膜分離雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的初步研究

李 俠,沈青山,胡 禮,,張春暉,，*,唐春紅,鄭乾坤

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193; 2.重慶工商大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,重慶 400067;3.得利斯集團(tuán)有限公司,山東濰坊 262216)

近年來我國屠宰骨副產(chǎn)物年產(chǎn)量持續(xù)升高,作為世界上的雞肉生產(chǎn)大國,據(jù)中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)報道，2016年我國雞肉產(chǎn)量約為1200多萬噸,占全球雞肉總產(chǎn)量的14%,年產(chǎn)鮮雞骨大約200萬噸。雞骨營養(yǎng)豐富,含有大量的營養(yǎng)活性物質(zhì),脂肪和蛋白質(zhì)含量也顯著高于魚骨、豬骨、牛骨[1]。研究表明，從雞胸軟骨中提取的多糖成分，具有很強(qiáng)的自由基清除活性[2],張根生等[3]研究表明，雞骨膠原蛋白肽可以有效地增強(qiáng)小鼠機(jī)體的抗氧化能力,從而延緩D-半乳糖誘發(fā)的小鼠衰老。然而,目前由于資金、技術(shù)等方面的原因,大量的雞骨通常是被丟掉,或經(jīng)簡單粗加工生產(chǎn)成附加值很低的產(chǎn)品,并沒有完全體現(xiàn)出雞骨的營養(yǎng)價值[4]。這樣不僅會造成巨大的浪費(fèi),還會污染環(huán)境。因此,需要加大對雞骨的深度高效加工,實(shí)現(xiàn)其高值化利用。雞骨素是以雞骨為原料，提取獲得的一類以骨膠蛋白為主體的復(fù)合風(fēng)味基料。但是,雞骨素存在風(fēng)味單一、香氣不足等問題,后期應(yīng)用過程中，需要對其進(jìn)行生香處理以增加其應(yīng)用價值,例如可對其進(jìn)行美拉德反應(yīng)改善其風(fēng)味。

在食品加工或者貯藏過程中，還原糖與蛋白質(zhì)、多肽等含氮物質(zhì)之間發(fā)生的一種非酶褐變反應(yīng)稱為美拉德反應(yīng)[5]。該過程中會產(chǎn)生大量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products,MRPs),其中包括一些抗氧化物質(zhì)[6]。因此,美拉德反應(yīng)不僅能夠賦予食品特殊的色澤風(fēng)味，還可以延長貨架期。雖然關(guān)于美拉德反應(yīng)能夠產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)[7]和一些特殊風(fēng)味[8]的研究很多,但其反應(yīng)機(jī)制依然不明確。目前,對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的小分子化合物的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展,但是對中間體和最終產(chǎn)物形成機(jī)理及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)尚不清楚,目前認(rèn)為Hoge提出的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分類圖解仍然是對美拉德反應(yīng)機(jī)理公認(rèn)為最經(jīng)典的詮釋[9]。

