T細(xì)胞受體工程T細(xì)胞療法：戰(zhàn)略和挑戰(zhàn)

施煒星，楊春霞

上海宇研生物技術(shù)有限公司，上海 200333

T細(xì)胞受體工程T細(xì)胞療法：戰(zhàn)略和挑戰(zhàn)

施煒星，楊春霞

上海宇研生物技術(shù)有限公司，上海 200333

施煒星，博士，教授，中組部國(guó)家千人計(jì)劃專家，江蘇西迪爾生物技術(shù)公司總裁,上海宇研生物技術(shù)公司首席科學(xué)家。中科院上海生化所博士，美國(guó)加州大學(xué)圣地亞哥分校癌癥中心博士后，師從國(guó)際著名生物學(xué)家、美國(guó)科學(xué)院院士Ajit Varki 教授。曾在美國(guó)強(qiáng)生(Johnson & Johnson) 制藥公司從事特異性免疫細(xì)胞治療和臨床研究15余年，獨(dú)創(chuàng)性地開(kāi)創(chuàng)了確定腫瘤標(biāo)志物的平臺(tái)，并運(yùn)用獨(dú)特的抗原遞呈細(xì)胞株結(jié)合腫瘤抗原建立了免疫細(xì)胞治療腫瘤的平臺(tái)技術(shù)，是美國(guó)大型制藥公司在腫瘤治療領(lǐng)域最早用特異性T細(xì)胞開(kāi)展腫瘤治療研究和臨床的科學(xué)家之一。江蘇省科技協(xié)會(huì)常務(wù)理事，上海精準(zhǔn)醫(yī)療協(xié)會(huì)第一屆委員會(huì)委員，浙江理工大學(xué)兼職教授。曾獲2014年江蘇省雙創(chuàng)人才、2014年中國(guó)醫(yī)藥城創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽一等獎(jiǎng)、上?？茖W(xué)技術(shù)委員會(huì)2016年特異性免疫細(xì)胞治療項(xiàng)目基金資助。E-mail：weixingshi@yahoo.com

T細(xì)胞受體工程T細(xì)胞療法（TCR-T）是腫瘤治療中很有希望的一種特異性過(guò)繼性細(xì)胞免疫療法，該方法主要是將腫瘤抗原特異的TCR基因通過(guò)載體轉(zhuǎn)入自體的淋巴細(xì)胞中，再回輸至病人體內(nèi)以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。目前對(duì)TCR-T的挑戰(zhàn)是腫瘤抗原特異的高親和性的TCR基因的獲取和高度表達(dá)以及TCR雙鏈α和β的正確配對(duì)。除此之外，通過(guò)臨床試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于TCR的高反應(yīng)性，TCR-T會(huì)在靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原的同時(shí)作用于正常組織而產(chǎn)生強(qiáng)的脫靶效應(yīng)，因此，選擇合適的靶抗原也是TCR-T細(xì)胞治療能夠發(fā)揮其優(yōu)越效果的關(guān)鍵因素。對(duì)TCR基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)機(jī)制、TCR配對(duì)的優(yōu)化戰(zhàn)略等TCR-T在腫瘤治療中面臨的挑戰(zhàn)，以及TCR-T的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了探討。

T細(xì)胞受體；過(guò)繼性細(xì)胞治療；TCR-T；脫靶效應(yīng)；臨床試驗(yàn)

過(guò)繼性細(xì)胞治療（adoptive cell therapy，ACT）是目前正快速發(fā)展的腫瘤細(xì)胞免疫治療方法[1-2]。早期的過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療主要是把自體或異體腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使患者腫瘤消退，這種方法在白血病和黑色素瘤治療中已經(jīng)取得一定的成功。自然發(fā)生的腫瘤浸潤(rùn)性 淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）已經(jīng)證明對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者有49%～72%的客觀應(yīng)答率[3]。在黑色素瘤患者中，使用克隆的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocytes，CTL）也顯示出介導(dǎo)腫瘤消除的效果，但是應(yīng)答率低于10%[4]。雖然TIL療法表現(xiàn)出一定的效果，但是到目前為止，TIL細(xì)胞仍沒(méi)有被廣泛應(yīng)用，原因在于TIL療法有較多應(yīng)用的限制。首先，有抗腫瘤活性的TIL必須是由腫瘤產(chǎn)生的，且要有足夠的數(shù)量。除此之外，TIL的一個(gè)最大應(yīng)用限制在于這種療法不能使機(jī)體自主產(chǎn)生有抗腫瘤活性的T細(xì)胞[5]。

