40]。這些成果令人鼓舞，但目前人們對(duì)于免疫細(xì)胞趨化性和遷移的機(jī)制仍然知之甚少。因此需要在這一領(lǐng)域繼續(xù)深入研究，以期進(jìn)一步完善治療體系。

4 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)規(guī)范

生產(chǎn)基因工程化T細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。首先需要收集患者富含T細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞（PBMC）并將其激活，再進(jìn)行基因修飾，擴(kuò)增達(dá)到臨床所需的細(xì)胞數(shù)量，并在注入體內(nèi)前進(jìn)行活化培養(yǎng)或冷凍保存（圖1）。該產(chǎn)品必須經(jīng)過(guò)多項(xiàng)質(zhì)量監(jiān)控檢測(cè)，達(dá)到生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）的要求。

個(gè)性化先進(jìn)治療藥物（ATMP）的生產(chǎn)同樣復(fù)雜。首先，細(xì)胞制造過(guò)程工作強(qiáng)度大，需要訓(xùn)練有素的操作員進(jìn)行操作。其次，必須具備無(wú)菌環(huán)境并配備足夠的設(shè)施與工具。對(duì)人力技能、衛(wèi)生條件和基礎(chǔ)設(shè)施的高要求一方面導(dǎo)致ACT療法失敗率高，另一方面使得全世界只有少數(shù)機(jī)構(gòu)具有相應(yīng)的生產(chǎn)能力。

4.1 生產(chǎn)流程

為了使T細(xì)胞療法更有效地服務(wù)大眾，非常有必要對(duì)其制造過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化：①生產(chǎn)安全且有效的細(xì)胞產(chǎn)品；②細(xì)胞可增殖且持續(xù)有效。為實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，筆者提出了一些建議。

一是使用封閉系統(tǒng)。細(xì)胞制備過(guò)程中的每個(gè)操作都可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞污染。為保持無(wú)菌環(huán)境，可使用封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)，在封閉的管道通路中生產(chǎn)細(xì)胞[42]。為保證產(chǎn)品的安全性、有效性以及生產(chǎn)的成本效益，整個(gè)封閉系統(tǒng)至少要保證在環(huán)境等級(jí)10000（ISO 7）及以上的體系中生產(chǎn)運(yùn)行。多種符合GMP要求的培養(yǎng)袋、管道配件、連接器以及無(wú)菌管道焊接共同組成封閉系統(tǒng)。

圖1 基因工程T細(xì)胞生產(chǎn)的經(jīng)典工作流程[41]

