木瓜蛋白酶水解雞骨泥制備短肽工藝優(yōu)化

朱 瀛，趙改名，柳艷霞，趙莉君，田 瑋

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

木瓜蛋白酶水解雞骨泥制備短肽工藝優(yōu)化

朱 瀛1，趙改名1，柳艷霞1，趙莉君1，田 瑋2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為了探究酶解雞骨泥制備抗氧化肽的最佳工藝，研究了以木瓜蛋白酶酶解雞骨泥時各因素對短肽得率的影響，以及制備的抗氧化肽對羥自由基、超氧陰離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除能力。試驗探究了酶解過程中不同底物質(zhì)量分數(shù)、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對短肽得率的影響。采用響應(yīng)曲面優(yōu)化得到了以短肽得率為目標的木瓜蛋白酶酶解雞骨泥的最優(yōu)工藝，反應(yīng)條件為：底物質(zhì)量分數(shù)11.44%，加酶量211.11 mg·g-1,反應(yīng)溫度57 ℃，反應(yīng)時間3 h，在該條件下酶解液短肽得率預(yù)期為59.20%，實測為58.87%±0.51%。采用優(yōu)化工藝制備的抗氧化肽，在達到32 g·L-1時與維生素C清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力相近，說明雞骨泥肽具有一定的抗氧化活性。

雞骨泥；木瓜蛋白酶；短肽得率；抗氧化活性

中國是雞肉生產(chǎn)大國[1]，但目前對包括雞骨在內(nèi)的動物骨的加工利用還比較落后，每年都有大量的動物骨被浪費或加工成附加值較低的產(chǎn)品[2]。動物骨的開發(fā)與利用主要集中于豬骨、牛骨、鵝骨和雞骨等，這其中由于雞骨的產(chǎn)量大，有很大的開發(fā)應(yīng)用價值[3-4]。雞骨含有人體必需的多種微量元素，是一種名副其實的營養(yǎng)寶庫。雞骨干燥產(chǎn)品中蛋白質(zhì)約占12.0%～35.0%，其中含量最高的是膠原蛋白，骨粉中含有17種氨基酸, 其中包括人體所必需的8種氨基酸，相比于其他食品中氨基酸含量，雞骨粉中的蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。雞骨內(nèi)鈣磷的比例適中，約為2∶1[5]。目前，雞骨泥的開發(fā)和利用主要集中在明膠和骨素上[6]，主要工藝是將雞骨泥中的一些營養(yǎng)物質(zhì)提取出來，再經(jīng)濃縮后制備成食品調(diào)味料或添加劑，但雞骨泥中的大分子蛋白人體難以吸收。采用酶解法處理雞骨泥，不僅能夠?qū)⒋蠓肿拥鞍姿獬衫谌梭w吸收的小分子肽，還能使產(chǎn)品具有獨特的功能特性，有效的提高了雞骨泥的價值，是有較大發(fā)展?jié)摿Φ难芯空n題。功能性短肽近年來成為研究的熱門，主要是由于：1)短肽具有獨特的吸收機制：短肽的抗原性要比其原型蛋白質(zhì)低的多，產(chǎn)生的滲透壓也遠低于游離氨基酸,還可避免氨基酸之間的吸收競爭。這都使得一些肽能以完整的形式被機體吸收進入血液循環(huán)系統(tǒng),并被組織利用。2)短肽具有一些獨特的功能特性，例如抗氧化性，抗高血壓，乳化性等，這些特性是大分子蛋白和游離氨基酸所不具備的。本研究采用木瓜蛋白酶酶解雞骨泥，考察不同底物質(zhì)量分數(shù)、加酶量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對產(chǎn)物短肽得率的影響，并通過羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除率來評價產(chǎn)物的抗氧化活性，以期為酶法制備雞骨肽提供參考。

1 材料與方法

1.1原料

雞骨泥采購于河南大用集團，質(zhì)量為20 kg，保存于-40 ℃冰柜中進行后續(xù)試驗。木瓜蛋白酶購于北京Solarbio公司，為固體，酶活性為600×104U·g-1。

1.2儀器

AL104型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；THZ-82型恒溫水浴振蕩器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；UV-2600型紫外分光光度計(島津企業(yè)管理有限公司)；ALLEGR A-64A型高速離心機(Beckman Coulter)；BPJ-9156A型精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒儀器有限公司)；ALPHAI-4LD-plus型臺式真空冷凍干燥機(德國 CHRIST公司)。

1.3工藝流程

圖1 工藝流程 Fig.1 Production process

本試驗酶解過程如下：向250 mL錐形瓶中加入100 mL蒸餾水。加入一定量的底物(以質(zhì)量分數(shù)%表示)，之后加入一定量的酶(加酶量以mg·g-1表示)。底物和酶添加完畢后放入恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)。