最近的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptors，CAR）T細(xì)胞技術(shù)（CAR-T）以及TCR-T技術(shù)作為免疫細(xì)胞治療的最新、最有效的技術(shù)，受到了廣泛的關(guān)注和研究。CAR-T和TCR-T 都是通過(guò)識(shí)別腫瘤抗原來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞的，但兩者在腫瘤抗原識(shí)別和受體結(jié)構(gòu)方面相差很大。構(gòu)建CAR基因結(jié)構(gòu)相對(duì)容易，它含有識(shí)別腫瘤抗原的單鏈抗體（scFv）序列和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域，可以直接激活T細(xì)胞。CAR-T在治療復(fù)發(fā)性或難治性血液系統(tǒng)惡性腫瘤上已經(jīng)產(chǎn)生了驚人的結(jié)果，但是由于實(shí)體瘤的異質(zhì)性以及免疫微環(huán)境的抑制作用，CAR-T實(shí)體瘤的治療還有待進(jìn)一步研究[6]。而TCR-T細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)了TCR的α鏈和β鏈，α鏈和β鏈依賴T細(xì)胞內(nèi)的CD3分子和一些共刺激分子傳導(dǎo)信號(hào)，最終激活T細(xì)胞。TCR基因的構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜，TCR基因表達(dá)有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）的限制，需要對(duì)TCR的α鏈和β鏈亞型鑒定，優(yōu)化配對(duì)后才能獲得高親和性的TCR序列。一些報(bào)道已顯示TCR-T在治療晚期滑膜肉瘤和惡性黑色素瘤上效果比較明顯[7]，較之于CAR-T細(xì)胞治療，TCR-T具有一些關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。①通過(guò)使用完整的TCR復(fù)合物的全信號(hào)能力，更強(qiáng)、更全面地激活工程化的T細(xì)胞；②MHC分子對(duì)腫瘤表面抗原的獨(dú)立識(shí)別；③在免疫突觸中可募集與TCR自然結(jié)合的所有共刺激受體；④具有對(duì)抗T細(xì)胞衰竭和免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的措施。TCR-T是從有靶向腫瘤活性的T細(xì)胞中克隆出TCR基因之后轉(zhuǎn)導(dǎo)到正常T細(xì)胞里而得到TCR工程化的T細(xì)胞。這種經(jīng)TCR工程化的T細(xì)胞能在體外培養(yǎng)中產(chǎn)生大量腫瘤抗原特異性的CTL細(xì)胞，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，回輸?shù)襟w內(nèi)后，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的消除，特異地靶向和殺傷腫瘤細(xì)胞，用于對(duì)腫瘤患者的治療。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞克隆的TCR基因的鑒定工作也較以往更加簡(jiǎn)單[8]。因此，這種以TCR為基礎(chǔ)的免疫細(xì)胞療法顯示出了無(wú)可取代的優(yōu)越性。以下將重點(diǎn)介紹在TCR工程化T細(xì)胞應(yīng)用中特異的腫瘤抗原的選擇、TCR基因表達(dá)和配對(duì)、高親和力TCR的篩選等挑戰(zhàn)性問(wèn)題，以及TCR-T臨床試驗(yàn)方面的研究進(jìn)展。

1 TCR-T細(xì)胞治療中的抗原選擇

TCR-T細(xì)胞治療的第一步是選擇適當(dāng)?shù)哪[瘤抗原特異的T細(xì)胞。一般腫瘤抗原分為兩類，第一類是病毒來(lái)源的或僅在腫瘤組織上表達(dá)的腫瘤特異性抗原（tumor speci fi c antigen，TSA），大多數(shù)TSA是由基因的隨機(jī)突變引起的，在不同的患者之間差別很大。第二類是腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA），許多人類TAA是非突變的自身抗原，在不同個(gè)體間共同表達(dá)，這些正常的分化抗原，在腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。目前，幾乎所有臨床試驗(yàn)中的TCR-T細(xì)胞治療所選擇的靶點(diǎn)都是針對(duì)TAA進(jìn)行的，如gp100、MART-1、Tyrosinase[9-10]等。

除了TAA，許多研究集中在癌睪抗原（cancertestis antigen, CTA）。CTA是一種免疫原性蛋白，通常在非MHC表達(dá)的睪丸生殖細(xì)胞中正常表達(dá)，已發(fā)現(xiàn)胎兒時(shí)期的卵巢能表達(dá)多種CTA，成人的卵巢也有少量表達(dá)。另外，一些研究也發(fā)現(xiàn)CTA并不嚴(yán)格限制于正常睪丸中表達(dá)，在其他一些正常組織上也有表達(dá)。CTA在許多腫瘤細(xì)胞中是異常表達(dá)的，CTA基因大多定位在人類X染色體上，第一個(gè)CTA MAGE-A1是在黑色素瘤患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的?，F(xiàn)在許多CTA基因被確定在多種腫瘤上表達(dá)，如黑色素瘤、膀胱癌、肺癌和肝癌。除了MAGE家族基因，NYESO-1也在各種腫瘤中廣泛表達(dá)，以NY-ESO-1為靶點(diǎn)的TCR-T療法也取得了較好的效果[11]。靶向CTA的優(yōu)點(diǎn)在于T細(xì)胞會(huì)選擇性地消除腫瘤細(xì)胞，并避免或減少對(duì)正常組織的毒性。

除此之外，突變抗原也成為T(mén)CR-T靶標(biāo)選擇的新熱點(diǎn)。突變抗原由于其在腫瘤細(xì)胞中特異性突變的特點(diǎn)，使得TCR-T細(xì)胞治療不會(huì)靶向正常細(xì)胞或組織，增加了其安全性并減小了脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。Inderberg等[12]用轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β受體II的移碼突變（TGFβRIImut）產(chǎn)生的新型多肽篩選出陽(yáng)性CTL克隆并鑒定其TCR序列，該突變?cè)?5%散發(fā)性結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)，由該TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞顯示出明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，增加NOD/SCID荷瘤小鼠生存率的特點(diǎn)。

