桑葉發(fā)酵工藝優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

崔藝燕 王超普 彭 蘇 鄧 盾 田志梅 魯慧杰 余 苗 劉志昌* 馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名525000)

單寧是復(fù)雜的水溶性多酚化合物，存在于許多植物中，并可存在于樹(shù)皮、樹(shù)葉、樹(shù)干、果實(shí)和根中[1]。單寧能夠絡(luò)合蛋白質(zhì)、氨基酸、大分子物質(zhì)，對(duì)消化酶產(chǎn)生拮抗作用，阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，降低動(dòng)物的消化率[2]；并因其苦澀的味道減少動(dòng)物的采食量，從而降低植物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-4]。桑葉資源豐富，富含粗蛋白質(zhì)(CP)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)[5]，是一種較好的非常規(guī)飼料資源。但桑葉單寧含量較高，限制了其在畜牧業(yè)的應(yīng)用。因此，有效降解單寧對(duì)提升桑葉的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。

物理加工技術(shù)可以有效地降解單寧，如高溫、浸泡、煮沸、高壓、擠壓蒸煮等[6-8]。盡管上述技術(shù)可以降解一些單寧，但也可能降低桑葉營(yíng)養(yǎng)成分。另外，上述技術(shù)耗能成本較高，不利于可持續(xù)發(fā)展。因此，需要一種更合適的、高效降解桑葉單寧的技術(shù)。發(fā)酵是利用微生物將植物莖葉成分轉(zhuǎn)化為微生物蛋白、活性小肽、活性物質(zhì)的技術(shù)，能降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9]。黑曲霉、地衣芽孢桿菌、酵母、乳酸菌可以高效地將高分子單寧降解為小分子物質(zhì)[2,10-12]。柔毛鐮孢菌和球孢白僵菌等絲狀真菌發(fā)酵顯著減少了橄欖餅單寧含量[13]。黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌發(fā)酵降低了辣木葉41%單寧含量，提高了44% CP含量[14]。羅伊氏乳桿菌、乳酸片球菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵降低了朱纓花葉單寧含量[15]。這些文獻(xiàn)為發(fā)酵降解桑葉單寧提供了思路。但是，關(guān)于桑葉發(fā)酵工藝的研究很少，通過(guò)發(fā)酵技術(shù)降解桑葉單寧的研究更少，尚不清楚發(fā)酵條件如何影響桑葉單寧的降解。因此，本研究通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了提高桑葉CP含量同時(shí)降低單寧含量的發(fā)酵條件，研究了桑葉發(fā)酵基質(zhì)組成、菌種組合、接種量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)單寧降解的影響，并且探討了發(fā)酵對(duì)桑葉營(yíng)養(yǎng)成分的影響，以期為桑葉的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供，測(cè)得桑葉干物質(zhì)(DM)、CP、粗脂肪(EE)、單寧含量分別為30.50%、23.67%、2.52%、1.32%。

酒窖片球菌(Pediococcuscellicola)CGMCC1.3787購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)均來(lái)自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所。

1.2 主要試劑及儀器

培養(yǎng)微生物使用的MRS肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。測(cè)定指標(biāo)所用的單寧酸(貨號(hào)16201)購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司，茚三酮(分析純)購(gòu)自上海伯奧生物科技有限公司，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，其余試劑均為分析純。

測(cè)定指標(biāo)使用的主要儀器有KjeltecTM8400全自動(dòng)凱氏定氮儀(FOSS公司)、Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)、2055 SOXTEC半自動(dòng)脂肪測(cè)定儀(FOSS公司)、Ankom 220纖維分析儀(Ankom公司)、SX2-4-10馬弗爐(上海一恒科技有限公司)、L8900氨基酸分析儀(Hitachi公司)等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.3.1 種子液的制備

取0.1 mL酒窖片球菌保存液于100 mL滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取0.1 mL地衣芽孢桿菌保存液于100 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。取0.1 mL葡萄牙棒孢酵母保存液于100 mL滅菌馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。用滅菌水調(diào)整上述活化后菌液濃度為1.5×106CFU/mL，備用。

