巨峰葡萄自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成及差異分析

張俊杰，楊 旭，郭 晨，步陽陽，李明陽，張文葉，劉崇懷

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 鄭州450002; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

巨峰葡萄自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成及差異分析

張俊杰1,2，楊 旭1，郭 晨1，步陽陽1，李明陽，張文葉1，劉崇懷3

(1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心， 河南 鄭州450002; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，河南 鄭州 450009)

采集巨峰葡萄發(fā)酵不同階段的發(fā)酵液，通過酵母菌的分離、純化、WL培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng)、表型性狀的聚類分析以及顯微細(xì)胞形態(tài)觀察，對酵母菌進(jìn)行初步的表型分群，挑選不同表型群的代表菌株進(jìn)行DNA的提取以及26S rDNA D1/D2基因擴(kuò)增和測序分析。共得到64株酵母菌，經(jīng)過對獲得酵母菌菌株的表型鑒定得到14個表型群，通過26S rDNA基因測序、比對，酵母菌最終鑒定為3個不同的酵母菌種群，分別為假絲酵母、路氏類酵母和釀酒酵母。其中發(fā)酵前期包含的酵母菌種群是假絲酵母(64%)和路氏類酵母(36%)；發(fā)酵中期包含假絲酵母(10%)、路氏類酵母(5%)和釀酒酵母(85%)；發(fā)酵后期則包含路氏類酵母(43%)和釀酒酵母(57%)。結(jié)果表明，發(fā)酵不同階段的優(yōu)勢酵母菌種群是存在差異的，釀酒酵母在發(fā)酵的中后期均占優(yōu)勢，假絲酵母僅在發(fā)酵的前中期存在且只在前期占優(yōu)勢，路氏類酵母在發(fā)酵的各個時期均有發(fā)現(xiàn)，但發(fā)酵后期占比最高。

巨峰葡萄；酵母菌；26S rDNA D1/D2；分子鑒定

在果酒的釀造過程中，酵母的性能對發(fā)酵產(chǎn)品的類型和質(zhì)量起著決定性的作用[1]。葡萄酒的發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的微生物參與的生物化學(xué)變化過程[2]。酵母菌群的復(fù)雜性，可有效增加葡萄酒風(fēng)味的多樣性，但也可能影響葡萄酒質(zhì)量的穩(wěn)定性[3]。在葡萄漿果表面，存在大量的野生酵母菌，在葡萄汁的自然發(fā)酵過程中，這些野生酵母菌群的種類和數(shù)量處于不斷變化中，不同酵母菌規(guī)律性地消長[4]。葡萄酒中香氣組分的組成與含量比例都與酵母菌有密切關(guān)系[5]。不同酵母可以賦予葡萄酒不同的品質(zhì)與風(fēng)味，共同影響葡萄酒的質(zhì)量[6-7]。采用不同釀酒酵母和相同葡萄原料發(fā)酵生產(chǎn)的葡萄酒，在色澤、香氣、感官質(zhì)量以及出酒率等方面都存在較大的差異[8]。在酒精發(fā)酵過程中，釀酒酵母能修正提取到的香氣成分，并產(chǎn)生一些額外的發(fā)酵香氣[9]。不同釀酒酵母的特性和代謝途徑存在差異，從而引起葡萄酒呈現(xiàn)不同的風(fēng)味與特色[10]。葡萄酒的釀造是通過酵母菌的作用，使原料中的各種潛在品質(zhì)在酒中得以充分體現(xiàn)[11]。優(yōu)良葡萄酒酵母應(yīng)具有生長速率快、耐高糖、耐SO2、發(fā)酵平穩(wěn)、酒精產(chǎn)率高、發(fā)酵完全等特性[12]。酵母性能的好壞對葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量以及對葡萄酒產(chǎn)品特色和風(fēng)格的形成至關(guān)重要[13]。針對中國葡萄酒產(chǎn)區(qū)及其主栽葡萄品種，篩選出適合特定產(chǎn)區(qū)和葡萄品種，并具有自主知識產(chǎn)權(quán)的專用釀酒酵母，具有重大經(jīng)濟(jì)意義[14]。巨峰葡萄，屬中熟類、四倍體品種，歐美雜交種，原產(chǎn)日本。1959年引入中國，是深受果農(nóng)歡迎的主栽品種。它適應(yīng)性強(qiáng)，抗病、抗寒性能好，喜肥水。8月下旬成熟，成熟時紫黑色，果皮厚，果粉多，果肉較軟，味甜、多汁，有草莓香味，皮、肉和種子易分離，含糖量16%。本研究以巨峰葡萄發(fā)酵液為原料，采取形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對發(fā)酵液前、中、后期的酵母菌進(jìn)行分離和表型及分子鑒定，以豐富我們對巨峰葡萄發(fā)酵過程中酵母菌菌群組成及其動態(tài)變化規(guī)律的認(rèn)識，為篩選優(yōu)良菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 葡萄樣品的采集及發(fā)酵 葡萄品種為巨峰葡萄(樹齡大于15 a)，于2015-08-28進(jìn)行采集，采集地點(diǎn)為鄭州市滎陽市葡萄生產(chǎn)基地。發(fā)酵條件：所采集的巨峰葡萄不經(jīng)過清洗，直接用破碎機(jī)破碎后加入直徑80 cm，高1 m的不銹鋼桶中，包含葡萄皮、葡萄籽和破碎汁液，破碎的葡萄覆蓋不銹鋼桶的4/5體積，在不添加任何菌劑和糖的情況下，室溫下進(jìn)行完全自然發(fā)酵過程。