膜分離技術(shù)是利用膜分離元件對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種技術(shù),主要包括微濾(Microfiltration,>50 kDa)、超濾(Ultrafiltration,50～3 kDa)、納濾(Nanofiltration,1～0.3kDa)及反滲透(Reverse osmosis,<0.3 kDa)等[10]。本研究首先將雞骨素進(jìn)行酶解得到雞骨素酶解液,然后雞骨素酶解液再經(jīng)美拉德反應(yīng)，從而得到雞骨素酶解液MRPs,然后基于膜分離技術(shù)對雞骨素酶解液MRPs進(jìn)行微濾、超濾、納濾和反滲透，從而實(shí)現(xiàn)其不同分子量的分離,并對不同分離組分的褐變程度、風(fēng)味色澤變化及抗氧化活性進(jìn)行研究,為雞骨素的進(jìn)一步深度開發(fā)利用提供了一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞骨素 可溶性固形物含量42%,河南省鶴壁市普樂泰生物科技有限公司提供;復(fù)合蛋白酶(120U/mg)、風(fēng)味蛋白酶(20U/mg) 北京索萊寶公司;2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸(AAPH)自由基、熒光素鈉鹽、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、水溶性VE(Trolox) 美國sigma公司;pBR322型超螺旋質(zhì)粒DNA 美國Thermo Fisher科技公司;其他試劑為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PEN3型便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國Airsense公司;Agilent 1260 Infinity II型高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;LR-2.ST型美拉德反應(yīng)釜 德國IFA集團(tuán);D25L色差儀型 美國Hunterlab公司;Chameleon多功能酶標(biāo)儀型 芬蘭Hidex公司;1812型膜分離設(shè)備、陶瓷膜設(shè)備 合肥風(fēng)云膜公司;微濾、超濾、納濾及反滲透膜元件單支膜,有效膜面積0.37 m2北京中科瑞陽膜技術(shù)有限公司;FD-1型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;T6型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器公司;F-2500型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨素酶解液及其MRPs樣品的制備 雞骨素酶解液的制備:參照Dong等[11]工藝條件。雞骨素(Brix=42%)按1∶3 (w/w)用蒸餾水稀釋,調(diào)節(jié)pH至6.8。按雞骨素質(zhì)量的1.5%(w/w)添加復(fù)合蛋白酶，于40 ℃條件下水浴振蕩2 h酶解。然后,將酶解液在100 ℃下水浴10 min使酶失活,冷卻至室溫,再按雞骨素質(zhì)量的1.5%(w/w)添加風(fēng)味蛋白酶,40 ℃水浴振蕩2 h繼續(xù)酶解,100 ℃,10 min水浴使酶失活;2000×g離心10 min，除去沉淀得到雞骨素酶解液。

雞骨素酶解液MRPs樣品的制備:參照孫紅梅等[12]的研究方法。按雞骨素質(zhì)量的2%(w/w)向酶解液中依次添加木糖、半胱氨酸鹽酸鹽、硫胺素,之后取部分樣液作為初始樣品處理組,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為5.0,在105 ℃條件下于美拉德反應(yīng)釜中反應(yīng)90 min后，立即冰水冷卻,得到雞骨素酶解液MRPs。

1.2.2 雞骨素酶解液MRPs樣品的分離:將制得的雞骨素酶解液MRPs留樣后,依次經(jīng)過微濾、超濾、納濾及反滲透設(shè)備過濾,濾出液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后,進(jìn)行真空冷凍干燥,得到干粉于干燥器內(nèi)保存;同時取適量雞骨素(Stock solution of chicken bone extract,Sc)、雞骨素酶解液(Stock solution of enzymatic hydrolysate of chicken bone extract,Se)及雞骨素酶解液MRPs原液(Stock solution of MRPs from enzymatic hydrolysate of chicken bone extract,Sm),進(jìn)行真空冷凍干燥,得到干粉于干燥器內(nèi)保存,其中雞骨素酶解液MRPs的微濾組分、超濾組分、納濾組分、反滲透組分分別用MF、UF、NF、RO表示。準(zhǔn)確稱取5 g各類樣品，用蒸餾水定容到50 mL。

1.2.3 雞骨素酶解液MRPs吸光度及色澤測定 參考Jiang等[13]的方法,樣品用蒸餾水稀釋10倍,以蒸餾水為參照,使用紫外可見分光光度計(jì)，于420 nm處測定各樣品褐變程度,于294 nm處測定其紫外吸收。樣品用蒸餾水稀釋10倍,使用熒光分光光度計(jì)測定樣品的熒光強(qiáng)度,其中激發(fā)波長347 nm,發(fā)射波長420 nm。參考孫方達(dá)等[14]的方法測定樣品色澤,樣品稀釋10倍后,儀器經(jīng)過自檢和零點(diǎn)、白板校正后,取50 mL樣品于比色杯中測量其亮度值L*、紅度值a*及黃度值b*。