1.3.2 發(fā)酵基質(zhì)的制備

將鮮桑葉切短(1～2 cm)，按照一定比例添加麩皮混合均勻，按照所需菌種組合和接種量添加菌種并攪拌均勻，發(fā)酵基質(zhì)未滅菌，基質(zhì)pH自然狀態(tài)(不調(diào)整pH)，每個(gè)呼吸袋裝入200 g發(fā)酵基質(zhì)，密封發(fā)酵。在空調(diào)房?jī)?nèi)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為(25±1) ℃。

1.3.3 正交試驗(yàn)

為了獲得高CP含量和低單寧含量的發(fā)酵桑葉的優(yōu)化組合，以桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)、菌種組合(B)、接種量(C)和發(fā)酵時(shí)間(D)為影響因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)依據(jù)為前期單因素試驗(yàn)結(jié)果。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，共9組(T1～T9)，每組3個(gè)重復(fù)。按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)1.3.2發(fā)酵基質(zhì)的制備方法進(jìn)行桑葉發(fā)酵，共制備發(fā)酵桑葉27袋，每袋200 g發(fā)酵基質(zhì)。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的組合，進(jìn)行桑葉發(fā)酵，比較最優(yōu)條件下發(fā)酵桑葉和正交試驗(yàn)中最優(yōu)CP和單寧含量。

1.3.5 對(duì)比試驗(yàn)

根據(jù)最優(yōu)組合進(jìn)行桑葉發(fā)酵(10個(gè)重復(fù))，比較未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。發(fā)酵桑葉制備過(guò)程同1.3.2發(fā)酵基質(zhì)的制備，即按照桑葉與麩皮質(zhì)量比(9∶1)制備20袋發(fā)酵基質(zhì)(200 g/袋)，其中10袋發(fā)酵基質(zhì)不發(fā)酵，于-20 ℃存放。余下10袋加入2%的酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌菌液，(25±1) ℃下發(fā)酵4 d。發(fā)酵結(jié)束后，將樣品烘干后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定。

1.3.6 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

CP含量的測(cè)定參照GB/T 6432—1994，單寧含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]，DM含量的測(cè)定參照GB/T 6435—2014，EE含量的測(cè)定參照GB/T 6433—2006，粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]，粗灰分含量的測(cè)定采用550 ℃灼燒法，鈣含量的測(cè)定參照GB/T 6436—2018，磷含量的測(cè)定參照GB/T 6437—2002，氨基酸含量的測(cè)定參照GB/T18246—2000，根據(jù)CP、EE、粗灰分含量計(jì)算碳水化合物含量[15]：

碳水化合物(%)=100-CP-EE-粗灰分。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行一般線性模型(general linear model)或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent samplest-test)分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)極差分析

由表2可知，通過(guò)直觀分析方法比較表中極差大小，對(duì)CP含量影響因素大小排序?yàn)椋荷Ｈ~與麩皮質(zhì)量比(A)、菌種組合(B)、接種量(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)。根據(jù)Ki值的大小判斷最優(yōu)水平，得到各因素對(duì)CP含量的最優(yōu)組合為A1B2C2D2。同理，對(duì)單寧含量影響因素大小排序?yàn)椋壕N組合(B)、發(fā)酵時(shí)間(D)、桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)、接種量(C)，得到各因素對(duì)單寧含量的最優(yōu)組合為A1B2C2D1。綜合上述分析，桑葉發(fā)酵最優(yōu)方案為A1B2C2D1或A1B2C2D2，即桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4或6 d。

表2 正交試驗(yàn)極差分析

2ItemsMulberry leaves to bran mass ratio (A)Strain combination (B)Inoculation amount (C)Fermentation time (D)CP/%Tannin/%CPK124.68 23.48 23.82 24.17 K224.12 24.59 24.29 24.20 K323.35 24.09 24.05 23.78 R1.34 1.11 0.47 0.42 TanninK10.72 0.780.740.72 K20.76 0.72 0.74 0.73 K30.75 0.73 0.74 0.78 R0.040.06 0.00 0.06