二是使用自動(dòng)化操作系統(tǒng)。標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的最佳方式是使其自動(dòng)化，目前市場(chǎng)上有許多設(shè)備可供選擇。在細(xì)胞篩選過(guò)程中，流式細(xì)胞儀是一個(gè)典型代表，但是其需要對(duì)樣品、試劑、儀器、數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和設(shè)置[43]。AutoMACS?分離器（Miltenyi Biotec公司）提供了一種自動(dòng)化生產(chǎn)方案[44]［圖2（a）］，其可以直接從全血或骨髓中分離細(xì)胞，同時(shí)省去了紅細(xì)胞裂解和密度梯度離心步驟。Tecan公司與Miltenyi Biotec公司合作，開(kāi)發(fā)了全自動(dòng)多樣品池隔離工作站，將包括autoMACS?分離器和相關(guān)軟件在內(nèi)的設(shè)備集成到Tecan FreedomEVO?自動(dòng)化液體處理站［圖2（b）］。當(dāng)然，在細(xì)胞篩選過(guò)程中還有其他的設(shè)備選擇，如Biosafe Sepax?（Biosafe Group公司）[45]［圖2（c）］，Elutra?（Terumo公司）[46]［ 圖2（d）］以 及CliniMACS?Plus儀 器（Miltenyi Biotec公司）[47]［圖2（e）］。DynMag?CTS?（Life Technologies公司）［圖2（f）］提供了一種理想的密閉無(wú)菌系統(tǒng)，其設(shè)備使用培養(yǎng)袋和DynaMag磁體技術(shù)[42]進(jìn)行細(xì)胞的“隔離”、“激活”和“級(jí)聯(lián)放大”步驟。還有幾個(gè)設(shè)備也可用于自動(dòng)化“級(jí)聯(lián)放大”步驟。GE Healthcare Life Sciences公司開(kāi)發(fā)了XuriTM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)［圖2（g）］，其允許細(xì)胞在連接到放置在搖擺平臺(tái)上的氣體控制單元的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)擴(kuò)增并且能夠保持所需溫度[48]。同時(shí)還設(shè)計(jì)了WAVE bioreactorTM（GE Healthcare Life Sciences公司）[49]［圖2（h）］用于大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞。G-Rex?技術(shù)（Wilson Wolf公司）［圖2（i）］支持錐形瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)出高密度的細(xì)胞[50-51]。G-Rex?比XuriTM更好之處在于其能在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)聯(lián)級(jí)放大的同時(shí)使用泵來(lái)控制補(bǔ)料[52-53]，然而缺陷是細(xì)胞接種期間需要打開(kāi)瓶口，不能保證百分百的密閉無(wú)菌環(huán)境。在“培養(yǎng)”步驟中，Biosafe Group公司推出的Se fi a平臺(tái)［圖2（j）］展示了最先進(jìn)的多功能封閉系統(tǒng)，通過(guò)結(jié)合連續(xù)流離心、溫度調(diào)節(jié)、8個(gè)獨(dú)立的流體路徑和智能過(guò)程控制，可以按照專門的操作標(biāo)準(zhǔn)“FlexCell”，以快速和全自動(dòng)的方式實(shí)現(xiàn)純化、濃縮、洗滌，最終培養(yǎng)出大量細(xì)胞。此外，COBE?2991（Gambro BCT公司）［圖2（k）］是一款被廣泛認(rèn)可的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其減少了對(duì)潔凈室設(shè)施的需求[54]。CliniMACS Prodigy?（Miltenyi Biotec公司）［圖2（l）］提供了一款可以完成從細(xì)胞制備、選擇、活化、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)導(dǎo)到培養(yǎng)整個(gè)流程的自動(dòng)化設(shè)備[55]，目前已被用于臨床干細(xì)胞富集和病毒反應(yīng)性T細(xì)胞制備[56-58]，隨后被改造用于T細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以及CAR-T細(xì)胞的自動(dòng)化培養(yǎng)[59]。

圖2 免疫治療設(shè)備舉例

三是商業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)化。為了滿足商業(yè)化需求，有一種生產(chǎn)模型叫“流水線生產(chǎn)”，在這個(gè)模型中，待生產(chǎn)的產(chǎn)品從一個(gè)站點(diǎn)移動(dòng)到另一個(gè)站點(diǎn)，即原材料在處理站中由訓(xùn)練有素的工作人員進(jìn)行記錄、集中、激活，再移動(dòng)到下一個(gè)站點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，再轉(zhuǎn)移到相鄰的站點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞增殖，最后在一個(gè)站點(diǎn)進(jìn)行性能檢測(cè)后分裝凍存。已經(jīng)有公司建立了T細(xì)胞制造的模塊化平臺(tái)，其中由BioSpherix公司設(shè)計(jì)的Xvivo多功能細(xì)胞工作站是典型的例子。雖然模塊化生產(chǎn)流水線簡(jiǎn)易了生產(chǎn)的過(guò)程，但仍然需要高技能操作員的操作處理。另一種模型是“單個(gè)設(shè)備生產(chǎn)模型”，它的特點(diǎn)是一個(gè)設(shè)備只用于生產(chǎn)一個(gè)患者產(chǎn)品，通過(guò)最小化用戶交互來(lái)解決上述問(wèn)題。在這個(gè)模型中，每個(gè)設(shè)備獨(dú)立運(yùn)行，一個(gè)人可同時(shí)監(jiān)督幾個(gè)單元。除了自動(dòng)化程度的提高，該模型還可以防止由于每個(gè)工作單元的物理劃界造成的交叉污染，并提高設(shè)備的綜合利用。如該模型可實(shí)現(xiàn)在兩個(gè)運(yùn)行程序間改變多個(gè)設(shè)備的設(shè)置而不改變細(xì)胞培養(yǎng)模式。這為該模型賦予了高度的靈活性和適應(yīng)性，因?yàn)橐粋€(gè)生產(chǎn)單元的功能障礙不影響其他產(chǎn)品，并且可以被另一個(gè)生產(chǎn)單元快速替換。