1.2.4 電子鼻及感官評價 便攜式電子鼻風(fēng)味分析系統(tǒng)包含有10個檢測器,對不同的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)靈敏[15],載氣為干燥空氣,流速600 mL/min。先將樣品稀釋5倍,置于密封管內(nèi)50 ℃振蕩20 min,冷卻后通過頂空抽樣方式進(jìn)行檢測,檢測時間60 s,取58～60 s數(shù)據(jù)用于主成分分析。

參考鐘海雁等[16]的方法,選取12名(6男6女)經(jīng)過感官評定訓(xùn)練的初級專業(yè)評價員進(jìn)行感官評價。在進(jìn)行評價前12 h內(nèi)，要求感官評價員不吸煙飲酒,不食用刺激性食物,且在評價過程中不能交談。首先將待評價樣品稀釋5倍,用相同的容器盛裝,用于揮發(fā)性風(fēng)味感官評價,樣品品質(zhì)分為5個等級評價標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 雞骨素酶解液MPRs揮發(fā)性風(fēng)味評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring standard of volatile flavor from the MRPs of onzymatic hydrolysates of chicken bone extract

1.2.5 雞骨素酶解液MRPs抗氧化活性的測定

1.2.5.1 還原力測定 參照Wang等[17]的方法并做適當(dāng)修改。吸取稀釋5倍后的待測樣品0.2 mL,加入1 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)及1 mL鐵氰化鉀溶液(1%,w/v)。水浴(50 ℃)20 min,冷卻至室溫后,加入1 mL三氯乙酸溶液(10%,w/v)終止反應(yīng),2000×g離心10 min;吸取離心后的上清液1 mL,依次加入蒸餾水1 mL、三氯化鐵溶液0.2 mL(0.1%,w/v),混合均勻,靜置10 min后于700 nm處測定吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測定 參照Re等[18]的方法測定ABTS+自由基清除能力。配制ABTS+溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)的混合液(v/v=1/1),室溫避光靜置12 h,使用前進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使其在734 nm處的吸光值為1.5～1.6;吸取稀釋50倍的樣品溶液200 μL加入到4 mL ABTS+溶液中,輕微振蕩,暗處反應(yīng)1 h,然后測定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值,記為Asample,以相同體積的純水替代樣品溶液作為空白對照,記為Ablank。

ABTS+自由基清除率(%)=(Ablank-Asample)/Ablank×100

式(1)

1.2.5.3 ACE抑制能力測定 按照Wu等[19]的方法測定ACE抑制能力。配制ACE溶液:將0.1 U ACE溶于1 mL 0.15 mol/L硼酸緩沖液(pH8.3,含0.3 mol/L NaCl),分裝凍藏;HHL溶液:取HHL適量以0.15 mol/L硼酸緩沖液溶解配成5 mmol/L HHL溶液,分裝凍藏。取稀釋50倍的樣品100 μL,加入80 μL ACE溶液,在37 ℃下保溫10 min后，加入100 μL反應(yīng)底物HHL溶液,在37 ℃條件下反應(yīng)60 min后，加入250 μL 1.0 mol/L HCl以終止反應(yīng),高效相液相色譜檢測反應(yīng)液中馬尿酸的含量。

色譜條件為:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18分析用色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫25 ℃,流動相為乙腈-超純水(V/V=1∶1,含0.05%的三氟乙酸),流速1 mL/min,檢測波長228 nm,自動進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為20 μL。

R(%)=(A-B)/A×100

式(2)