2 TCR的表達(dá)

成熟T細(xì)胞表面表達(dá)大約10 000～40 000個(gè)TCR分子，表達(dá)水平與抗原反應(yīng)性直接相關(guān)。TCR是由兩條多肽鏈組成的異源二聚體，αβ鏈（約95%T細(xì)胞表達(dá)）或γδ鏈（約5% T細(xì)胞表達(dá)），其結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白類似，每條鏈均由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，且通過(guò)二硫鍵連接。每條鏈的可變區(qū)有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（complementary determining region，CDR），CDR可識(shí)別各類抗原，與MHC-多肽分子形成復(fù)合物。它們的胞內(nèi)區(qū)需要與T細(xì)胞內(nèi)的CD3分子形成復(fù)合物才能發(fā)揮其信號(hào)傳遞功能，其中TCR的β鏈恒定區(qū)（Cβ domain）在TCR與細(xì)胞內(nèi)CD3分子信號(hào)傳遞的過(guò)程中起重要作用[13]。當(dāng)TCR與CD3復(fù)合物的組分CD3γδζ完全組裝時(shí)，TCRαβ分子能在細(xì)胞表面表達(dá)。不完全的組裝會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留在細(xì)胞內(nèi)并最終在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中降解。因此，當(dāng)將外源性TCR引入成熟T細(xì)胞時(shí)，其將與內(nèi)源性TCR產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)CD3分子的關(guān)系，可能會(huì)阻礙外源TCR的表達(dá)[14]。

2.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇

TCR轉(zhuǎn)染的研究大多采用γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)或者是慢病毒載體系統(tǒng)[15]。除了極少數(shù)幾例在治療免疫缺陷病時(shí)用基因轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞時(shí)出現(xiàn)插入突變以外，在過(guò)去的二十年里，幾乎沒(méi)有與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相關(guān)的安全性問(wèn)題的報(bào)告。雖然γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是在臨床試驗(yàn)中基因轉(zhuǎn)染的首選系統(tǒng)，但該系統(tǒng)需要通過(guò)TCR激活T細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，這可能對(duì)它們?cè)隗w內(nèi)擴(kuò)增有一定的局限性。作為替代，慢病毒載體被開(kāi)發(fā)用于TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCR-T的腫瘤免疫治療。慢病毒系統(tǒng)有在缺失TCR活性時(shí)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，可以促進(jìn)完全靜止T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，不需要提前刺激，因此能維持轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在低分化狀態(tài)，這對(duì)過(guò)繼性免疫細(xì)胞療法是有一定好處的。另外，不像γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)先整合在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，慢病毒載體由于其隨機(jī)整合，不容易產(chǎn)生插入突變。

轉(zhuǎn)座子是一個(gè)相對(duì)較新的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，更容易操作且需要較少的前期安全測(cè)試[16-17]。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，轉(zhuǎn)座子能夠完全轉(zhuǎn)化非活化的靜止細(xì)胞，并且不優(yōu)先整合入啟動(dòng)子區(qū)域，這可能使其在插入轉(zhuǎn)化方面更加安全。使用這些方法，基因工程修飾的T細(xì)胞能夠在短期擴(kuò)增，并顯示出抗原刺激，分泌細(xì)胞因子和腫瘤溶解的能力。與病毒上清液相比，大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒DNA所耗資金成本與時(shí)間都較少，因此轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的TCR基因的表達(dá)系統(tǒng)已被證明是可與γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相媲美的表達(dá)系統(tǒng)。

TCR分子是異源二聚體，因此基因的表達(dá)需要同時(shí)表達(dá)α鏈和β鏈。雖然可以用兩個(gè)獨(dú)立的載體表達(dá)兩個(gè)基因，但是這種方法效率不高，并且會(huì)增加插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在研究中，一般由兩個(gè)啟動(dòng)子或者用IRES序列鏈接。位于IRES下游的基因的表達(dá)水平要比IRES上游的基因略差，這可能會(huì)導(dǎo)致TCR的表達(dá)水平不是太好，產(chǎn)生較差的T細(xì)胞反應(yīng)。最近有一些新的有利于兩條鏈的平行表達(dá)的轉(zhuǎn)基因盒被構(gòu)建出來(lái)，比如利用細(xì)小核糖核酸病毒來(lái)源的2A接頭肽。2A肽是首先在小核糖核酸病毒中發(fā)現(xiàn)的一種具有“自剪切”功能的肽鏈，具有2A肽連接的載體能夠產(chǎn)生單獨(dú)編碼TCRα鏈和TCRβ鏈的mRNA。在翻譯期間，核糖體在2A肽序列處的“跳躍機(jī)制”會(huì)造成兩種蛋白質(zhì)的分離。與IRES元件相比，上游基因的表達(dá)不受阻礙，可使α鏈和β鏈同時(shí)優(yōu)化表達(dá)[18]。

