葡萄糖和泌乳相關(guān)激素組合添加對奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白合成的影響

母曉佳 李大彪 孫 梅 曹 越 郝怡泓 楊 靜

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)自治區(qū)高等學(xué)校重點實驗室，呼和浩特010018)

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會進(jìn)步，人們對與乳制品的供應(yīng)和質(zhì)量要求越來越重視。乳蛋白的含量是鑒定牛奶質(zhì)量所必須的指標(biāo)之一，乳蛋白中的酪蛋白占總量的85%以上，其主要包括α-酪蛋白、β-酪蛋白(CSN2)和κ-酪蛋白(CSN3)[1]。葡萄糖是保證泌乳動物生命體和維持生產(chǎn)必不可少的營養(yǎng)素之一，只有確保乳腺中葡萄糖的充足供給，才可以保證泌乳動物的乳產(chǎn)量和乳成分的產(chǎn)量[2]。在奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)中，葡萄糖對蛋白質(zhì)合成的影響其中最重要的原因是通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成過程中所需的能量供應(yīng)來完成的。前人研究發(fā)現(xiàn)，奶牛在泌乳過程中，乳腺組織要消耗大量的葡萄糖來提供能量以保持整個泌乳過程中乳蛋白的合成，采用奶牛靜脈注射葡萄糖的方法可以促進(jìn)乳蛋白的合成[3]。另外，額外提供葡萄糖可以節(jié)省生糖氨基酸合成葡萄糖，使這部分的氨基酸進(jìn)入乳腺組織用來合成乳蛋白。也有研究表明，葡萄糖代謝的中間產(chǎn)物能夠合成非必需氨基酸用來合成乳蛋白[4]。與此同時，葡萄糖還能夠作為信號物質(zhì)通過單磷酸腺苷活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)信號通路調(diào)控乳蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。已有研究表明，當(dāng)葡萄糖缺乏時，AMPK會被激活，從而抑制mTOR信號通路阻礙蛋白質(zhì)翻譯[5-6]。體外培養(yǎng)BMECs也發(fā)現(xiàn)，AMPK能夠通過磷酸化抑制mTOR的活化，從而減少酪蛋白的合成[7]。

泌乳相關(guān)激素與乳蛋白的合成存在緊密的聯(lián)系。武雪會等[8]研究表明，不同乳產(chǎn)量和乳成分的泌乳奶牛，其血清中泌乳相關(guān)激素的水平具有差異性。有研究發(fā)現(xiàn)，在BMECs培養(yǎng)基中添加催乳素(PRL)、雌激素(E)、胰島素和氫化可的松等能夠提高乳蛋白的合成量[9]。酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子5(JAK2/STAT5)信號通路具有介導(dǎo)細(xì)胞外激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，泌乳相關(guān)激素與各自受體結(jié)合后能夠激活JAK2信號通路?；罨腏AK2能夠使其下游的STAT5發(fā)生磷酸化。磷酸化后STAT5到細(xì)胞核內(nèi)與其靶基因結(jié)合，然后調(diào)控酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[10]。mTOR具有mTORC1和mTORC2 2個功能結(jié)構(gòu)不同的復(fù)合物[11]，mTORC1能夠被生長激素、營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞能量狀態(tài)激活[12]。催乳素對調(diào)控乳蛋白合成的研究大致分為2個方向：第1個方向是催乳素與催乳素受體(PRLR)結(jié)合后，核蛋白體的RNA增加，從而加快酪蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終酪蛋白的量也隨之增加[13]。第2個方向是催乳素通過磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)途徑的磷酸化調(diào)控酪蛋白的翻譯。此外，催乳素還能通過JAK2/STAT5信號通路，促進(jìn)乳蛋白相關(guān)基因的表達(dá)[14]。雌激素促進(jìn)酪蛋白合成的途徑有2種：一種是刺激其他激素的分泌，另一種是通過激活雌激素受體表達(dá)，刺激乳蛋白合成相關(guān)信號通路的激活進(jìn)而促進(jìn)酪蛋白的合成[15]。