式中,R為樣品對ACE活性的抑制率(%);A為空白對照組中馬尿酸的峰面積(mAU·s);B為樣品組中馬尿酸的峰面積(mAU·s)。

1.2.5.4 氧自由基吸附能力測定 參照Dávalos等[20]的方法并加以修改，測定氧自由基吸附能力(ORAC)。在黑色96微孔板中分別加入待測樣品20 μL,然后加入120 μL熒光素鈉鹽溶液(70 nmol/L),37 ℃下孵育15 min,用多道移液器迅速在各孔中加入60 μL氧自由基溶液(12 mmol/L)啟動反應(yīng),所有溶液都用磷酸鹽緩沖液配置或稀釋。將微孔板迅速置于酶標(biāo)儀中以485 nm激發(fā)波長,520 nm發(fā)射波長進(jìn)行連續(xù)測定,每分鐘測定一次各孔熒光強(qiáng)度,測定時間100 min(熒光衰減呈基線后為止)。空白設(shè)置為用磷酸鹽緩沖溶液代替樣品。所有樣品為3平行,各孔不同時間點(diǎn)的絕對熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)fi與0 min時熒光強(qiáng)度f0相比,從而得到相對熒光強(qiáng)度值,用近似積分法算出熒光衰減曲線下的積分面積(AUC)。

式(3)

抗氧化劑的保護(hù)面積為抗氧化劑作用下的熒光衰減曲線下的面積(AUCantioxidant)與無抗氧化劑存在時自由基作用的熒光衰減曲線下的面積(AUCblank)之差,即熒光熄滅曲線的延遲部分面積(net AUC)。

net AUC=AUCantioxidant-AUCblank

式(4)

1.2.5.5 DNA損傷保護(hù)能力測定 參照Gao等[21]方法并做適當(dāng)修改,用于測定雞骨素酶解液MRPs對環(huán)狀超螺旋pBR322型質(zhì)粒抵抗H2O2氧化的保護(hù)能力。15 μL的反應(yīng)液由1 μL pBR322型質(zhì)粒DNA溶液(0.5 μg/μL)、5 μL待測樣品、5 μL PBS溶液(pH7.4,10 mmol/L)、2 μL FeSO4溶液(1 mmol/L)和2 μL H2O2溶液(1 mmol/L)組成,37 ℃孵育30 min。然后進(jìn)行DNA電泳檢測條帶,電泳條件:電壓60 V,電泳50 min,于凝膠成像系統(tǒng)中獲得電泳條帶圖,利用Quantity One凝膠分析軟件(BIO-RAD公司)分析條帶光密度獲得各處理組閉環(huán)結(jié)構(gòu)質(zhì)粒DNA相對含量。Trolox溶液(100 μmol/L)與PBS分別替代樣品作為正、負(fù)對照,用PBS替代雞骨素酶解液MRPs、FeSO4、H2O2溶液作為空白對照。

1.2.6 層次分析及綜合評分 參照聶繼云等[22]的研究方法，使用yaahp層次分析軟件對雞骨素酶解液MRPs顏色、風(fēng)味及抗氧化性等關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)賦予權(quán)重，并根據(jù)評價指標(biāo)的重要程度,構(gòu)造判斷矩陣進(jìn)行一致性檢驗(yàn)。參照黃曙光等[23]的研究方法，對各個不同樣品進(jìn)行綜合評價得分。

表2 雞骨素酶解液MRPs主要指標(biāo)權(quán)重判斷矩陣及其一致性檢驗(yàn)Table 2 Discriminant matrix and its consistency of evaluation indices for MRPs of enzymatic hydrolysates of chicken bone extract

利用層次分析對雞骨素酶解液MRPs顏色、風(fēng)味及抗氧化性等關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)賦予權(quán)重[19],根據(jù)評價指標(biāo)的重要程度,構(gòu)造判斷矩陣(如表1所示)。其中(max=7.016,一致性比率CR<0.1,表明此判斷矩陣通過一致性檢驗(yàn)。7個指標(biāo)中,感官評價的權(quán)重為0.29,各抗氧化性指標(biāo)均為0.1。

各樣品的綜合評價得分計(jì)算參照黃曙光等[20]的方法,具體計(jì)算公式如下:

M(b)=[bi-Min(bi)]/[Max(bi)-Min(bi)]

式(5)

M(b)=[Max(bi)-bi]/[Max(bi)-Min(bi)]

式(6)

Y=∑WiMi

式(7)

公式(5)和(6)分別為單因素“合理-滿意度”的計(jì)算公式,對于越大越好的指標(biāo)利用公式(5)計(jì)算,對于越小越好的指標(biāo)利用公式(6)計(jì)算;其中bi表示第i個指標(biāo);Wi表示第i個評價指標(biāo)的權(quán)重,Mi表示第i個指標(biāo)的合理-滿意度值;Y表示各個樣品組的綜合品質(zhì)得分。

根據(jù)“合理—滿意度”以及確定的評價指標(biāo)的權(quán)重,利用公式(7)計(jì)算得到Y(jié),具體公式如下:Y=0.29×M(感官評分)+0.21×M(亮度)+0.1×M(還原力)+0.1×M(ABTS+自由基清除能力)+0.1×M(ORAC)+0.1×M(ACE)+0.1×M(DNA損傷保護(hù)),由此公式計(jì)算出不同處理組雞骨素酶解液MRPs綜合品質(zhì)得分。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中所有試驗(yàn)樣品均設(shè)置3次重復(fù)。用SPSS11軟件one-way ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析同時利用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢測(p<0.05)。Orgin 8.0進(jìn)行繪圖,其中各圖同一指標(biāo)中不同字母表示差異顯著(p<0.05)。使用yaahp層次分析軟件進(jìn)行權(quán)重分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜分離雞骨素酶解液MRPs的吸光度及色澤差異

研究表明,雞骨素酶解液MRPs在420 nm處的吸光值代表美拉德反應(yīng)的褐變程度,吸收值越大,美拉德反應(yīng)高級反應(yīng)階段類黑精物質(zhì)的生成越多,褐變程度越高[13];在294 nm處的紫外吸收值可以反映美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的生成程度,其值越大,表明中間產(chǎn)物生成程度越高,初級階段羰氨反應(yīng)和分子重排的速度越快[24]。如圖1A所示,微濾和超濾的雞骨素酶解液MRPs在420 nm的吸光值較大,表明引起褐變的物質(zhì)分子量大于3 kDa;而雞骨素酶解液MRPs原液紫外吸收值最大，表明美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物生成程度最高,其次納濾的雞骨素酶解液MRPs紫外吸收較高，表明反應(yīng)中間生成物質(zhì)可能集中在0.3～1 kDa,這與中間產(chǎn)物主要為羰氨縮合物在失去一分子水后會轉(zhuǎn)變?yōu)橄７驂A,再經(jīng)過環(huán)化作用后形成其對應(yīng)的N取代葡基胺等小分子物質(zhì)是一致的[13]。

圖1 MRPs中不同組分吸光度及色澤差異Fig.1 Changes of absorbance and color about the different components from MRPs注:同一指標(biāo)不同字母代表差異顯著(p<0.05);圖4～圖7同。

雞骨素酶解液MRPs中的熒光吸收物質(zhì)被認(rèn)為是大分子褐變物質(zhì)的重要前體物,常作為美拉德反應(yīng)的指示劑,能靈敏的反映出該反應(yīng)的早期過程[13,25],Morales等[26]研究發(fā)現(xiàn)，熒光吸收物質(zhì)與DPPH等自由基清除能力有密切關(guān)系。各反應(yīng)體系雞骨素酶解液MRPs熒光強(qiáng)度的差異如圖1B所示,雞骨素酶解液MRPs經(jīng)納濾和反滲透后的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，說明美拉德反應(yīng)高級產(chǎn)物的主要前體物分子量范圍小于1 kDa。

