羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞生長性能、免疫功能和抗氧化能力的影響

陳曉宇 朱連勤 陳 甫 張貝貝 朱風(fēng)華*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，青島266109)

羅伊氏乳桿菌具有增強動物免疫功能的作用。Hou等[1]報道，羅伊氏乳桿菌I5007可增強T細(xì)胞分化并誘導(dǎo)回腸細(xì)胞因子表達(dá)，表明該菌株可調(diào)節(jié)斷奶仔豬的免疫功能。Yang等[2]給仔豬補充羅伊氏乳桿菌后，提高了仔豬的血漿白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、干擾素-β(interferon-β，IFN-β)含量。Tang等[3]認(rèn)為羅伊氏乳桿菌通過調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等的含量，實現(xiàn)對機體免疫功能的調(diào)節(jié)。羅伊氏乳桿菌可增強動物抗氧化能力。Hou等[1]報道，羅伊氏乳桿菌在體外可有效清除自由基，并可用于緩解氧化應(yīng)激；給生長肥育豬補充羅伊氏乳桿菌可提高血漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。Yang等[2]報道，給仔豬補充羅伊氏乳桿菌可降低血漿MDA含量，提高血漿SOD活性和總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)，改善了機體抗氧化能力。Kolling等[4]發(fā)現(xiàn)，小鼠補充鼠李糖乳桿菌肽聚糖后，顯著提高了呼吸道TNF-α和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)含量，降低了肺炎球菌的感染，發(fā)揮了明顯的黏膜免疫調(diào)節(jié)作用。也有研究報道，嗜酸乳桿菌肽聚糖通過激活Toll樣受體2(Toll-like receptors 2，TLR2)信號識別，改善調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)/輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)失衡，誘導(dǎo)Treg免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖能顯著提高三齒鱟血液SOD活性和T-AOC，并提高了機體抗氧化防御系統(tǒng)的代償能力和自由基代謝狀態(tài)。羅伊氏乳桿菌是通過何種菌體成分或代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化損傷和調(diào)節(jié)免疫功能的尚未見報道。本試驗通過在蛋雛雞飼糧中添加不同劑量的羅伊氏乳桿菌肽聚糖，研究其對蛋雛雞生長性能、免疫功能和抗氧化能力的影響，以期為羅伊氏乳桿菌肽聚糖在生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取96只1日齡健康的海蘭褐蛋雛雞，隨機分為4個組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)6只。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加250、500和1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖。試驗期42 d。羅伊氏乳桿菌肽聚糖為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物營養(yǎng)病與中毒病實驗室制備，其肽聚糖純度為97.75%?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗雞自由采食、飲水。7日齡時對試驗雞進行新城疫Ⅳ系、傳染性支氣管炎H120二聯(lián)弱毒苗滴鼻點眼免疫；14日齡時對試驗雞進行傳染性法氏囊病弱毒疫苗飲水免疫，雙倍量飲水。雞舍溫度在前5 d保持在32～34 ℃，然后每周以2 ℃的速度逐漸下降，最終室溫控制在22～24 ℃。按照消毒程序規(guī)范消毒。每日觀察試驗雞的精神狀態(tài)、行為表現(xiàn)、糞便狀況。在整個試驗期內(nèi)各組的試驗條件保持一致。

1.3 試驗材料

GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA、免疫球白蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球白蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球白蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、IL-2、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-6和IFN-γ試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；新城疫病毒抗體(Newcastle disease virus antibody，NDV-Ab)和傳染性法氏囊病病毒抗體(infectious bursal disease virus antibody，IBDV-Ab)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海勁馬生物科技有限公司。

1.4 儀器設(shè)備

主要儀器包括MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾儀器有限公司)、SPH-211B型控溫?fù)u床(上海世平試驗設(shè)備有限公司)、Beta 2-8 LSCbasic型真空冷凍干燥機(德國Martin Christ公司)、3K15型低溫高速離心機(美國Sigma公司)。

1.5 樣品采集和指標(biāo)檢測

分別于試驗第1、21和42天早晨空腹稱重，以每個重復(fù)為單位，計算試驗雞平均日增重，并準(zhǔn)確記錄采食量和剩料量，計算試驗雞平均日采食量和料重比(平均日采食量/平均日增重)。

分別于試驗第21和42天，從每個重復(fù)取3只雞，心臟采血5 mL，分別置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)真空采血管和肝素鈉采血管中，EDTA-2Na真空采血管用做血液常規(guī)指標(biāo)檢測，肝素鈉采血管3 000 r/min離心10 min分離血漿后用于血漿抗氧化和免疫指標(biāo)的測定。