1.1.2 發(fā)酵樣品的采集 采集地點(diǎn)為鄭州輕工業(yè)學(xué)院食工樓一樓葡萄酒發(fā)酵車間。采集過程：從發(fā)酵桶的上中下3個部位各取5 mL發(fā)酵液，加入無菌的三角瓶中混勻，作為1個樣品。2015-09-03、09-05、09-07各取1次,共3個樣品，分別為發(fā)酵48 h(前期)、96 h(中期)和144 h(后期)。

1.1.3 主要藥品與試劑 酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、溴甲酚綠、1kb DNA Ladder、Taq酶、酵母菌DNA提取試劑盒等。26S rDNA引物為NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′) 和 NL-4(5′-GGTCCGTGT TTCAAGACG G-3′)

1.1.4 培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YEPD)：酵母浸粉 10 g·L-1，蛋白胨 20 g·L-1，葡萄糖 20 g·L-1，瓊脂粉 20 g·L-1，去離子水1 000 mL，自然pH值。WL 營養(yǎng)培養(yǎng)基[15]：酵母浸粉 4 g·L-1，胰蛋白胨 5 g·L-1，葡萄糖 50 g·L-1，磷酸二氫鉀0.55 g·L-1，氯化鉀0.425 g·L-1，氯化鈣0.125 g·L-1，硫酸鎂0.125 g·L-1，氯化鐵0.002 5 g·L-1，硫酸錳0.002 5 g·L-1，瓊脂 20 g·L-1，溴甲酚綠22 mg·L-1，去離子水1 000 mL，自然pH值。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的富集、分離、純化與保藏 在無菌條件下，將同一天收集的發(fā)酵液各取1 mL加入到同一試管中震蕩混勻。從10-1到10-8依次進(jìn)行梯度稀釋，選10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度在YEPD(加入10 g·L-1氯霉素)上涂板，每個梯度平行涂3個板，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。隨機(jī)挑選若干單菌落，在YEPD平板上純化。

菌種保藏用2種方式同時保藏。1)短期保藏：在YEPD固體斜面上接種，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后放在4 ℃冰箱中保藏。2)長期保藏：V甘油∶V蒸餾水=1∶1比例配制，每個冷藏管中加1 mL。純化的菌種在YEPD液體中28 ℃，180 r·min-1，培養(yǎng)1 d，吸取1 mL菌液與冷藏管中甘油混勻，放置-80 ℃冰箱保藏。

1.2.2 酵母菌的鑒定

1.2.2.1 酵母菌初步鑒定 WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)：挑取純化后的每一株單菌落在WL平板上劃線，直至長出單菌落，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。根據(jù)在WL培養(yǎng)基上不同的菌落形狀、顏色、大小等，將酵母菌進(jìn)行初步分類。挑取WL培養(yǎng)基上單菌落，在顯微鏡下觀察記錄酵母細(xì)胞的特征。包括：細(xì)胞形狀，細(xì)胞為單生、對生或群生，繁殖方式。