色差儀對雞骨素、雞骨素酶解液、雞骨素酶解液MRPs及其不同分子量組分進(jìn)行色澤分析,結(jié)果如圖1C所示,雞骨素酶解液MRPs經(jīng)超濾、納濾、反滲透后的亮度值均超過85,且呈上升趨勢,這表明雞骨素酶解液MRPs中多數(shù)呈色物質(zhì)分子量大于1 kDa。各組分紅度值主要分布在0.84～3.22之間,且雞骨素酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后紅值降低,膜分離得到的美拉德產(chǎn)物紅度值均為負(fù)值。黃度值主要集中在10～30。雞骨素酶解液MRPs經(jīng)膜分離后的色澤變化與其褐變程度存在對應(yīng)關(guān)系,隨著膜孔徑的變小褐變物質(zhì)減少亮度增大,黃度值減小。

2.2 膜分離雞骨素酶解液MRPs后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異性

利用電子鼻對雞骨素及其酶解液經(jīng)膜分離雞骨素酶解液MRPs后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了主成分分析,同一坐標(biāo)軸上,各實(shí)驗(yàn)組間距越大,表示主成分差別越大[15]。圖2顯示第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別為72.13%和16.98%,總貢獻(xiàn)率為89.11%，大于85%，說明主成分可以很好的反映多指標(biāo)信息。并且雞骨素、雞骨素酶解液及其雞骨素酶解液MRPs原液在第一主成分上各個膜分離組分基本上沒有重疊,表明各組分在第一主成分上差異明顯,并且雞骨素酶解液MRPs原液及其各分離組分與雞骨素和雞骨素酶解液在兩個主成分上都與其他兩者差別較大(圖2),說明美拉德反應(yīng)有效改變了雞骨素酶解液的風(fēng)味成分;納濾組分和反滲透組分有重疊,表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味物質(zhì)在不同分子量范圍內(nèi)都有分布,隨著膜孔徑的變小雞骨素酶解液MRPs各組分在第一主成分差異逐漸增大。

圖2 膜分離后雞骨素酶解液MRPs的主成分分析Fig.2 Analysis of principal component about the MPRs separated by membrane

對雞骨素、雞骨素酶解液及其MRPs感官評定得分如圖3所示。由圖3可知,雞骨素、雞骨素酶解液感官評價得分較低,進(jìn)行美拉德反應(yīng)生香后,感官得分明顯提高;隨著膜分離的進(jìn)行,不同分子量范圍的雞骨素酶解液MRPs組分的感官評分基本呈現(xiàn)降低趨勢,感官評價得分較高的組分主要集中雞骨素酶解液MRPs的微濾組分,這是因?yàn)閾]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要來源于美拉德反應(yīng)的高級階段,中期生成的大量活性中間體縮合、聚合或與氨基酸反應(yīng)得到高分子色素、吡嗪、咪唑,生成類黑素物質(zhì),同時生成大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[27]。電子鼻測量和感官評定揮發(fā)性呈味物質(zhì)，結(jié)果表明美拉德反應(yīng)可以顯著改變雞骨素酶解液的風(fēng)味,且呈味物質(zhì)集中在微濾和納濾組分。

圖3 膜分離后雞骨素酶解液MRPs感官評定Fig.3 Sensory evaluation about the MRPs separated by membrane

2.3 膜分離雞骨素酶解液MRPs抗氧化功能性差異

2.3.1 雞骨素酶解液MRPs還原力差異性分析 當(dāng)樣品具有良好的供電子能力時,可將Fe3+還原成Fe2+,并可以與自由基反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物在700 nm處吸光值可用于表示還原力的強(qiáng)弱[28]。雞骨素酶解液MRPs原液的鐵離子還原力相對于雞骨素酶解液顯著提高(p<0.05),還原力從0.12增加到0.55,提高了3.6倍。雞骨素酶解液MRPs各分離組分的還原能力基本呈現(xiàn)降低趨勢(如圖4),說明酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后產(chǎn)生了一些還原性物質(zhì),且該物質(zhì)主要集中在美拉德反應(yīng)高級產(chǎn)物中。