1.5.1 血液常規(guī)指標(biāo)的檢測

用顯微鏡計數(shù)法檢測血液白細(xì)胞(white blood cell，WBC)和紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)總數(shù)，沙利氏比色法檢測血紅蛋白(hemoglobin，HGB)含量，溫氏法檢測紅細(xì)胞壓積(hematocrit，HCT)。

1.5.2 血漿抗氧化和免疫指標(biāo)的檢測

按照試劑盒說明書測定血漿GSH-Px和SOD活性、T-AOC以及MDA、IgG、IgA、IgM、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6含量。采用ELISA試劑盒測定血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平。

1.5.3 免疫器官指數(shù)測定

試驗結(jié)束時，按常規(guī)方法進行屠宰，屠宰后摘取脾臟、胸腺以及法氏囊，并剔除其表面的脂肪，計算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)(g/kg)=免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(kg)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的ANOVA模塊進行統(tǒng)計分析和多重比較，用ANOVA模塊對數(shù)據(jù)進行方差分析，Waller-Duncan氏法進行多重比較，然后對羅伊氏乳桿菌肽聚糖添加水平進行線性(linear)和二次曲線(quadratic)回歸分析。試驗的結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞生長性能的影響

由表2可見，試驗第21、42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組平均日增重顯著高于其他各組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組料重比顯著低于對照組(P<0.05)。試驗第21天，對照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組平均日采食量顯著高于500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響

由表3可見，試驗第42天，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血液白細(xì)胞總數(shù)顯著高于對照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗第21、42天，各組之間血液紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積差異不顯著(P>0.05)。

2.3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可見，試驗第21、42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿GSH-Px、SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿T-AOC顯著高于對照組和250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗第42天，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿MDA含量顯著低于對照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.4 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

由表5可見，試驗第21天，250 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgG含量顯著高于對照組及500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgA、IL-4含量顯著高于對照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗第42天，500、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IL-2含量顯著高于對照組(P<0.05)，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿IgA、IgG、IL-4、IL-6和IFN-γ含量顯著高于對照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。試驗第21、42天，各組之間血漿IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞生長性能的影響

表3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血液常規(guī)指標(biāo)的影響

2.5 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平的影響

由表6可見，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平顯著高于對照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。

2.6 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞免疫器官指數(shù)的影響

由表7可見，1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組脾臟指數(shù)顯著高于對照組及250、500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)，250、1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組胸腺指數(shù)顯著高于對照組和500 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖組(P<0.05)。各組之間的法氏囊指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。

表4 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

表5 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

5ItemsTimeLactobacillus reuteri peptidoglycan supplemental level/(mg/kg)0 250 500 1 000P P-valueANOVALinearQuadratic-4IL-4/(ng/L)21 Day 21169.56±5.76b159.74±10.16b164.36±11.46b190.17±16.58a0.0150.0250.01042 Day 42263.13±18.03d331.07±6.66c360.21±4.94b436.41±3.76a<0.001<0.0010.428-6IL-6/(ng/L)21 Day 21137.21±2.41148.59±11.47141.59±15.34157.29±18.400.2140.1000.75142 Day 42206.70±6.53c208.69±11.66c228.43±1.23b257.50±10.59a<0.001<0.0010.008-γIFN-γ/(ng/L)21 Day 2198.26±2.32b105.10±0.82b149.99±7.26a161.47±17.91a<0.001<0.0010.64242 Day 42124.29±4.62c127.68±8.40c158.98±2.76b185.21±11.46a<0.001<0.0010.011

表6 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平的影響

表7 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞免疫器官指數(shù)的影響

3 討 論

3.1 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞生長性能的影響

微生態(tài)制劑尤其是益生菌在家禽飼糧廣泛應(yīng)用，益生菌通過增加有益微生物的數(shù)量和酶活性，改善腸道微生物平衡，從而影響食物的消化、吸收和攝入量，進而改善消化過程[7-9]。Yi等[10]給仔豬服用羅伊氏乳桿菌(5×1010CPU/kg)顯著提高了仔豬的體重，與添加抗生素的效果相仿。羅伊氏乳桿菌可以替代抗生素作為生長促進劑來改善幼畜的消化吸收功能[11]。在肉雞飼糧中添加羅伊氏乳桿菌可以提高肉雞的平均日增重，降低飼料消耗，飼料轉(zhuǎn)化率降低了6%～7%[12]。羅伊氏乳桿菌提高動物生長發(fā)育的機制是比較復(fù)雜的，既有益生菌本身作用，也有各種代謝產(chǎn)物的作用。飼料中添加雙歧桿菌肽聚糖可顯著促進日本對蝦生長[13]。飼料中添加雙歧桿菌肽聚糖能顯著提高日本刺參的生長性能[14]。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著提高蛋雛雞平均日增重，添加250～1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著降低蛋雛雞料重比。由此可見，羅伊氏乳桿菌肽聚糖可用做雛雞的飼料添加劑，以提高雛雞的生長性能。