2.2 正交試驗(yàn)方差分析

由表3和表4可知，CP的校正模型P值為0.030<0.05，說(shuō)明校正模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，正交試驗(yàn)結(jié)果具有可信度。桑葉與麩皮質(zhì)量比和菌種組合顯著影響發(fā)酵桑葉CP含量，說(shuō)明二者是影響發(fā)酵桑葉CP含量的主要因素。根據(jù)F值得到，對(duì)CP含量影響因素大小排序?yàn)椋荷Ｈ~與麩皮質(zhì)量比、菌種組合、接種量、發(fā)酵時(shí)間。對(duì)桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)分析，A1的CP含量顯著高于A3(P<0.05)，A2的CP含量與A1、A3差異均不顯著(P>0.05)，因此選擇A1。同理，菌種組合(B)選擇B2。桑葉與麩皮質(zhì)量比(A)和菌種組合(B)對(duì)CP含量的最優(yōu)組合為A1B2。

同理，菌種組合和發(fā)酵時(shí)間是影響單寧含量的主要因素。菌種組合(B)和發(fā)酵時(shí)間(D)對(duì)單寧含量的最優(yōu)組合為B2D1。綜合CP和單寧含量的最優(yōu)組合，得到桑葉發(fā)酵最優(yōu)組合為A1B2CiD1。

表3 正交試驗(yàn)方差分析

表4 正交試驗(yàn)方差分析多重比較

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

綜合極差分析(A1B2C2D1或A1B2C2D2)和方差分析(A1B2CiD1)結(jié)果，桑葉發(fā)酵的最優(yōu)組合為A1B2C2D1，即桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4 d。由于分析出來(lái)的最優(yōu)組合A1B2C2D1不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)之內(nèi)，因此對(duì)該組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。測(cè)得CP含量為26.18%，高于正交試驗(yàn)表最高CP含量(25.60%)；測(cè)得單寧含量為0.47%，低于正交試驗(yàn)表最低單寧含量(0.67%)，從而驗(yàn)證了桑葉發(fā)酵優(yōu)化組合為A1B2C2D1。

2.4 對(duì)比試驗(yàn)

2.4.1 營(yíng)養(yǎng)成分

發(fā)酵桑葉顏色黃綠，有桑葉清香，味道酸甜。由表5可知，發(fā)酵桑葉CP和EE含量分別比未發(fā)酵桑葉提高了16.82%和30.57%(P<0.05)。發(fā)酵桑葉粗灰分和磷含量顯著高于未發(fā)酵桑葉(P<0.05)。發(fā)酵桑葉單寧、NDF、碳水化合物含量分別比未發(fā)酵桑葉降低了56.40%、16.78%、7.29%(P<0.05)。發(fā)酵桑葉pH顯著低于未發(fā)酵桑葉(P<0.05)。發(fā)酵桑葉與未發(fā)酵桑葉之間DM、CF、ADF、鈣含量差異不顯著(P>0.05)。

表5 未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比

2.4.2 氨基酸含量

由表6可知，與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉精氨酸、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、總非必需氨基酸、總氨基酸含量顯著降低(P<0.05)，而丙氨酸含量、總必需氨基酸/總氨基酸(TEAA/TAA)、總必需氨基酸/總非必需氨基酸(TEAA/TNEAA)顯著提高(P<0.05)。

表6 未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉氨基酸含量對(duì)比

2.4.3 必需氨基酸組成

由表7可知，發(fā)酵桑葉的半胱氨酸+蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸組成均顯著高于未發(fā)酵桑葉(P<0.05)。與未發(fā)酵桑葉相比，發(fā)酵桑葉纈氨酸組成有提高的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉的賴氨酸和亮氨酸組成高于雞蛋蛋白和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)模式，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸和總必需氨基酸組成高于FAO模式，稍低于雞蛋蛋白模式，半胱氨酸+蛋氨酸組成低于雞蛋蛋白和FAO模式。由此可見(jiàn)，未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉的必需氨基酸組成較為均衡，發(fā)酵桑葉必需氨基酸組成優(yōu)于未發(fā)酵桑葉。

3 討 論

3.1 影響桑葉發(fā)酵的因素

桑葉與麩皮質(zhì)量比是影響發(fā)酵桑葉CP含量的主要因素。桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1時(shí)發(fā)酵所得的CP含量最高。這與桑葉的本底CP含量和微生物蛋白的合成有關(guān)。另外，試驗(yàn)中使用麩皮與新鮮桑葉混合發(fā)酵，調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的水分含量。微生物生長(zhǎng)需要最佳的水分含量，較低的水分含量會(huì)降低基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解度[18]。本試驗(yàn)中A1的發(fā)酵基質(zhì)水分含量高于A2和A3，有利于微生物的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。