圖4 雞骨素酶解液MPRs還原力的差異性Fig.4 Difference of the MPRs about the reducing power

2.3.2 雞骨素酶解液MRPs對ABTS+自由基清除力及ACE抑制率差異性分析 ABTS+自由基溶液不受離子強(qiáng)度影響,可以在多種介質(zhì)中用于測定親水和親脂性物質(zhì)的抗氧化活性[29]。如圖5所示,雞骨素酶解液MRPs經(jīng)膜分離的納濾級別的產(chǎn)物對ABTS+自由基清除能力較強(qiáng),其他雞骨素酶解液MRPs分離組分的清除能力次之?？傮w來講雞骨素酶解液MRPs原液與雞骨素酶解液相比自由基清除能力顯著較高(p<0.05),ABTS+自由基清除力從30.26%增加到50.42%,提高了0.7倍。

ACE抑制率的測定是以HHL作為基質(zhì),該物質(zhì)與血管緊張素Ⅰ具有相同的C末端,可與ACE反應(yīng),所得產(chǎn)物之一馬尿酸(HA),利用高效液相色譜法測定馬尿酸從而計(jì)算ACE抑制率[30]。抑制ACE活性可以降低血管中緊張素Ⅱ的濃度起到降低血壓的作用,研究表明食物蛋白水解物可以通過抑制ACE的活性降低高血壓老鼠的血壓[31]。由圖5可知,雞骨素酶解液MRPs原液相對于雞骨素酶解液ACE抑制能力顯著提高(p<0.05),ACE抑制能力從21.95%增加到72.28%,提高了2.3倍。雞骨素酶解液MRPs各分離組分抑制率也顯著高于雞骨素、雞骨素酶解液,但均顯著低于雞骨素酶解液MRPs原液。這表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了可以抑制ACE活性的物質(zhì),為美拉德反應(yīng)的廣泛應(yīng)用提供新思路。

圖5 雞骨素酶解液MRPs對ABTS+自由基清除力及ACE抑制率的差異性Fig.5 Differences of the MPRs about the capacity of scavenging ABTS+ free radical and the ACE inhibitory rate

2.3.3 雞骨素酶解液MRPs對氧自由基吸附能力差異性分析 抗氧化物質(zhì)可清除氧自由基,減少氧自由基對熒光素鈉鹽的破壞,從而引起熒光強(qiáng)度變化[20]。根據(jù)圖6顯示結(jié)果,雞骨素酶解液MRPs具有較高的氧自由基吸附能力,顯著高于雞骨素、雞骨素酶解液(p<0.05),氧自由基吸附能力從7.78增加到12.09,提高了0.6倍,其他雞骨素酶解液MRPs分離組分對氧自由基吸附能力雖然顯著高于雞骨素酶解液(p<0.05),但與雞骨素酶解液MRPs原液相比無顯著性差異。

圖6 雞骨素酶解液MRPs對氧自由基吸附能力的差異性Fig.6 Difference of the MPRs about oxygen radical absorbance capacity

