丁酸梭菌及其肽聚糖對腸道細(xì)胞凋亡的研究

尹杰

摘 要：目的：提取丁酸梭菌肽聚糖并探究其對HT-29細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。方法：本實驗首先使用TCA法提取丁酸梭菌肽聚糖，并對其進行紅外光譜分析。用不同濃度的肽聚糖溶液處理HT-29細(xì)胞24h并使用MTT法檢測細(xì)胞生長、增殖情況。采用RT-PCR法對蛋白因子Bax、TNF-α、Hsp70、Caspase-3、NF-κB的mRNA表達(dá)水平進行檢測。結(jié)論：肽聚糖對腸道細(xì)胞有抑制生長作用；且隨濃度增加，抑制作用越強。Bax、TNF-α、Hsp70表達(dá)量增加，Caspase-3表達(dá)量不變，NF-κB表達(dá)量減少。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌；肽聚糖；人結(jié)腸癌細(xì)胞株；凋亡

1 前言

丁酸梭菌是人體內(nèi)的益生菌，厭氧菌，研究表明對人體并無明顯副作用。丁酸梭菌對人體腸道有著重要的保護作用，但是有些作用機制尚不明確，本實驗的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖與腸道細(xì)胞的作用機制，為腸道菌群對腸道細(xì)胞作用的研究提供新的方向和見解。

2 材料方法

2.1材料

本實驗使用人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基中，并且進行傳代，傳代的細(xì)胞用于實驗。實驗使用的是指數(shù)期生長的細(xì)胞。

2.2實驗方法

2.2.1丁酸梭菌肽聚糖的提取和檢測

破除細(xì)胞壁并去除磷壁酸

1）3000r/min，10min后離心收集菌種，之后加入300mL TCA溶液中，在水浴鍋中以100℃沸水浴30min，裂解菌體。

2）待其冷卻后，12000r/min，15min后收集細(xì)胞壁沉淀，用去離子水洗滌5次。

除蛋白和脂質(zhì)并檢測

1）將沉淀溶于胰蛋白酶-磷酸緩沖液（胰蛋白酶3mg/mL，磷酸緩沖液0.1mol/L，pH8.0）中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，再3000r/min，5min，棄沉淀。上清液12000r//min，15min，之后沉淀用去離子水洗滌5次。

2）洗滌后加入甲醇-氯仿溶液（1：1），之后12000rmin，15min，然后70℃干燥箱里干燥，最后得到褐色肽聚糖提取物，進行紅外光譜檢測。

2.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

1）先使用胰蛋白酶作用于HT-29細(xì)胞，再用1640培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清、1%雙抗）制成細(xì)胞懸液，稀釋到5x105/mL細(xì)胞，加到96孔板中。每孔200μL，放入5% CO2和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2）細(xì)胞貼壁后析出上清。對照組不加肽聚糖，只加1640培養(yǎng)基，實驗組控制肽聚糖濃度分別為200，400，600，800，1000μg/ mL，培養(yǎng)24h。

3）MTT實驗前4h，每孔加入10μL 0.5 mg/mL MTT（用0.01 mol/L PBS，pH7.2配制），然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。

4）4h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩直至結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm測定吸光度值。

5）抑制率的計算，公式為：抑制率（%）=（OD對照-OD實驗）/OD對照×100%

2.2.3 RT-PCR檢測肽聚糖對HT-29細(xì)胞RNA水平的影響

從組織或細(xì)胞中提取總RNA，用mRNA作為模板，用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶形成cDNA。 再使用cDNA作為模板進行PCR擴增以獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。 RT-PCR可以分析一些極少量的RNA樣品。

3 結(jié)果與分析

3.1不同濃度肽聚糖處理對HT-29細(xì)胞生長、增殖的影響

肽聚糖濃度分別為0、200、400、600、800、1000μg/ mL，作用于HT-29細(xì)胞。根據(jù)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)24h后，隨肽聚糖濃度的增加，吸光度變小，也就是說明肽聚糖濃度越高，細(xì)胞存活越少。

之后根據(jù)公式：抑制率（%）=（OD對照-OD實驗）/OD對照×100%，計算出抑制率，如表3.2，肽聚糖濃度為1000μg/mL時抑制率最高，此時細(xì)胞存活最少。

3.2 Bax、TNF-α、Hsp70、Caspase-3和NF-κB的mRNA表達(dá)水平

3.2.1不同濃度肽聚糖對HT-29細(xì)胞Bax表達(dá)的影響

Bax基因是人體最主要的凋亡基因，屬于Bcl-2 基因家族。結(jié)果顯示，如圖3.3肽聚糖對Bax的表達(dá)有促進作用。肽聚糖能促進其表達(dá)，說明能促進凋亡。

3.2.2不同濃度肽聚糖對HT-29細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

TNF-α八十年代在歐美曾展開臨床研究，然而由于毒副作用嚴(yán)重而被迫終止。但由于TNF-α明確的抗腫瘤活性使得學(xué)者們不愿輕易放棄。肽聚糖能促進其表達(dá)，說明能促進凋亡。

3.2.3不同濃度肽聚糖對HT-29細(xì)胞 Hsp-70表達(dá)的影響

Hsp-70是分子量約70kD的熱休克蛋白，是熱休克蛋白家族中組重要的一員。結(jié)果顯示肽聚糖對Hsp-70的表達(dá)有促進作用，Hsp-70有著促進凋亡的作用，肽聚糖能促進其表達(dá)，說明能促進凋亡。

3.2.4不同濃度肽聚糖對HT-29細(xì)胞 Caspase-3表達(dá)的影響

Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，Caspase-3基因轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞后引起細(xì)胞凋亡，這個過程可以被Bcl-2阻斷；在發(fā)生凋亡的細(xì)胞提取液中去除Caspase-3后，這些提取液就失去了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力；再加入純化的Caspase-3它又能恢復(fù)致凋亡的功能。結(jié)果顯示，肽聚糖對Caspase-3的表達(dá)無任何作用。

3.2.5不同濃度肽聚糖對HT-29細(xì)胞 NF-κB表達(dá)的影響

NF-κB及其介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞凋亡中的作用是國內(nèi)外研究的熱點。結(jié)果顯示，肽聚糖對NF-κB的表達(dá)有抑制作用，肽聚糖能抑制其表達(dá)，說明能促進凋亡。

4 總結(jié)與展望

本文實驗結(jié)果如下：

2）使用MTT法發(fā)現(xiàn)肽聚糖對HT-29細(xì)胞生長、增殖有抑制作用，并且隨著濃度增加，抑制作用越明顯；

3）使用RT-PCR法從mRNA表達(dá)量分析肽聚糖對HT-29細(xì)胞幾個細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)肽聚糖對BAX和TNF-α和Hsp-70 mRNA的表達(dá)量增加，對Caspase-3 mRNA的表達(dá)量無明顯作用，對NF-κB mRNA的表達(dá)量減少。

丁酸梭菌是人體內(nèi)的益生菌，厭氧菌，研究表明對人體并無明顯副作用，而且對腸道菌群的調(diào)節(jié)有著重要作用，比如調(diào)節(jié)環(huán)境酸堿度殺死有害菌等。本實驗的目的就是研究丁酸梭菌的肽聚糖與腸道細(xì)胞的作用機制，為腸道菌群對腸道細(xì)胞作用的研究提供新的方向和見解。

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