2.2 T細(xì)胞的選擇

如果用同時(shí)編碼TCRα和TCRβ基因轉(zhuǎn)入多克隆的T細(xì)胞群，會(huì)發(fā)現(xiàn)一些T細(xì)胞僅表達(dá)轉(zhuǎn)入的α鏈，另一些T細(xì)胞僅表達(dá)β鏈。也就是說(shuō)，不同的細(xì)胞表達(dá)TCR的水平是不同的，細(xì)胞內(nèi)源性的TCR會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)入的TCR表達(dá)水平有一定的影響[14]。因此選擇一個(gè)表達(dá)較“弱”的TCR的T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，使外源的“強(qiáng)”TCR替代內(nèi)源的“弱”TCR，是一個(gè)可行的解決方案。

2.3 密碼子優(yōu)化

一些報(bào)告指出，TCR在細(xì)胞表面的表達(dá)可以通過(guò)優(yōu)化密碼子來(lái)增強(qiáng)[19]。如修飾翻譯起始區(qū)或mRNA結(jié)構(gòu)元件，用高表達(dá)量的人類基因中分布最頻繁的密碼子取代T CR基因中的稀有密碼子，刪除富含AT或GC的序列，隱藏拼接RNA不穩(wěn)定序列等。在乳頭瘤病毒E7特異性TCR的初始研究中，優(yōu)化mRNA序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞中TCR表達(dá)水平的升高。在其他人類和鼠類TCR上也發(fā)現(xiàn)了同樣的效果，并且鼠類TCR的密碼子優(yōu)化提高了小鼠模型中TCR-T的抗腫瘤功效。

2.4 RNA干擾

有報(bào)道指出，小干擾RNA（siRNA）可特異性下調(diào)內(nèi)源性TCR的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)入TCR的表達(dá)和活性的提高[20]。針對(duì)TCRα鏈和β鏈的恒定區(qū)特異性的siRNA可以被整合到逆轉(zhuǎn)錄病毒TCR編碼載體中，導(dǎo)致被轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞中內(nèi)源性TCR的mRNA的顯著減少。同時(shí)，轉(zhuǎn)入的TCR基因可以通過(guò)密碼子的優(yōu)化來(lái)保護(hù)其免受RNAi效應(yīng)，使轉(zhuǎn)入的TCR在T細(xì)胞中的表達(dá)和體外功能均有所增加。

3 優(yōu)化TCR的配對(duì)

由于轉(zhuǎn)基因的TCR與細(xì)胞表面表達(dá)的內(nèi)源性TCR存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，TCR表達(dá)的一個(gè)潛在問(wèn)題在于內(nèi)源性TCR鏈和引入的TCR鏈會(huì)形成混合二聚體。腫瘤特異性錯(cuò)配異源二聚體的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)主要后果。首先，它減少了在細(xì)胞表面上正確配對(duì)的治療性TCR的量，從而有可能降低TCR-T細(xì)胞的功能反應(yīng)性。第二，當(dāng)引入的TCR的單鏈與其內(nèi)源性TCR鏈配對(duì)時(shí)，就會(huì)形成具有不可預(yù)測(cè)的特異性受體，因?yàn)樗鼈儧](méi)有在胸腺中經(jīng)過(guò)自然選擇，會(huì)具有自身反應(yīng)性的風(fēng)險(xiǎn)[21]。而形成混合二聚體所造成的相關(guān)的毒性已在體外和小鼠模型中被觀察到?，F(xiàn)在研究人員已經(jīng)研發(fā)出策略，以防止混合二聚體的形成[19]。

3.1 TCR恒定區(qū)的鼠源化

鼠-人雜交TCRs，即人類受體的恒定區(qū)被鼠源受體恒定區(qū)所取代。與野生型受體相比，通過(guò)這種方式雜交的TCR表達(dá)水平和功能有所升高，也顯示出了工程T細(xì)胞更好的功能，包括高水平的細(xì)胞因子釋放和細(xì)胞殺傷活性[19]。最小的鼠源化TCR變體僅含有小鼠序列的9個(gè)殘基，并且與完全鼠源化的TCR類似，可以增強(qiáng)人源TCR的表達(dá)程度。因此，最小的鼠源化TCR大大降低免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)保留鼠源化的積極效果[14]。

3.2 恒定區(qū)引入半胱氨酸殘基

TCRα鏈和β鏈可以通過(guò)恒定區(qū)中的半胱氨酸二硫鍵共價(jià)連接，比如在TCRα鏈和β鏈的恒定區(qū)引入額外的半胱氨酸殘基，可以增加TCRα鏈和β鏈的配對(duì)效率。研究顯示，與野生型對(duì)相比，經(jīng)半胱氨酸修飾的TCR相比于野生型TCR與HLA-A2的結(jié)合能力更佳[22]。但是最近也有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二硫鍵修飾的TCR在人T細(xì)胞的表達(dá)量并沒(méi)有增加，也不能完全避免與內(nèi)源性TCR發(fā)生錯(cuò)配[19]。