1.2.2.2 酵母菌分子鑒定 進(jìn)行酵母菌DNA提取：本研究用DNA提取試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)。使用引物NL(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGT CCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行26S rDNA D1/D2區(qū)的擴(kuò)增[16]。PCR循環(huán)次序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 20 s；循環(huán)35次；再72 ℃延伸8 min。PCR反應(yīng)液的組成(30 μL體系)：每管中含PCR緩沖液(10×)3.0 μL；25 mmol MgCl21.8 μL；10 mmol dNTP0.6 μL；10 μmol NL1和NL4各0.6 μL；0.5 U·μL-1DNA聚合酶 0.6 μL；0.1～1 μg·μL-1模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容到30 μL。

取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與 1 μL 6×上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的瓊脂糖凝膠(已加入Goldview I 型核酸染液)，在100 V電壓下，1×TAE 電泳緩沖液中電泳20 min，最后在紫外分析儀上檢測，初步判斷擴(kuò)增片段的質(zhì)量和大小。擴(kuò)增合格的 PCR 產(chǎn)物送往公司測序。

根據(jù)測序結(jié)果，利用BLAST軟件從Gen Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進(jìn)行同源序列搜索(BLAST search)，比較代表性菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度。序列搜索可以得到該酵母菌株在這段序列上與其他親緣關(guān)系相近的已知酵母菌的相關(guān)信息，因絕大多數(shù)已發(fā)表的酵母菌種的26S rDNA的 Dl/D2區(qū) 序列已經(jīng)在Gen Bank中。根據(jù)同源搜索的結(jié)果確定所測序菌株的分類種群，即26S rDNA D1/D2區(qū)相似性大于等于90%即為同一個種群。獲得同源酵母菌株的D1/D2 區(qū)序列后，用MEGA6軟件的ClustalW功能對所有供試序列進(jìn)行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter 模型構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，該分析進(jìn)行1 000次的Bootstraps檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1酵母菌的分離純化及形態(tài)學(xué)初步鑒定

本研究共分離出64株菌，其中前期14株菌，中期20株菌，后期30株菌。用WL培養(yǎng)基觀察菌落形態(tài)，共分2部分：一是菌落顏色；二是菌落表面形態(tài)，結(jié)果如表1、圖1所示。把所有供試酵母菌分為了14個WL菌落形態(tài)群組，圖1列出了每種WL菌落形態(tài)的代表菌株所呈現(xiàn)的菌體顯微形態(tài)。挑取WL培養(yǎng)基上不同菌落形態(tài)的代表菌株，進(jìn)行下一步的分子生物學(xué)鑒定。

2.2代表菌株DNA提取及26SrDNAD1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增分析

2.2.1 代表菌株DNA提取與26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增分析 經(jīng)檢測，所有代表菌株DNA的提取結(jié)果良好。以菌株DNA為模板擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)段，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳后，置于紫外分析儀上觀察、拍照，如圖2所示。箭頭所指的即為擴(kuò)增出的條帶，由圖估測PCR產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為600 bp。

2.2.2 代表菌株26S rDNA D1/D2區(qū)測序與結(jié)果分析 根據(jù)同種間菌株的差異不超過1%，不同種間將會顯示更大的差異[17]的原則，由圖3構(gòu)建的代表菌株26S rDNA D1/D2序列系統(tǒng)發(fā)育樹可知，14個代表菌株分為3個類群，且各群的代表菌株與已知酵母菌種群參比菌株的序列相似性均高于99%，所以a-f型屬于假絲酵母，g-k型屬于路氏類酵母，l-n型屬于釀酒酵母。并且圖中顯示了各代表菌株所對應(yīng)的發(fā)酵分離時期，可見假絲酵母在發(fā)酵的前中期均有發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母則在發(fā)酵中后期才有發(fā)現(xiàn)，路氏類酵母則在發(fā)酵各個取樣時期都有發(fā)現(xiàn)。

表1 代表性酵母菌株的形態(tài)特征 Table 1 The morphological characteristics of the representative yeast strains

菌株排列順序?yàn)椋旱?排a-c，第2排d-f，第3排g-i，第4排j-l，第5排m、n。 From left to right, lane 1: a-c; lane 2: d-f; lane 3: g-i; lane 4: j-l and lane 5: m and n.