4.2 來(lái)源材料

工程化T細(xì)胞的來(lái)源均是患者自身，收集患者體內(nèi)的T細(xì)胞并經(jīng)改造修飾后再重新注回患者體內(nèi)，這就決定了初始T細(xì)胞的狀態(tài)和性質(zhì)的不一致性。由于患者在接受化療或者放療過(guò)程中其自身T細(xì)胞含有各種水平的抑制因子掩蓋了T細(xì)胞的正常功能[60-62]，選擇合適的T細(xì)胞來(lái)源至關(guān)重要，目前有兩種策略來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。

一是除去T細(xì)胞中的抑制因子。已經(jīng)有報(bào)道證明去除這些抑制因子后T細(xì)胞的治療效果明顯提高[63]。使用表面覆蓋有抗CD13和抗CD28的磁珠及其相應(yīng)裝置達(dá)到分離篩選和富集目的，也是一種有效的方法[64]。

二是使用特定的T細(xì)胞亞群。如記憶干細(xì)胞就是一種較好的原始材料。又如針對(duì)巨細(xì)胞病毒或EB病毒的內(nèi)源性抗原反應(yīng)性記憶T細(xì)胞，已被用于基因工程的源代T細(xì)胞[65]。

4.3 病毒載體

病毒載體被認(rèn)為是CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)過(guò)程的關(guān)鍵原料，因?yàn)檎撬鼘AR導(dǎo)入T細(xì)胞內(nèi)形成嵌合型抗體T細(xì)胞。且病毒載體可以大量生產(chǎn)并保存簡(jiǎn)單，在--80℃下可穩(wěn)定保存4～9年[66-68]。

商業(yè)化CAR-T細(xì)胞的高效性和穩(wěn)定性與病毒載體的選擇以及載體優(yōu)化息息相關(guān)。常用的載體是基于γ病毒和慢病毒的復(fù)制缺陷型載體系統(tǒng)。慢病毒載體保留感染不分裂細(xì)胞的能力，因此具有很高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。第三代最小慢病毒載體在安全性能方面進(jìn)一步提高[69-70]。

4.4 輔助材料

ACT產(chǎn)品的安全性、純度以及效率的高低不僅與自身質(zhì)量有關(guān)，與形成過(guò)程中的輔助材料也密不可分。這些輔助材料包括抗體、細(xì)胞因子、血清和病毒載體等。只有這些材料組分有效、穩(wěn)定地形成一個(gè)完整的體系，才能得到更好的產(chǎn)品。

同時(shí)，所有試劑必須遵循USP〈1043〉關(guān)于輔助材料的規(guī)定。需要注意的是由于其易變異的性質(zhì)限制了一些自然資源的使用[71]。如細(xì)胞培養(yǎng)基必須是無(wú)血清的以降低被瘋牛?。˙SE）病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。

4.5 質(zhì)量控制

由于原材料的異質(zhì)性和生產(chǎn)過(guò)程的復(fù)雜性，需要仔細(xì)檢測(cè)產(chǎn)品的最終性能，如安全性、純度和效能，以符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[72]。與普通醫(yī)療產(chǎn)品相比，個(gè)性化治療產(chǎn)品需要對(duì)質(zhì)量進(jìn)行更嚴(yán)格的把關(guān)，無(wú)論是材料的數(shù)量還是細(xì)胞產(chǎn)品的檢測(cè)時(shí)間都應(yīng)當(dāng)受到嚴(yán)格的控制，同時(shí)對(duì)凍存或者運(yùn)輸過(guò)程的產(chǎn)品質(zhì)量也要時(shí)時(shí)檢測(cè)。這就要求，質(zhì)量控制步驟需要簡(jiǎn)單化和標(biāo)準(zhǔn)化，以避免出錯(cuò)，產(chǎn)生不可靠數(shù)據(jù)。

自動(dòng)化有助于質(zhì)量控制流程的標(biāo)準(zhǔn)化。如流式細(xì)胞法分析培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目，就受益于自動(dòng)染色、獲取和分析過(guò)程；使用LIMS（實(shí)驗(yàn)室信息和管理系統(tǒng)）自動(dòng)采集和分析數(shù)據(jù)流可以快速生成標(biāo)準(zhǔn)化報(bào)告從而大大減少工作量。