表7 未發(fā)酵桑葉和發(fā)酵桑葉必需氨基酸組成對(duì)比

菌種組合是影響發(fā)酵桑葉CP含量的主要因素。酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌組合發(fā)酵所得的CP含量最高。酒窖片球菌、地衣芽孢桿菌與發(fā)酵基質(zhì)原有的微生物產(chǎn)生了協(xié)同作用?；炀l(fā)酵能利用菌種之間的協(xié)同作用達(dá)到更好的發(fā)酵效果，但試驗(yàn)中與葡萄牙棒孢酵母有關(guān)的組合未能提高CP含量。這與微生物共生與拮抗關(guān)系有關(guān)，某種微生物生長(zhǎng)迅速會(huì)抑制其他微生物的生長(zhǎng)[19]。葡萄牙棒孢酵母在發(fā)酵初期的有氧狀態(tài)下生長(zhǎng)迅速，抑制酒窖片球菌或地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，在發(fā)酵后期厭氧狀態(tài)下，菌體部分降解，造成CP含量未能提高。這需要測(cè)定不同時(shí)間發(fā)酵桑葉的微生物多樣性才能進(jìn)一步驗(yàn)證上述說(shuō)法。

菌種組合也是影響單寧含量的主要因素。發(fā)酵技術(shù)降解單寧的實(shí)質(zhì)是微生物酶(單寧酶、沒(méi)食子酸脫羧酶)催化單寧降解的酶促反應(yīng)[1-2,20]。酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌、酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌+葡萄牙棒孢酵母發(fā)酵桑葉的單寧含量顯著低于酒窖片球菌+葡萄牙棒孢酵母組合。研究報(bào)道芽孢桿菌和乳酸菌降解單寧[2, 21-22]，酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌組合的微生物群落共同作用產(chǎn)生的單寧降解酶也許比其他菌種組合產(chǎn)生的降解酶效果更優(yōu)、產(chǎn)量更大[23]。

發(fā)酵時(shí)間是影響單寧含量的主要因素，發(fā)酵4、6 d的單寧含量顯著低于發(fā)酵8 d。發(fā)酵時(shí)間影響了微生物的數(shù)量，改變微生物代謝產(chǎn)物的含量，繼而影響pH的變化。單寧酶活性通常在pH 5.5時(shí)最大[24]。地衣芽孢桿菌來(lái)源的單寧酶適宜pH為5.75[11]。不同微生物群落產(chǎn)生不同的單寧降解酶，這些酶在適宜pH下發(fā)揮較好的降解作用[1,20]。發(fā)酵初期微生物開(kāi)始生長(zhǎng)，pH逐步降低，發(fā)酵4、6 d期間的pH適合單寧降解酶發(fā)揮作用。另外潛在的其他變化需要更多的研究才能確定。

正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)條件(桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4 d)是一個(gè)整體，單獨(dú)采用其中一個(gè)條件，不能達(dá)到最好的效果。發(fā)酵基質(zhì)決定了能供給微生物生長(zhǎng)的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與接種量和發(fā)酵時(shí)間影響著酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)代謝。酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌決定了產(chǎn)生的單寧降解酶種類[18]，降解酶的產(chǎn)量和活性受到水分和其他代謝物含量的影響[25]。基質(zhì)水分含量高，則溶氧量較低，地衣芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1條件下迅速生長(zhǎng)創(chuàng)造厭氧環(huán)境，有利于厭氧的乳酸菌生長(zhǎng)。2%的接種量和發(fā)酵4 d使得酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌改變了基質(zhì)的微生物群落和營(yíng)養(yǎng)成分，使得增加的微生物和營(yíng)養(yǎng)成分之間達(dá)到平衡，這使酶的合成和活性達(dá)到最佳值[25]。這些條件綜合作用改善了桑葉的CP和單寧含量。

本發(fā)酵試驗(yàn)采用的是成熟綠葉，不是嫩葉和老葉。桑葉的CP含量隨著葉片的發(fā)育而變化，從而導(dǎo)致不同的水分含量、光合作用和次生代謝產(chǎn)物含量[26]。嫩桑葉的EE、CP、還原性糖、總黃酮、總多酚等含量均高于老桑葉，可溶性糖含量低于老桑葉[27-28]。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)的變化會(huì)對(duì)微生物代謝產(chǎn)生影響，成熟度對(duì)桑葉發(fā)酵的影響需要進(jìn)行更多的研究。