近年來，體外研究營養(yǎng)素和內(nèi)分泌激素調(diào)控牛乳成分的合成是泌乳生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，目前關(guān)于乳蛋白前體物以及泌乳相關(guān)激素調(diào)控乳蛋白合成的研究較多，然而，對于營養(yǎng)素和激素之間的相互作用研究較少且不深入[16]。因此，本研究在體外培養(yǎng)模式下研究了組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs酪蛋白合成的影響并通過JAK2/STAT5和AMPK/mTOR信號通路探討其作用機(jī)制，旨在為調(diào)控乳蛋白合成提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核糖體p70s6激酶(S6K,2708)、磷酸化S6K(97596)、單磷酸腺苷活化蛋白激酶α(AMPKα,5831)、磷酸化AMPKα(2535)和β-肌動蛋白(β-actin,4970)抗體購自CST公司；mTOR抗體(ab2732)、磷酸化mTOR抗體(ab84400)和酪蛋白抗體(ab166596)購自ABCAM公司；催乳素(cyt-240)購自PROSPEC公司；胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA,25200054)、膠原酶Ⅱ(17101-015)、雌激素(E2758)、青-鏈霉素(15140-122)、表皮生長因子(E4127)和氫化可的松(H0135)購自SIGMA公司；反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Prime ScriptTMRT Reagent Kit)、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒和總RNA提取試劑盒(RNA Iso-Plus)購自TaKaRa公司；DMEM無糖培養(yǎng)基(A1443001)、葡萄糖(A2494001)和DMEM/F12(12491-015)購自GIBCO公司；BCA試劑盒(PC0020)、細(xì)胞裂解液(R0020)和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)制膠試劑盒(P1200-1)購自SOLARBIO公司；胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(41400045)購自CHEMBASE公司；二甲基亞砜(0231)和四甲基偶氮唑鹽(MTT,298-93-1)購自AMRESCO公司；電泳液(P0014B)、轉(zhuǎn)膜液(P0021B)和封閉液(P0228)購自北京碧云天科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，SH30256.01)和胎牛血清(FBS，SH30084.03)購自HYCLONE公司；75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(430720)購自CORNING公司。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用L9(34)正交設(shè)計。使用饑餓培養(yǎng)基(無血清、激素及葡萄糖)饑餓BMECs 16 h，然后更換組合添加了濃度不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Ⅰ組為對照組，不添加葡萄糖和泌乳相關(guān)激素，Ⅱ組添加14.0 mmol/L葡萄糖+200 ng/mL雌激素，Ⅲ組添加17.5 mmol/L 葡萄糖+100 ng/mL雌激素，Ⅳ組添加14.0 mmol/L葡萄糖+100 ng/mL催乳素；Ⅴ組添加17.5 mmol/L葡萄糖+200 ng/mL催乳素，Ⅵ組添加100 ng/mL雌激素+100 ng/mL催乳素，Ⅶ組添加200 ng/mL雌激素+200 ng/mL催乳素，Ⅷ組添加14.0 mmol/L葡萄糖+100 ng/mL雌激素+200 ng/mL催乳素，Ⅸ組添加17.5 mmol/L葡萄糖+200 ng/mL雌激素+100 ng/mL催乳素)繼續(xù)培養(yǎng)24 h(本研究組合添加葡萄糖和激素的濃度設(shè)置參考本課題組[15，17]以及前人的研究[18]結(jié)果)，每組設(shè)置6個重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 BMECs的分離與純化

從屠宰場采集健康泌乳的奶牛乳腺組織，分離培養(yǎng)BMECs。用手術(shù)刀將最外層的乳腺組織剝離，避開乳導(dǎo)管、血管及結(jié)締組織等部位，剪取適宜大小的組織塊放入3×雙抗PBS中，轉(zhuǎn)入超凈臺。將組織塊用3×雙抗PBS清洗2次，用75%酒精浸泡60 s，最后用1×雙抗PBS清洗3次。使用滅菌的眼科手術(shù)剪剪取富含腺泡的乳腺樣品放入小瓶中，在小瓶中將組織塊反復(fù)剪碎，直至看不到明顯塊狀為宜，再加3 mL的膠原酶Ⅱ，確?；旌贤耆蠓诺脚囵B(yǎng)箱中進(jìn)行消化，計時80 min，每隔20 min取出離心管上下顛倒。待消化結(jié)束后，將樣品用無菌濾網(wǎng)過濾、離心(1 280×g)8 min后，將細(xì)胞懸浮于生長培養(yǎng)基進(jìn)行37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長到約為瓶底面積80%時，倒掉培養(yǎng)液，每瓶加入5 mL 0.25%的胰酶-EDTA消化細(xì)胞。利用BMECs和成纖維上皮細(xì)胞對胰酶敏感性不同對細(xì)胞進(jìn)行純化。胰酶作用-EDTA消化大約30 s后，成纖維上皮細(xì)胞便會脫離下來，棄去混合液，再加入5 mL胰酶-EDTA消化1 min，加入終止培養(yǎng)基終止消化，使用細(xì)胞刮刀將BMECs全部刮下，移至離心管中離心(1 280×g，8 min)，之后用PBS清洗細(xì)胞。最后，收集細(xì)胞用生長培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2次能夠純化完全。

1.3.2 BMECs的鑒定

將無菌的細(xì)胞爬片放入6 cm的培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長至80%匯合時，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，使用4%多聚甲醛在室溫下固定30 min后，再用0.2% TritonX-100處理細(xì)胞10 min，增加細(xì)胞通透性。之后用PBS清洗3次，每次5 min。用含1%明膠的PBS室溫孵育細(xì)胞爬片30 min后加入鼠抗人角蛋白18單一抗抗體(1∶50稀釋)室溫振蕩孵育1 h，孵育結(jié)束后回收一抗，加PBS振蕩清洗3次，每次5 min。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗抗體(1∶50稀釋)在搖床上振蕩30 min，振蕩結(jié)束后回收抗體，加入PBS清洗3次，每次5 min。在倒置相差熒光顯微鏡下觀察拍照。如果待鑒定細(xì)胞中含有CK-18角蛋白，那么FITC標(biāo)記的二抗和一抗特異性結(jié)合后CK-18會呈現(xiàn)熒光綠色。