3.2 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

Yang等[2]報道，給仔豬口服羅伊氏乳桿菌顯著降低了血漿MDA含量，提高了血漿T-AOC及SOD、GSH-Px活性。Tang等[15]給患有壞死性小腸結(jié)腸炎小鼠灌服羅伊氏乳桿菌，顯著提高了患病小鼠腸道組織SOD活性和谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量，顯著降低腸道組織MDA、氧化性谷胱甘肽(glutathione oxidized，GSSG)含量和GSSG/GSH比值。Arcanjo等[16]體外試驗發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌可能通過由dhaT基因編碼的還原性輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)依賴性氧化還原酶發(fā)揮抗氧化反應(yīng)。關(guān)于乳酸菌提高動物機體抗氧化能力的機制前人也進行了有價值的探索。Mantis等[17]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌肽聚糖能誘導(dǎo)小鼠腸黏膜并形成保護膜，從而減緩炎癥反映，進而增加抗氧化應(yīng)激的能力。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加枯草芽孢桿菌肽聚糖提高了鯉魚腸上皮細(xì)胞的抗氧化能力。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖可以顯著提高蛋雛雞血漿GSH-Px、SOD活性和T-AOC，并顯著降低血漿MDA含量。羅伊氏乳桿菌肽聚糖與其他益生菌肽聚糖一樣，具有抗氧化應(yīng)激的作用。由此可見，肽聚糖作為羅伊氏乳桿菌細(xì)胞壁的組成成分，在羅伊氏乳桿菌的抗氧化損傷的機制上扮有重要的角色，肽聚糖抗氧化損傷的機制有待進一步研究證實。

3.3 羅伊氏乳桿菌肽聚糖對蛋雛雞血漿免疫指標(biāo)的影響

羅伊氏乳桿菌I5007可增強T細(xì)胞分化并誘導(dǎo)回腸細(xì)胞因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)斷奶仔豬的免疫功能[1]。補充羅伊氏乳桿菌可提高新生仔豬血漿IL-2、IFN-α、IFN-β含量[2]。Gonmei等[19]報道，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌PIA16在一定程度上能夠提高雞的血漿NDV-Ab水平。He等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，低劑量羅伊氏乳桿菌組雌性和雄性小鼠的血漿IL-12含量均顯著升高。Sureshkumar等[21]認(rèn)為羅伊氏乳桿菌通過調(diào)節(jié)IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等含量，實現(xiàn)對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。羅伊氏乳桿菌的哪一種代謝產(chǎn)物發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用卻鮮見報道。Li等[22]報道，植物乳桿菌細(xì)胞壁肽聚糖可提高IL-4、IL-12、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平，對小鼠先天免疫和體液免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。Kolling等[4]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠補飼肽聚糖時，顯著提高了支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-10含量，減少肺炎球菌的感染，肽聚糖在小鼠的呼吸道黏膜免疫發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg的羅伊氏乳桿菌肽聚糖可顯著提高蛋雛雞血漿IgG、IgA、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ含量，證明羅伊氏乳桿菌增強免疫作用與其細(xì)胞壁肽聚糖密切相關(guān)。Barinskiǐ等[23]將肽聚糖-160與免活疫苗相結(jié)合，可顯著提高小鼠的蜱傳腦炎(TBE)疫苗的保護作用。Ridi等[24]以肽聚糖作為免疫佐劑，對小鼠注射血吸蟲病疫苗產(chǎn)生的抗體效價具有明顯增強作用。本試驗也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖能顯著提高蛋雛雞血漿NDV-Ab和IBDV-Ab水平，表明羅伊氏乳桿菌增強動物機體免疫作用的機制與肽聚糖有關(guān)。關(guān)于肽聚糖增強免疫功能的機制尚不十分清楚。嗜酸乳桿菌肽聚糖TLR2信號識別，誘導(dǎo)Treg免疫反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17失衡，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[5]。Cross[25]研究指出，地衣芽孢桿菌細(xì)胞壁含有肽聚糖和多糖，能直接活化宿主的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等免疫系統(tǒng)，進而促進免疫器官的生長發(fā)育，增強機體抵抗致病菌的能力。本試驗也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加羅伊氏乳桿菌肽聚糖可不同程度地提高胸腺、脾臟指數(shù)，奠定了羅伊氏乳桿菌肽聚糖增強雛雞免疫功能的組織學(xué)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

飼糧中添加1 000 mg/kg羅伊氏乳桿菌肽聚糖可以提高蛋雛雞生長性能，提高雛雞抗氧化能力，促進免疫器官發(fā)育，提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能，增強新城疫疫苗和傳染性法氏囊病疫苗的免疫效果。