3.3 嵌合TCR分子

有報(bào)道提出用嵌合的TCR分子，可以減少錯(cuò)配的異源二聚體形成。Willemsen等[23]構(gòu)建出單鏈和雙鏈嵌合的TCR分子，不僅不與內(nèi)源表達(dá)的TCR鏈配對(duì)，而且在體外能夠識(shí)別MAGE-A1/HLA-A1陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞。然而，單鏈構(gòu)建體與天然TCR相比，其親和力出現(xiàn)了降低，并且在體內(nèi)腫瘤模型的測(cè)試中發(fā)現(xiàn)單鏈TCR具有較低的效率。Govers等[24]用TCR鏈與CD3ζ融合的方法產(chǎn)生了具有高度優(yōu)先配對(duì)功能的抗原特異性受體。Tao等[25]最近將αβ鏈TCR的恒定區(qū)用γδ鏈TCR的恒定區(qū)替代，產(chǎn)生新的嵌合體TCR，該嵌合體TCR顯示出更高的配對(duì)效率并且不影響轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的功能。

3.4 用γδT細(xì)胞轉(zhuǎn)入TCRαβ基因

避免錯(cuò)配一個(gè)非分子生物學(xué)方法是使用γδT細(xì)胞轉(zhuǎn)入TCRαβ基因，因?yàn)門(mén)CRγδ鏈不能與TCRαβ鏈形成異源二聚體。用MHC限制性TCRαβ基因轉(zhuǎn)化的鼠γδT細(xì)胞能夠裂解腫瘤細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4，并表現(xiàn)出強(qiáng)的抗白血病細(xì)胞的活性[26]。在該研究者在另一篇論文中顯示TCRαβ鏈轉(zhuǎn)化的γδT細(xì)胞在抗原特異性刺激后能在體內(nèi)持續(xù)增殖，不會(huì)出現(xiàn)異源二聚體，在小鼠中顯示出了抗腫瘤的效應(yīng)功能[27]。盡管這些數(shù)據(jù)顯示出建立的γδT細(xì)胞在體內(nèi)具有有效的抗腫瘤反應(yīng)的能力，但有些關(guān)鍵問(wèn)題如歸巢到腫瘤位點(diǎn)和浸潤(rùn)性仍需證明[14]。而且，此方法也有一定的缺點(diǎn)，比如外周血T細(xì)胞中γδT細(xì)胞僅占1%～10%，γδT細(xì)胞在過(guò)繼性細(xì)胞治療中的功能性和持久性還有待研究。

4 提高TCR的親和力

除了提高TCR表達(dá)水平和優(yōu)先配對(duì)，TCR基因療法的關(guān)鍵還在于分離出一個(gè)對(duì)確定的靶抗原有高親和力的T細(xì)胞克隆。TCR的基因可以從有罕見(jiàn)高反應(yīng)性及高親和力的T細(xì)胞的病人中分離，TCR工程化的TCR-T細(xì)胞可以識(shí)別和裂解腫瘤細(xì)胞[28]。由于患者的免疫細(xì)胞會(huì)對(duì)其自體的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，因此研究人員提出了一系列提高TCR親和力，克服患者對(duì)自身腫瘤抗原耐受的策略。

4.1 轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生TCRs

采用HLA轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生抗人腫瘤抗原的TCR。這種方法產(chǎn)生的TCRs親和力較高。通過(guò)這種方法，已經(jīng)分離出一些人類腫瘤抗原，如gp100、CEA和MAGE-A3特異性的小鼠TCR，并顯示了一定的可行性[18]。從原理上說(shuō)，人T細(xì)胞中表達(dá)鼠TCRs可能會(huì)產(chǎn)生潛在的抗轉(zhuǎn)基因免疫應(yīng)答，導(dǎo)致對(duì)人體轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的排斥，但是目前還沒(méi)發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象。

4.2 同種異體產(chǎn)生TCRs

除了用轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生TCRs，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了使用同種異體抗原呈遞細(xì)胞（APC）合并抗原肽刺激T細(xì)胞策略。在增殖產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T細(xì)胞群中，再分離出抗原肽特異的具有高親和力和高反應(yīng)性的單細(xì)胞克隆，進(jìn)一步克隆出TCR。到目前為止，已有報(bào)道使用類似方法分離了T細(xì)胞克隆和TCRs。研究顯示，與從自體分離的T細(xì)胞相比，同種異體抗原肽特異性T細(xì)胞具有更好的抗腫瘤活性和更高的功能親和力，并且這些性質(zhì)可以在相應(yīng)TCRs轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中復(fù)制[29]。

除了以上兩種方法，酵母或噬菌體也顯示出產(chǎn)生高親和性TCRs的能力。酵母、噬菌體能夠成功分離出親和力高的成熟TCR，其Kd值在皮摩爾到納摩爾之間?；パa(bǔ)決定區(qū)α或β鏈的單個(gè)或兩個(gè)的氨基酸替換已經(jīng)顯示出TCR親和性的適度增加，可以增加T細(xì)胞的抗原特異的反應(yīng)性[30]。另外，T細(xì)胞表面蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的N-或O-糖基化具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，例如降低CD8上的糖基的數(shù)目結(jié)果顯示出了對(duì)pMHC和TCR信號(hào)傳導(dǎo)親和力的增加，在TCR鏈恒定區(qū)移除特定的N-糖基化鏈能夠?qū)е耇CR在相似的表達(dá)水平下，出現(xiàn)親和力的增加和腫瘤細(xì)胞的識(shí)別功能的增強(qiáng)[31]。筆者最近也應(yīng)用了自創(chuàng)的人工抗原遞呈細(xì)胞技術(shù)在體外制備腫瘤特異的CTLs，并與美國(guó)iRepertoire公司合作從腫瘤特異的CTLs中克隆了高親和性的NY-ESO-1特異的TCR基因。