圖2 26S rDNA D1/D2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of the 26S rDNA D1/D2 PCR products

由圖1和圖3可知，同種群中有菌落顏色相同但是菌落表面形態(tài)不同的差異，例如假絲酵母種群的b型和c型，它們的菌落顏色都是中部鮮綠色，乳白色邊緣，然而它們的表面形態(tài)b型是錐形突起，c型是乳頭狀突起。也有同種群中有菌落表面形態(tài)相同但是菌落顏色不同的差異，例如路氏類酵

母中h型和j型，它們的菌落表面形態(tài)相同，都是錐形突起，表面光滑，不透明，奶油狀；但是h型酵母菌的菌落顏色是中部灰綠色，乳白色邊緣，而j型菌落顏色是中部黃綠色，淺黃色邊緣。同種群酵母菌也存在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色與表面形態(tài)完全不同的情況，例如釀酒酵母m型菌落顏色是深綠色，表面形態(tài)是圓屋頂突起，表面光滑，不透明，邊緣不規(guī)則，奶油狀，其形態(tài)特征與同種群其他釀酒酵母有明顯的差異；路氏類酵母i型其菌落顏色為不規(guī)則綠白相間與其他路氏類酵母有明顯的差異；它們也有一個特點(diǎn)就是數(shù)量特別少，僅有一兩株。

圖3 代表性菌株26S rDNA D1/D2序列的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The Neighbor-Joining phylogenetic tree of 26S rDNA D1/D2 sequences for the representatives

由圖1-圖3和表1可以看出，雖然同種群酵母菌在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)各異，差異明顯，但是同種群酵母菌在顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)基本是一樣的。例如假絲酵母細(xì)胞形態(tài)都是卵圓形，路氏類酵母細(xì)胞形態(tài)都是梭形，釀酒酵母大多數(shù)都是卵圓形，僅有m型釀酒酵母是圓形。釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)有卵圓形和圓形2種，這個現(xiàn)象也說明了依據(jù)細(xì)胞形態(tài)不能準(zhǔn)確地對酵母菌進(jìn)行分類，要想準(zhǔn)確分類，就必需進(jìn)行分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

2.3自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成和差異分析

2.3.1 自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成分析 從不同時期的發(fā)酵液中酵母菌的組成分析中可以看出，巨峰葡萄酒自然發(fā)酵過程中發(fā)酵液中酵母菌的組成在不同時期是不同的(圖4)。從圖4可以看出，其酵母菌的組成變化是有規(guī)律的，前期發(fā)酵液中主要是假絲酵母，含有少量路氏類酵母，并沒有分離出釀酒酵母，這說明釀酒酵母的數(shù)量在發(fā)酵前期很少。發(fā)酵中期假絲酵母比例和路氏類酵母比例均出現(xiàn)較大幅度下降，釀酒酵母比例大幅度上升，這說明發(fā)酵中期釀酒酵母已經(jīng)在大量繁殖并開始發(fā)揮作用。發(fā)酵后期假絲酵母被淘汰，路氏類酵母比例較大幅度上升，釀酒酵母比例又有所下降。釀酒酵母是適應(yīng)性較廣泛的菌種，在發(fā)酵中后期，由于糖分的減少和酒精含量的升高，發(fā)酵環(huán)境的選擇性越來越強(qiáng)。釀酒酵母適應(yīng)性強(qiáng)，大量繁殖，數(shù)量逐漸增多。假絲酵母的酒精耐性比較差，發(fā)酵過程中數(shù)量越來越少，逐漸消亡。

前期：共分離出14株酵母菌。其中有9株屬于假絲酵母，占前期總菌株比例的64%。5株屬于路氏類酵母，占前期總菌數(shù)比例的36%，沒有分離出釀酒酵母。從此數(shù)據(jù)可看出，假絲酵母是巨峰葡萄酒發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌株。

中期：共分離出20株酵母菌。其中2株屬于假絲酵母，占中期總菌數(shù)比例的10%，1株屬于路氏類酵母，占中期總菌數(shù)比例的5%，17株屬于釀酒酵母，占中期總菌數(shù)比例的85%。從此可看出，巨峰葡萄酒發(fā)酵中期的優(yōu)勢菌株是釀酒酵母。

后期：共分離出30株酵母菌。其中13株屬于路氏類酵母，占后期總菌數(shù)比例的43%，17株屬于釀酒酵母，占后期總菌數(shù)比例的57%。此數(shù)據(jù)說明，巨峰葡萄酒發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌株依舊是釀酒酵母，但是路氏類酵母所占比例明顯增多。

圖4 自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成Fig.4 The yeast composition in different natural fermentation stages