單因素試驗固定的試驗條件為：底物質(zhì)量分數(shù)11%，加酶量200 mg·g-1，反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時間3 h。

1.4指標測定方法

1.4.1 可溶性蛋白質(zhì)的測定 采用考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中當(dāng)它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊馕赵?65 nm，后者在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定[8]。

1.4.2 短肽得率測定 短肽得率測定采用JANG等[9]的方法：將體積分數(shù)為5%三氯乙酸與蛋白酶水解液以1∶1體積比混合，離心(4 985 r·min-1，12 min)，取上清液，采用考馬斯亮藍法測其可溶性蛋白，短肽得率計算公式如下

式中：TCA-NSI為三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1為在5%TCA 中可溶性蛋白，mg；N2為酶解液中可溶性蛋白，mg。

1.4.3 羥自由基清除率測定 分別配制1、2、4、8、16、32 g·L-1的雞骨泥肽和維生素C的無水乙醇溶液。采用GOHIL等[10]方法：配制0.75 mmol·L-1鄰二氮菲無水乙醇溶液，取1 mL于試管中，依次加入0.2 mmol·L-1(pH值7.4)的磷酸緩沖液2 mL和蒸餾水1 mL，充分混勻，加0.75 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，混勻，加入1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃水浴60 min，測定536 nm處的吸光值A(chǔ)P。

其他操作同上，用1 mL蒸餾水代替1 mLH2O2測定吸光值A(chǔ)B。

其他操作同上，用1 mL酶解液代替1 mL蒸餾水,測定吸光值A(chǔ)S。

清除率按以下公式計算：

1.4.4 超氧陰離子清除能力測定 采用HALLIWELL等[11]的鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除率：分別配制1、2、4、8、16、32 g·L-1的雞骨泥肽和維生素C溶液。取50 mmol·L-1(pH值8.2)的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，加入2 mL蒸餾水，30 mmol·L-1的鄰苯三酚溶液0.5 mL，充分混勻，添加按照上法配制的不同濃度雞骨泥液及維生素C溶液1 mL，空白組添加1 mL蒸餾水，在25 ℃恒溫反應(yīng)20 min，于320 nm波長處測吸光度，在4 min內(nèi)，每隔30 s讀數(shù)1次，計算4 min內(nèi)的平均增值A(chǔ)樣。清除率按以下公式計算

1.4.5 DPPH自由基清除能力測定 采用MARFAK等[12]方法：分別配制1、2、4、8、16、32 g·L-1的雞骨泥肽和維生素C的無水乙醇溶液。試管中加入2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH無水乙醇溶液，加入2 mL各個梯度的雞骨泥肽液或維生素C的無水乙醇溶液，混勻后在室溫(25 ℃)避光條件下放置30 min，測定517 nm處吸光值A(chǔ)1，再測定2 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇混合后的吸光值A(chǔ)2。清除率按以下公式計算：

1.5數(shù)據(jù)分析

本試驗采用 Microsoft Excel 2007 軟件處理數(shù)據(jù) (樣本平均值±標準偏差)，利用 IBM SPSS Statistics 13.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Design expert 8.0軟件做響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果及分析

2.1.1 底物質(zhì)量分數(shù)的單因素試驗結(jié)果 由表1可以看出，當(dāng)?shù)孜锏馁|(zhì)量分數(shù)由5%到11%時，短肽得率的上升趨勢明顯(P<0.05)，說明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)較低時，隨著底物的增加，酶與底物的結(jié)合幾率也在增加，從而使溶液中的活性物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)上升。當(dāng)?shù)孜镉?1%到15%時，短肽得率開始下降，說明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)較高時，隨著底物的增加，有效水分降低，使得酶與底物的運動受阻，難以有效結(jié)合，從而使得溶液中的活性物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)下降[13]。

表1 不同底物質(zhì)量分數(shù)對短肽得率的影響 Table 1 The influence of different substrate concentration on the TCA-NSI %

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同一列中不同字母表示不同處理間存在顯著差異(P<0.05)，下同。加酶量200 mg·g-1，反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時間3 h。

Note: The data in the table and figure are the average value±the standard deviation, different letters in the same column, indicates that there are significant differences between different treatment groups (P<0.05), the same as below. Enzyme concentration 200 mg·g-1, temperature 45 ℃, reaction time 3 h.