5 對(duì)細(xì)胞本身的要求

前文提到T細(xì)胞的選擇會(huì)影響TCR的表達(dá)。同樣，T細(xì)胞作為工程化T細(xì)胞的原材料也會(huì)影響TCR-T的療效。

5.1 細(xì)胞產(chǎn)品的組成

TCR-T療法是要求回輸高度分化的CD8 T細(xì)胞給患者，它們一般有較好的細(xì)胞毒性，但缺乏足夠的復(fù)制能力。由于CD4 T細(xì)胞能提供CTL細(xì)胞維持存活和功能所需要的細(xì)胞因子，現(xiàn)在已公認(rèn)CD8 T細(xì)胞經(jīng)常需要和CD4 T細(xì)胞一起使用。但面臨的問(wèn)題是，由于CD4和CD8 T細(xì)胞最佳培養(yǎng)條件是不同的，CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞在混合注入體內(nèi)前是否需要分開(kāi)培養(yǎng)。另一個(gè)問(wèn)題是從病人身上是否需要分離所獲取的細(xì)胞亞群。優(yōu)點(diǎn)是分離細(xì)胞手段可以除去影響效應(yīng)細(xì)胞的Treg細(xì)胞，以及白血病病人血液中的腫瘤細(xì)胞。但是，這些細(xì)胞操作會(huì)增加許多費(fèi)用。

5.2 T細(xì)胞的最佳分化狀態(tài)

注入的工程化T細(xì)胞需要最佳的分化狀態(tài)才能增殖并且殺傷腫瘤細(xì)胞。除了基因工程給予T細(xì)胞對(duì)腫瘤的特異性識(shí)別，T細(xì)胞本身的特性也影響其療效。T細(xì)胞從初始T細(xì)胞（TN）逐步分化成記憶干細(xì)胞（TSCM）和中央記憶T細(xì)胞（TCM），這些細(xì)胞可以自我增殖，并且進(jìn)一步分化成生存時(shí)間較短的效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）和效應(yīng)T細(xì)胞（TE），這些細(xì)胞可以用細(xì)胞表型分子CD62L和CCR-7來(lái)衡量。因此，選擇分化程度較低的TN作為基因工程的原材料并確定回輸?shù)募?xì)胞處于最佳分化狀態(tài)如TSCM或TCM，可能會(huì)提高工程化細(xì)胞在體內(nèi)的療效。

6 臨床試驗(yàn)

Science雜志在2006年刊登了TCR-T細(xì)胞治療的首次人體臨床試驗(yàn)[32]。在I期臨床試驗(yàn)中，TCR是從切除的黑色素瘤病灶中能識(shí)別MART-1的TIL中克隆得到，從HLA-A2陽(yáng)性的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入了靶向MART-1的TCR。結(jié)果顯示，在TCR-T細(xì)胞輸注后，17例患者中有2例出現(xiàn)腫瘤消退，TCR-T細(xì)胞在回輸后的1年依然能被檢測(cè)到。2009年，有31例患者使用此方法治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，4例患者（13%）出現(xiàn)了腫瘤的衰退[33]。

為了提高TCR的反應(yīng)性，產(chǎn)生更有效的腫瘤反應(yīng)率，可識(shí)別抗原MART-1（27～35表位）的高親和力的TCR被克隆出來(lái)。在此臨床試驗(yàn)中觀察到30%的患者出現(xiàn)癌癥衰退。但是，患者同時(shí)也表現(xiàn)出正常的黑素細(xì)胞在皮膚、眼睛和耳朵被損壞。這說(shuō)明高活性表達(dá)的TCR-T細(xì)胞在介導(dǎo)腫瘤衰退的同時(shí)也作用到了全身表達(dá)相同抗原的正常組織或器官，即所謂的脫靶效應(yīng)（on-target/off-tumor toxicity）。在另一項(xiàng)試驗(yàn)中，黑色素瘤細(xì)胞分化抗原gp100（154～162表位）被用作靶抗原，通過(guò)免疫HLA-A021轉(zhuǎn)基因小鼠克隆出高反應(yīng)性TCR。16例黑色素瘤病人入組該臨床試驗(yàn)，其臨床反應(yīng)率為19%，并也在皮膚、耳朵和眼睛上觀察到了類似的脫靶效應(yīng)[18]。

TCR-T細(xì)胞治療除了被應(yīng)用到靶向黑色素瘤上的臨床試驗(yàn)，也被應(yīng)用到對(duì)其他癌種的細(xì)胞治療中，如治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的TCR-T是靶向癌胚抗原（CEA）[34]。CEA是一種分子量為180kDa的腫瘤相關(guān)糖蛋白，在多種上皮性腫瘤中過(guò)度表達(dá)。3例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者經(jīng)TCR-T治療均出現(xiàn)血清中CEA水平的下降（74%～99%），其中1例出現(xiàn)了可衡量的應(yīng)答。由于CEA也在正常腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，因此病人中也出現(xiàn)了一些可能是靶向正常組織CEA引起的短暫性大腸炎[34]。