利用自動(dòng)跟蹤和批量記錄技術(shù)，從原材料采樣到患者回輸整個(gè)過(guò)程都進(jìn)行跟蹤監(jiān)控以確保細(xì)胞的質(zhì)量[26]。也有報(bào)道稱，自動(dòng)配料記錄系統(tǒng)與過(guò)程控制、質(zhì)量控制系統(tǒng)緊密聯(lián)系在一起，可以在生產(chǎn)結(jié)束后得到單個(gè)的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)記錄[41]，這樣可以比較不同制造場(chǎng)所和不同工藝下產(chǎn)品的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)，有助于對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行改進(jìn)。

4.6 管理?xiàng)l例的完善

臨床細(xì)胞產(chǎn)品的制造應(yīng)該得到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注并且有詳細(xì)的法律法規(guī)來(lái)規(guī)范生產(chǎn)。所有的產(chǎn)品都應(yīng)該符合GMP規(guī)定。在歐美國(guó)家/地區(qū)都有明確的法律法規(guī)對(duì)生產(chǎn)商有詳細(xì)的規(guī)定，如第1394/2007號(hào)歐洲法規(guī)中的ATMP要求、美國(guó)衛(wèi)生與人類服務(wù)部文件中的“人體細(xì)胞治療和基因治療指南”等。而我國(guó)在此方面相對(duì)薄弱，因此需要相關(guān)部門行動(dòng)起來(lái)，健全相關(guān)生產(chǎn)的法律法規(guī)。

5 展 望

ACT細(xì)胞療法具有巨大的發(fā)展前景，已成為全球治愈癌癥腫瘤的重要方法之一。在此背景下，其生產(chǎn)模式發(fā)展為學(xué)術(shù)和商業(yè)的合作伙伴關(guān)系，前者負(fù)責(zé)研發(fā)和測(cè)試新穎的想法，后者負(fù)責(zé)工業(yè)擴(kuò)大使其成為醫(yī)療產(chǎn)品，如賓夕法尼亞大學(xué)與諾華公司的合作、中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院與CBMG的合作等。這種模式對(duì)該領(lǐng)域的可持續(xù)發(fā)展有著重要的影響。

同時(shí)，ACT細(xì)胞療法也不可避免地面臨著一系列的挑戰(zhàn)。由于其本身的異質(zhì)性，人們始終質(zhì)疑其臨床的安全性、穩(wěn)定性以及實(shí)際效果[73]。雖然早在20世紀(jì)80年代末期就提出了CAR療法，但目前只在小型臨床試驗(yàn)中取得成果[2]，因此想要擴(kuò)大CAR的應(yīng)用范圍使其商業(yè)化和大眾化，還需要廉價(jià)、快速和自動(dòng)化的生產(chǎn)制造。也有機(jī)構(gòu)一直在研究使用已有的第三方供體基因修飾的T細(xì)胞用于治療病毒感染的可能性[74]，希望能設(shè)計(jì)出特異性靶向不同患者癌細(xì)胞的獨(dú)特抗原的通用細(xì)胞療法。

相信，ACT細(xì)胞療法一旦成熟將會(huì)成為一項(xiàng)對(duì)抗癌癥和傳染病的強(qiáng)有力的工具，就像20年前的疫苗抗體一樣，為生物醫(yī)藥界帶來(lái)轉(zhuǎn)機(jī)。然而，考慮到目前面臨的種種挑戰(zhàn)，還需要學(xué)術(shù)界、產(chǎn)業(yè)界、監(jiān)管部門的共同努力。

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Commercial progress and prospect in adoptive T cell immunotherapy

MEI Yi1，2，YANG Siming1，2，BAI Zhonghu1，2，DAI Xiaofeng1，2
1. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

With the great success demonstrated by the clinical trials of several commercial products, adoptive T cell immunotherapy has become a novel class of therapeutics for complex disease treatment. However, some major challenges must be met to make engineered T cells a reliable, safe and effective remedy. This paper reviews the fundamental problems remain to be resolved and offers corresponding insights to make adoptive T cell therapy commercialisable.

adoptive T cell immunotherapy; clinical operation; manufacturing

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.009

梅義，江南大學(xué)生物工程學(xué)院、糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室碩士研究生。研究方向：腫瘤及生物信息學(xué)交叉研究

國(guó)家自然科學(xué)基金（31471251），江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161130），江蘇省六項(xiàng)人才高峰計(jì)劃（SWYY-128），重點(diǎn)大學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（JUSRP11507）