2.1.2 加酶量的單因素試驗結(jié)果 由表2可以看出，當(dāng)加酶量在50～200 mg·g-1時，隨著加酶量的增加，短肽得率呈明顯的(P<0.05)上升趨勢。這是由于加酶量由低至高的過程中，酶分子同底物結(jié)合的幾率逐漸增大，從而使大分子的蛋白被水解為小分子肽的幾率增大，進而溶液中的活性物質(zhì)的濃度增大[14]。當(dāng)加酶量在200～300 mg·g-1時，隨著加酶量的增加，短肽得率呈平緩甚至有下降的趨勢。這是由于加酶量較高時，酶分子已經(jīng)結(jié)合了大部分底物的酶切位點，使得溶液中的活性物質(zhì)濃度達到了最高，同時一部分短肽與酶反應(yīng)生成了沒有活性的游離氨基酸。

表2 不同加酶量對短肽得率的影響Table 2 The influence of different enzyme concentration on the TCA-NSI

注：底物質(zhì)量分數(shù)11%，反應(yīng)溫度55 ℃，反應(yīng)時間3 h。

Note: Substrate concentration 11%, temperature 45 ℃, reaction time 3 h.

2.1.3 反應(yīng)溫度的單因素試驗結(jié)果 由表3可以看出，當(dāng)溫度在40～55 ℃時，隨著溫度的上升，短肽得率有明顯的(P<0.05)上升趨勢。這是由于在酶的最適溫度以下時，隨著溫度的上升，酶分子的運動能力不斷增強，與底物分子結(jié)合概率增大，溶液中活性物質(zhì)濃度不斷上升。當(dāng)溫度在55～70 ℃時，隨著溫度的上升，短肽得率逐漸下降。這是由于，當(dāng)溫度超過酶的最適溫度后，隨著溫度的上升，溶液中酶分子的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，使得能夠有效參與反應(yīng)的酶分子數(shù)量下降，從而導(dǎo)致溶液中產(chǎn)生的活性物質(zhì)數(shù)量下降。

表3 不同溫度對短肽得率的影響 Table 3 The influence of different temperature on the TCA-NSI

注：底物質(zhì)量分數(shù)11%，加酶量200 mg·g-1，反應(yīng)時間3 h。

Note: Substrate concentration 11%, enzyme concentration 200 mg·g-1, reaction time 3 h.

2.1.4 反應(yīng)時間的單因素試驗結(jié)果 由表4可以看出，反應(yīng)時間在0.5～2.5 h時，隨著時間的增加，

短肽得率有明顯(P<0.05)的上升。這是由于酶與底物的結(jié)合、反應(yīng)需要一個過程，在充分反應(yīng)之前，隨著反應(yīng)時間的增加，越來越多的酶和底物結(jié)合并反應(yīng)，產(chǎn)物的數(shù)量會不斷增加[15]。當(dāng)反應(yīng)時間在2.5～3 h時，隨著時間的增加，短肽得率數(shù)量上下波動。這是由于在大部分酶分子與底物分子充分結(jié)合并反應(yīng)后，隨著反應(yīng)時間的增加會使一部分活性小肽被水解為游離氨基酸而失去生物活性，與此同時，一部分還未反應(yīng)的大分子蛋白被水解為小分子肽又會使活性物質(zhì)數(shù)量上升，故出現(xiàn)上下波動的現(xiàn)象。

表4 不同反應(yīng)時間對短肽得率的影響 Table 4 The influence of different reaction time on the TCA-NSI

注：底物質(zhì)量分數(shù)11%，加酶量200 mg·g-1，反應(yīng)溫度55 ℃。

Note: Substrate concentration 11%, enzyme concentration 200 mg·g-1， temperature 45 ℃

2.2響應(yīng)曲面設(shè)計

由于短肽得率是影響最終酶解液抗氧化活性的重要指標，根據(jù)單因素試驗情況，固定反應(yīng)時間3 h。以底物質(zhì)量分數(shù)、加酶量和溫度作為影響因素，短肽得率作為響應(yīng)值設(shè)計試驗(表5)，得到結(jié)果如表6所示。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Experiment design and result of the response surface

表6 短肽得率回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA analysis of regression model of TCA-NSI

采用逐步回歸法得出底物質(zhì)量分數(shù)、加酶量和溫度對短肽得率的優(yōu)化方程，方程如下：

TCA-NSI=-2624.08+19.32A+1.95B+82.95C-0.01BC-0.84A2-2.90×10-3B2-0.71C2。

Design Expert軟件給出了以最大短肽得率為目標的優(yōu)化結(jié)果：底物質(zhì)量分數(shù)11.44%，加酶量211.11 mg·g-1,反應(yīng)溫度57 ℃，此時預(yù)期短肽得率為59.20%。在該反應(yīng)條件下，驗證試驗短肽得率為58.87%±0.51%，與預(yù)期結(jié)果基本一致。