癌睪抗原如NY-ESO-1在多種上皮性腫瘤和滑膜細(xì)胞瘤中都有高頻率表達(dá)。NY-ESO-1是一個(gè)睪丸限制性CTA，它的表達(dá)僅限于正常成人睪丸組織，其細(xì)胞不表達(dá)HLA分子，因此不易被TCR識(shí)別。第一例臨床試驗(yàn)使用自體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入靶向NY-ESO-1的TCR在美國(guó)國(guó)家癌癥研究所外科分會(huì)進(jìn)行。在這項(xiàng)試驗(yàn)中，滑膜細(xì)胞肉瘤患者的應(yīng)答率在66%（4/6），黑色素瘤患者的應(yīng)答率為45%（5/11），兩例黑色素瘤患者出現(xiàn)完全應(yīng)答，沒(méi)有病人在接受靶向NYESO-1的TCR-T細(xì)胞后出現(xiàn)脫靶效應(yīng)[35]。這表明癌睪抗原可能是TCR-T細(xì)胞療法的優(yōu)秀靶標(biāo)。

Morgan等[36]在2013年采用自體抗原MAGE-A3的TCR-T細(xì)胞治療的臨床研究中，9例病人中有5例患者經(jīng)歷了癌癥的臨床回歸，有2例病人在輸注后1～2天出現(xiàn)昏迷并死亡。對(duì)這2例病人的磁共振成像分析證實(shí)了腦室周圍出現(xiàn)白質(zhì)軟化，尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)腦部出現(xiàn)了壞死性腦白質(zhì)病變，并伴有與CD3+/CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的大規(guī)模白質(zhì)缺陷。在該研究中使用了TCR識(shí)別MAGE-A3/A9/A12中的表位，而人類大腦樣本進(jìn)行分子試驗(yàn)表明MAGE-A12在人腦中表達(dá)。因此，這可能是TCR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞破壞的導(dǎo)火索。

另一項(xiàng)針對(duì)HLA-A01限制性的MAGE A3抗原（EVDPIGHLY）的TCR-T被用于臨床試驗(yàn)，雖然臨床前體外功能分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何問(wèn)題，但臨床試驗(yàn)中有2例病人卻出現(xiàn)了嚴(yán)重不良反應(yīng)和對(duì)心臟組織致命的毒性。尸檢結(jié)果顯示嚴(yán)重的心肌損傷，組織病理學(xué)分析顯示T細(xì)胞浸潤(rùn)，但是心臟組織未檢測(cè)到MAGE A3基因的表達(dá)。使用氨基酸的掃描方法，找到了產(chǎn)生體內(nèi)毒性的原因是TCR-T交叉識(shí)別了另一個(gè)心臟正常表達(dá)的目標(biāo)肽肌聯(lián)蛋白肽（ESDPIVAQY）并產(chǎn)生免疫反應(yīng)[37-38]。

2014年，一項(xiàng)使用靶向MART-1基因的自體TCR-T細(xì)胞聯(lián)合DC疫苗的臨床試驗(yàn)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者中進(jìn)行，13例病人中有9例（69%）顯示腫瘤消退。MART-1特異性T細(xì)胞數(shù)量在治療后2周內(nèi)在外周血中達(dá)到峰值，表明體內(nèi)快速擴(kuò)增。說(shuō)明TCR-T細(xì)胞聯(lián)合DC疫苗的雙細(xì)胞療法是可行的[9]。

2015年，表達(dá)NY-ESO-1的HLA- 0201陽(yáng)性患者的轉(zhuǎn)移性滑膜細(xì)胞肉瘤或黑素瘤的自體TCR-T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)顯示，61%NY-ESO-1陽(yáng)性滑膜細(xì)胞肉瘤患者（11/18例）和55% NY-ESO-1陽(yáng)性黑素瘤患者（11/20例）顯示出客觀臨床反應(yīng)。預(yù)估的滑膜細(xì)胞肉瘤患者的3年和5年總體生存率分別為38%和14%，而黑色素瘤患者相應(yīng)的估計(jì)存活率均為33%[39]。

2015年，另一項(xiàng)TCR-T的臨床試驗(yàn)是針對(duì)MAGE-A3的HLA-DPB1* 0401陽(yáng)性的腫瘤病人。病人接受了淋巴細(xì)胞清除預(yù)處理方案，然后過(guò)繼轉(zhuǎn)移靶向MAGE-A3 TCR的CD4+T細(xì)胞，并伴隨高劑量IL-2。在I期臨床研究中，治療了14例病人，包括最高劑量水平（78億～1000億細(xì)胞）的6例病人。在TCR-T 對(duì)轉(zhuǎn)移性宮頸癌、食管癌和尿路上皮癌的病人的治療中也觀察到客觀的部分反應(yīng)，證明了表達(dá)靶向MAGE-A3的MHC II類限制性抗腫瘤TCR的自體CD4+T細(xì)胞的安全性和有效性。這是第一個(gè)用基因修飾的CD4+T細(xì)胞免疫治療轉(zhuǎn)移性癌癥的臨床案例[40]。