3 討論

本研究對巨峰葡萄前、中、后期的發(fā)酵液中的酵母菌進(jìn)行了分離純化，通過WL培養(yǎng)基表型鑒定和細(xì)胞顯微觀察，對得到的酵母菌進(jìn)行初步分類。又從不同類型的酵母菌中挑取代表菌株進(jìn)行DNA提取和26S rDNA D1/D2區(qū)段基因擴(kuò)增，最終分離純化出的64株酵母菌分為3個種群，分別為假絲酵母、路氏類酵母和釀酒酵母。在每個發(fā)酵時期優(yōu)勢菌群也不同。這與先前的研究相一致。

有研究表明，發(fā)酵過程中菌群的組成與消長，受葡萄產(chǎn)地的氣候、葡萄漿果的成熟度、葡萄園的管理情況和發(fā)酵工藝等各方面的影響[18]。本研究在對不同發(fā)酵時期發(fā)酵液中的酵母菌組成進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在發(fā)酵過程中菌體數(shù)量是由少到多再到趨于穩(wěn)定(釀酒酵母酒精耐性比較好)；假絲酵母菌體數(shù)量由多到少直至消失(可能與其酒精耐性差有關(guān))；路氏類酵母菌體數(shù)量先由多到少再由少到多，呈V字型變化。這種發(fā)酵過程中菌群的組成及消長與發(fā)酵過程中糖濃度的減少酒精濃度的增加有很大的關(guān)系。王澤舉等[19]曾在葡萄酒發(fā)酵前期分離出假絲酵母，蘇龍[17]曾在發(fā)酵過程中分離出路氏類酵母。釀酒酵母是葡萄酒工業(yè)發(fā)酵最主要的酵母菌，很少存在于葡萄果實(shí)與表面，這與我們之前的研究結(jié)果相一致[20-21]。

對WL培養(yǎng)基初步分類結(jié)果和測序后分類結(jié)果進(jìn)行對照分析后發(fā)現(xiàn)，有些菌株的WL分類結(jié)果與測序后的分類結(jié)果是一樣的，而不同種群的酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落顏色與表面形態(tài)確實(shí)有著明顯的差異，但同種群不同菌落顏色和表面形態(tài)的酵母菌僅依據(jù)WL培養(yǎng)基聚類分析無法進(jìn)行鑒別。這說明依據(jù)WL培養(yǎng)基只能用來鑒定和區(qū)分不同種群的葡萄酒酵母菌。而測序分析結(jié)果則能從根本上區(qū)分不同種群的酵母菌和鑒定同種群酵母菌。所以，在對菌株進(jìn)行分類鑒定時，需要將傳統(tǒng)的鑒定方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

AnalysisofcompositionanddifferenceofyeastpopulationsindifferentstagesofnaturalfermentationofKyohogrape

ZHANG Junjie1,2, YANG Xu1, GUO Chen, BU Yangyang1, LI Mingyang1, ZHANG Wenye1, LIU Chonghuai3

(1.College of Food Sciences and Bio-engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002,China; 2.Collaborative Innovation Center of Production and Safety, Henan Province, Zhengzhou 450002,China; 3.Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009,China)

Samples of Kyoho wine were collected at different stages of the fermentation, and then yeast populations were isolated, purified, and WL were cultured, and the phenotypic taxonomy was performed. In addition, the representatives were taken for DNA extraction and 26S rRNA gene amplification and sequencing analysis. A total of 64 strains of yeast were obtained and then were taken for phenotyping and 14 phenotypic groups were found. While through 26S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis, they were identified as three different known yeast species,Candidahumilis,SaccharomycodesludwigiiandSaccharomycescerevisiae. In the early stage of the fermentation, two kinds of yeast species were included,Candidahumilis(64%) andSaccharomycodesludwigii(36%); while in the middle stage, all of the three species were involed,Candidahumilis(10%),Saccharomycodesludwigii(5%) andSaccharomycescerevisiae(85%); in addition, at the late stage, onlySaccharomycodesludwigii(43%) andSaccharomycescerevisiae(57%) were found. The results showed that the dominant yeast species from different fermentation stages were different, andSaccharomycescerevisiaewere the dominant species in both of the middle and late stages of the fermentation, howeverCandidahumiliswas found in both the early and middle fermentation stages but was dominant only in the early stage.Saccharomycodesludwigiiwas found in all of the three stages of the fermentation and was dominant only in the late stage.

kyoho grape; yeast; 26S rDNA D1/D2; molecular identification

TS261

：A

2016-07-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400008)；鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金項(xiàng)目(2014bsjj006)

張俊杰(1984-)，男，河南汝州人，講師，博士，從事微生物分類與分子生態(tài)學(xué)方面的研究。

1000-2340(2017)03-0383-07