2.3.4 雞骨素酶解液MRPs對DNA氧化損傷保護(hù)能力差異性分析 H2O2、Fe2+等氧化劑能夠破壞超螺旋質(zhì)粒DNA環(huán)狀分子,從而環(huán)狀DNA會斷裂形成開環(huán)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步會形成線性結(jié)構(gòu)。不同的DNA分子構(gòu)型在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同,其中超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快,其次為線狀DNA,最慢為開環(huán)質(zhì)粒DNA[32]。雞骨素酶解液MRPs的不同組分對H2O2誘導(dǎo)超螺旋質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)能力差異如圖7所示,在沒有氧化劑(H2O2和Fe2+)的條件下,質(zhì)粒DNA為閉環(huán)結(jié)構(gòu),相對含量約94.94%(C1),而加入氧化劑的處理后,閉環(huán)相對含量降低至0.25%(C2),而加入的Trolox的陽性對照組能起到有效的防止DNA損傷作用(C3)[21],雞骨素基本對環(huán)狀質(zhì)粒DNA損傷無保護(hù)能力,雞骨素酶解液對環(huán)狀質(zhì)粒DNA的保護(hù)能力為8.91%,雞骨素酶解液MRPs原液對環(huán)狀質(zhì)粒DNA損傷保護(hù)能力達(dá)到51.94%,保護(hù)能力提高了4.8倍,顯著高于酶解液(p<0.05)。除納濾組分外,雞骨素酶解液MRPs的其他組分對環(huán)狀質(zhì)粒DNA的保護(hù)能力與雞骨素酶解液MRPs原液相比有所降低但依然顯著高于VE的保護(hù)能力(p<0.05)。研究表明DNA損傷會導(dǎo)致細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞衰老等不正常的生理現(xiàn)象[33],該研究結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物尤其是微濾和超濾組分，對于由氧化脅迫導(dǎo)致的DNA損傷有很好的保護(hù)作用,為美拉德反應(yīng)在細(xì)胞抗氧化抗衰老領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

圖7 雞骨素酶解液MRPs對DNA氧化損傷保護(hù)能力的差異性Fig.7 Difference of the MPRs about the capacity of protecting DNA oxidative damage

總體來講雞骨素酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后抗氧化活性得到顯著提高(p<0.05),但雞骨素酶解液MRPs經(jīng)膜分離后得到不同分子量的組分抗氧化活性隨著分子量的減小而減弱,各組分(除反滲透組分外)依然顯著高于雞骨素酶解液(p<0.05),這表明雞骨素酶解液MRPs的抗氧化活性物質(zhì)的分子量>0.3 kDa。

2.4 層次分析及綜合評分

由各個不同樣品綜合評價得分(表3)可知,雞骨素酶解液MRPs原液、納濾及微濾為前3名,雞骨素、雞骨素酶解液為倒數(shù)1、2名,說明美拉德反應(yīng)能顯著提高雞骨素衍生化產(chǎn)品的綜合品質(zhì),其中雞骨素酶解液MRPs原液,在風(fēng)味、色澤及主要抗氧化能力都顯著較高,雞骨素酶解液MRPs的納濾組分綜合品質(zhì)要高于其他組分。

表3 雞骨素酶解液MRPs不同組分綜合品質(zhì)得分Table 3 Scores of the quality evaluation for MRPs with different components

3 結(jié)論

本文對雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物膜分離后的各組分進(jìn)行初步探究。研究發(fā)現(xiàn):雞骨素酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后能夠有效改善雞骨素酶解液的風(fēng)味,抗氧化能力顯著提高(p<0.05);雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)引起褐變物質(zhì)的分子量大于3 kDa;雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)中間生成物質(zhì)的分子量集中在0.3～1 kDa范圍內(nèi);雞骨素酶解液美拉德反應(yīng)各組分的抗氧化能力隨分子量的減小稍有降低,沒有呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系,但各組分(除反滲透組分外)抗氧化能力依然顯著高于雞骨素酶解液(p<0.05);綜合評分,美拉德反應(yīng)能顯著提高雞骨素衍生化產(chǎn)品的綜合品質(zhì),與其他組分相比雞骨素酶解液MRPs原液,在風(fēng)味、色澤及主要抗氧化能力綜合得分都較高,膜分離后的雞骨素酶解液MRPs各組分綜合評分雖然低于雞骨素酶解液MRPs原液綜合評分但都高于雞骨素和雞骨素酶解液的綜合評分。本文為雞骨素進(jìn)一步深度開發(fā)利用提供了一定的理論支撐,同時為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不同組分分子量的分布提供了基礎(chǔ)信息。