3.2 發(fā)酵對(duì)桑葉pH和營(yíng)養(yǎng)成分的影響

pH是重要的發(fā)酵飼料質(zhì)量指標(biāo)之一，大多數(shù)發(fā)酵飼料的最終pH均低于4.6[29]。新鮮桑葉鮮嫩多汁，口味甘甜[30]，發(fā)酵后氣味酸香，有助于改善適口性。發(fā)酵桑葉的pH顯著低于未發(fā)酵桑葉，表明桑葉發(fā)酵良好。酒窖片球菌產(chǎn)生較多的有機(jī)酸，使pH快速降低，可抑制不良微生物生長(zhǎng)。

發(fā)酵顯著提高了桑葉的CP、EE、粗灰分、磷含量，降低了NDF和碳水化合物含量，與樊路杰[31]研究結(jié)果相似。樊路杰[31]研究表明，芽孢桿菌、乳酸桿菌、酵母混合發(fā)酵3 d提高了桑葉CP和EE含量，降低了桑葉DM和CF含量。上述研究的差異是桑葉來(lái)源、發(fā)酵菌種、基質(zhì)配比的不同造成的。樊路杰[31]研究使用商品化菌劑發(fā)酵桑葉，本文采用酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵桑葉和麩皮。發(fā)酵后CP含量較高與乳酸菌和地衣芽孢桿菌合成菌體蛋白有關(guān)。研究報(bào)道，乳酸菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵能提高樹(shù)葉CP含量[32-33]。另外，發(fā)酵低pH可抑制蛋白酶或形成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物而直接降低蛋白質(zhì)水解作用[34]。此外，桑葉的功能成分可抑制微生物活性或酶促活性來(lái)促進(jìn)蛋白質(zhì)保存[35-36]。EE含量提高可能由于微生物利用碳水化合物合成脂肪，高灰分被認(rèn)為是礦物質(zhì)食物的良好來(lái)源[37]。NDF與碳水化合物含量減少，說(shuō)明微生物在生長(zhǎng)中利用碳水化合物合成了蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、有機(jī)酸等[38-39]。另一個(gè)原因是酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的高活性纖維素酶和淀粉酶能夠降解纖維和碳水化合物[34]。

3.3 發(fā)酵對(duì)桑葉氨基酸含量和組成的影響

必需氨基酸的種類、含量及組成是影響飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)的主要因素。除色氨酸未測(cè)定外，發(fā)酵桑葉測(cè)得17種氨基酸。發(fā)酵減少了桑葉的非必需氨基酸含量。這與以往結(jié)果一致，即發(fā)酵桑葉的氨基酸含量較未發(fā)酵桑葉減少[5]。微生物從發(fā)酵基質(zhì)中攝取氨基酸進(jìn)行生命活動(dòng)，微生物代謝和酶促轉(zhuǎn)化過(guò)程中消耗了氨基酸[9]。從CP和氨基酸含量可知，發(fā)酵提高了游離氨基酸含量。這也是發(fā)酵后部分氨基酸含量減少的原因。此外，植物蛋白酶與酒窖片球菌和地衣芽孢桿菌分泌的蛋白酶可水解桑葉蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸、小肽等非蛋白氮[40]。

根據(jù)FAO/世界衛(wèi)生組織(WHO)提出的理想蛋白模式[41]，發(fā)酵桑葉和未發(fā)酵桑葉的TEAA/TAA(0.47～0.48)和TEAA/TNEAA(0.88～0.92)均高于理想蛋白(TEAA/TAA>0.4，TEAA/TNEAA>0.6)，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源。但發(fā)酵桑葉中含硫氨基酸組成較低，使用中需要注意氨基酸平衡。

4 結(jié) 論

發(fā)酵桑葉的最佳條件是：桑葉與麩皮質(zhì)量比為9∶1，菌種組合為酒窖片球菌+地衣芽孢桿菌，接種量為2%，發(fā)酵時(shí)間為4 d。發(fā)酵提高了桑葉CP、EE、粗灰分、磷含量，降低單寧、NDF、碳水化合物、非必需氨基酸含量和pH。