7 克服腫瘤微環(huán)境對(duì)T細(xì)胞功能的抑制

免疫細(xì)胞在腫瘤部位的遭遇是過(guò)繼性細(xì)胞治療效果決定因素之一，腫瘤的微環(huán)境不利于T細(xì)胞正常發(fā)揮功能。在腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞可以被抑制，而在其他部位或外周血中類似的細(xì)胞則表現(xiàn)出較好的效應(yīng)功能[15]。造成這種現(xiàn)象可能存在以下原因，包括抑制性細(xì)胞因子IL-10[41]和TGF-β[42]的存在，阻斷了TGF-β信號(hào)通路；T細(xì)胞被修飾表達(dá)顯性負(fù)效應(yīng)的TGFβ受體等，最終可以改變TCR-T的效果。另外，T細(xì)胞上的一些抑制性因子如程序性死亡受體PD-1和CTLA-4等也可以抑制TCR-T的效果。為了克服這種抑制，目前免疫療法聯(lián)合了抗PD-1策略，如聯(lián)合PD-1抗體pembrolizumab[43]。由于缺乏生長(zhǎng)因子或共刺激因子，T細(xì)胞輸注后會(huì)發(fā)生凋亡，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)基因工程方法修飾T細(xì)胞使其共表達(dá)抗凋亡基因如Bcl-2來(lái) 解決[44]。一些其他類型的細(xì)胞，如CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，會(huì)抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。通過(guò)去除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞治療的效果。最近也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入MHC-Ⅰ類分子限制性的MART-1抗原特異性TCR基因的CD4+T細(xì)胞也有下調(diào)誘導(dǎo)型Treg細(xì)胞（iTreg）對(duì)免疫反應(yīng)的抑制作用，增強(qiáng)CTL細(xì)胞應(yīng)答的功能[45]?？朔[瘤微環(huán)境的限制也可以用干擾免疫抑制細(xì)胞或通路的小分子，例如使用IDO抑制劑很可能與工程T細(xì)胞達(dá)成協(xié)同作用。

8 結(jié) 論

在過(guò)去幾年，TCR基因轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了重大的進(jìn)展，隨著基因細(xì)胞工程和工藝制造的進(jìn)步，工程化的T細(xì)胞極大地改善了難治性癌癥患者的療效，有意義的臨床應(yīng)答已在黑色素瘤、結(jié)腸癌、滑膜細(xì)胞肉瘤的TCR-T細(xì)胞治療臨床試驗(yàn)中觀察到，說(shuō)明這種方法在惡性腫瘤的治療中具有潛在的可行性。同時(shí)，也應(yīng)當(dāng)注意到，由于其高反應(yīng)性，TCR-T細(xì)胞能夠識(shí)別在任何細(xì)胞/組織中能與之結(jié)合的抗原，對(duì)正常組織產(chǎn)生毒副反應(yīng)[46]。因此，尋找特異的腫瘤抗原，發(fā)現(xiàn)工程T細(xì)胞的新靶點(diǎn)，仍然是這一領(lǐng)域能夠得到長(zhǎng)期成功的一項(xiàng)重要任務(wù)。和其他免疫細(xì)胞療法一樣，TCR-T細(xì)胞療法也需要克服腫瘤微環(huán)境中的免疫耐受現(xiàn)象，因此還有很多問(wèn)題亟待解決，面臨的挑戰(zhàn)還有很多。但這種新興的免疫細(xì)胞療法正成為振奮人心的癌癥治療方法，特別是與TCR-T同在高速通道的CAR-T細(xì)胞治療取得了令人鼓舞的結(jié)果，美國(guó)FDA腫瘤藥物專家咨詢委員會(huì)已經(jīng)以10∶0的投票結(jié)果一致推薦批準(zhǔn)諾華的CAR-T療法CTL-019上市，CTL-019將成為全球首個(gè)獲批上市的CAR-T療法。相信伴隨CTL-019治療的成功以及治療性T細(xì)胞工程技術(shù)水平的提高，TCR-T細(xì)胞療法也會(huì)迅速發(fā)展，TCR-T 應(yīng)用到免疫療法和再生藥物等領(lǐng)域?qū)⒊蔀榭赡?，并將成為治療人類惡性腫瘤的希望之一。

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T cell receptor engineered T cell therapy: strategies and challenges

SHI Weixing，YANG Chunxia
Shanghai Cell-research Biotech Co., Ltd., Shanghai 200333, China

T cell receptor genetically engineered T cell therapy（TCR-T）is a very promising approach for the treatment of tumors in an adoptive cell immunotherapy. Autologous lymphocytes are transferred with tumor specific TCR gene through a variety of vectors, and then infused into patients to regress tumor cells. The current challenges of TCR-T are the identi fi cation of high af fi nity of the tumor speci fi c TCRα and β gene and optimization of the tumor speci fi c TCRα and β gene pairing to enhance the functional avidity of therapeutic T cells. In addition, based on clinical trials TCR-T can produce on-target/off-tumor toxicity by targeting antigens on normal cell surface besides on tumor. Therefore, the selection of appropriate tumor antigens is another key factor for TCR-T cell therapy in exerting its superior effect. Here, we review the expression and regulation mechanism of TCR gene, the optimization strategies of TCR pairing and other challenge issues,as well as the clinical translation and value of TCR-T in the treatment of cancer.

T cell receptor; adoptive cell immunotherapy; TCR-T; on-target/off-tumor toxicity; clinical trials

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.05.008