2.3抗氧化能力測定

目前對于活性物質(zhì)的抗氧化能力的評價方法有很多，單一的指標難以說明一種物質(zhì)的抗氧化活性[16]。目前已知的抗氧化劑通常通過以下5種途徑來達到抗氧化目的：抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；直接清除活性氧自由基；清除氧；螯合金屬離子；激活機體本身內(nèi)在的抗氧化防御系統(tǒng)[17-19]。

本試驗選取了羥自由基、超氧陰離子自由基以及DPPH自由基測定雞骨泥肽和維生素C對它們的清除能力，從而在一定程度上評價雞骨泥肽的抗氧化活性。圖2、圖3和圖4分別顯示出了雞骨泥肽和維生素C在不同質(zhì)量濃度下對不同自由基的清除率，可以看出：1)在較低的質(zhì)量濃度(1～8 g·L-1)時，維生素C對于羥自由基的清除能力明顯高于雞骨泥肽，而在較高的質(zhì)量濃度(16～32 g·L-1)時，二者的清除能力相近。2)隨著維生素C和雞骨泥肽質(zhì)量濃度增加，對超氧陰離子自由基的清除率相似，維生素C(最高清除率在90%左右)清除能力略高于雞骨泥肽(最高清除率在80%左右)。3)在較低的質(zhì)量濃度(1～8 g·L-1)時，維生素C對于DPPH自由基的清除能力高于雞骨泥肽，在較高的質(zhì)量濃度(16～32 g·L-1)時，二者清除能力相近。綜上可以看出，在抗氧化肽質(zhì)量濃度達到16～32 g·L-1時與維生素C清除自由基的能力相近，清除效果較好。

圖2 羥自由基清除率比較Fig.2 Comparison of the clearance of hydroxyl free radicals

圖3 超氧陰離子自由基清除率比較Fig.3 Comparison of the clearance of superoxide anion free radicals

圖4 DPPH自由基清除率比較Fig.4 Comparison of the clearance of DPPH free radicals

3 結(jié)論

1)短肽得率隨著底物質(zhì)量分數(shù)和溫度的增加，先增加后下降；隨著加酶量和時間的增加，先增長后趨于平緩，羥自由基清除率與短肽得率增減趨勢相近。

2)通過響應(yīng)面試驗得到以短肽得率為目標的最優(yōu)酶解條件為：底物質(zhì)量分數(shù)11.44%，加酶量211.11 mg·g-1,反應(yīng)溫度57 ℃，此時預(yù)期短肽得率為59.20%，該反應(yīng)條件下試驗短肽得率為58.87%±0.51%。

3)通過測定最優(yōu)酶解條件下產(chǎn)物的抗氧化活性指標，得出雞骨泥肽對羥自由基、超氧陰離子自由基以及DPPH自由基都有一定清除能力，其質(zhì)量濃度達到32 g·L-1時與維生素C的清除能力相近。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

OptimizationofenzymatichydrolysisofchickenboneproteinforproductionofantioxidantpeptidesbyusingPapain

ZHU Ying1, ZHAO Gaiming1, LIU Yanxia1, ZHAO Lijun1, TIAN Wei2

(1.Henan Key Lab of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002, China;2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to explore the optimal process of making antioxidant peptides by hydrolyzing the chicken bone, Papain was used to hydrolyze chicken bone residue, and to investigate the effect of different substrate concentration, enzyme concentration, reaction temperature and reaction time on the yield of oligopeptide of product, and the antioxidant peptides’ ability to clear the hydroxyl free radicals, superoxide anion free radicals and DPPH free radicals. Aiming at higher oligopeptide yield, using response surface optimization, the best process of Papain to hydrolyze chicken bone residue has been obtained: The substrate concentration is 11.44%, the enzyme concentration is 211.11 mg·g-1, the reaction temperature is 57 ℃, and the reaction time is 3 h. Under these conditions, the predicted TCA-NSI is 59.20%, and the experiment result is 58.87%±0.51%. The antioxidant peptides, which is made with the optimized process, have similar ability to the VC to clear the hydroxyl free radicals, superoxide anion free radicals and DPPH free radicals at the concentration of 32 g·L-1, indicating that chicken bone peptieles have certain antioxidant activity.

chicken bone residue; Papain; TCA-NSI; antioxidant activity

S879

：A

2016-08-30

河南省重大科技專項基金項目(161100110800)

朱 瀛(1989-)，男，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事畜禽副產(chǎn)品利用方面的研究。

趙改名(1962-)，男，河南洛陽人，教授，博士。

1000-2340(2017)03-0390-06