1.3.3 BMECs活力的檢測

將第2代BMECs按照密度為1×104個/孔的細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入200 μL生長培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待細(xì)胞生長培養(yǎng)瓶底部80%以上時，饑餓BMECs 16 h，之后更換組合添加了不同濃度的葡萄糖、雌激素和催乳素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在細(xì)胞培養(yǎng)至20和24 h時分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL和二甲基亞砜100 μL，置于搖床振蕩10 min。使用全自動酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長下的吸光度(OD)值。細(xì)胞相對增殖率(RGR)計算公式如下：

細(xì)胞相對增殖率(%)=100×試驗組
OD490 nm/對照組OD490 nm。

1.3.4 BMECs中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體、激素受體、酪蛋白合成相關(guān)基因、AMPK/mTOR信號通路及JAK2/STAT5信號通路相關(guān)基因表達(dá)的檢測

將第2代BMECs以8×105個/瓶的密度接種于培養(yǎng)瓶中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待細(xì)胞生長培養(yǎng)瓶底部80%以上時，饑餓BMECs 16 h，更換組合添加了不同濃度葡萄糖、雌激素和催乳素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，每管加入400 μL RNA裂解液，提取總RNA并測定其濃度及OD260 nm/OD280 nm，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。本試驗以泛素表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子(UXT)、β-肌動蛋白和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，檢測葡萄糖轉(zhuǎn)運載體、激素受體、酪蛋白合成相關(guān)基因、AMPK/mTOR信號通路及JAK2/STAT5信號通路相關(guān)基因的相對表達(dá)量。內(nèi)參的Ct值為3個內(nèi)參基因Ct值的平均值，RT-qPCR試驗結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量數(shù)據(jù)分析。根據(jù)SYBR Premix Dimer EraserTM試劑盒中的說明書對目的基因進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，各基因的擴(kuò)增條件為：95 ℃，30 s，1個循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，35個循環(huán)；95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，95 ℃，30 s，1個循環(huán)。引物序列及參數(shù)見表1。

表1 引物序列及參數(shù)

1Gene namesGenBankGenBank accession No.Primer sequences(5′—3′)Length/bpTm/℃4E14EBP1BC120290.1F:GAACTAACCTGTGACCAAGAR:CTCAACTGTGACTCTTCACC302604EeIF4ENM_174310.3F:GAAGACTTTTGGGCTCTGTACR:CAGCTCCACATACATCATCAC8260p70s6S6K1DN_544771F:CAAGCTTGCATGCTAATTTGTCCCR:TTGAGTCCTAGATCATGTCGAAGA101602JAK2XM_005209981.4.103F:CAAGACCAGATGGATGCCCAGR:ACTCGAACTGCTAGGTCTCTGA101605STAT5NM_001012673F:TGTGGAGTTTGAGGTGAAGCR:ATTATCAAAGAAGGGCTGCAC20360

1.3.5 酪蛋白表達(dá)及mTOR信號通路蛋白磷酸化水平的檢測

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，收集BMECs，加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(含1%的苯甲基磺酰氟)于冰上裂解30 min，然后離心(8 000×g)5 min，取上清檢測蛋白濃度。蛋白樣品稀釋、變性后采用Western blot法[12]測定α-酪蛋白、mTOR、S6K和AMPK蛋白表達(dá)量及其磷酸化水平。結(jié)果采用Image StudioVer 5.2軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2020進(jìn)行計算和整理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行ANOVA分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMECs鑒定

由圖1可知，BMECs大多數(shù)為卵圓形，細(xì)胞之間連成片，呈鵝卵石樣單層生長。由圖2可知，采用熒光免疫染色法對BMECs進(jìn)行鑒定，BMECs骨架蛋白CK-18表達(dá)呈陽性，說明本試驗分離培養(yǎng)的細(xì)胞是BMECs。

2.2 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs增殖率的影響

由圖3可知，與對照組相比，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組顯著提高了BMECs的增殖率(P<0.05)；Ⅷ和Ⅸ組BMECs的增殖率顯著高于其他各試驗組(P<0.05)；Ⅳ組BMECs的增殖率顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)；Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ組BMECs的增殖率顯著高于Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)。

圖1 純化后的BMECs

圖2 BMECs免疫熒光鑒定

2.3 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達(dá)的影響

由圖4可知，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組BMECs中GLUT1基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ組BMECs中GLUT8基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，Ⅵ和Ⅶ組BMECs中GLUT1基因相對表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)，Ⅵ組BMECs中GLUT8基因相對表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組BMECs中GLUT1和GLUT8基因相對表達(dá)量顯著高于除了Ⅸ組外的其他組(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ和Ⅸ組GLUT1基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，而與Ⅴ組無顯著差異(P>0.05)。Ⅷ和Ⅸ組BMECs中GLUT12基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，其他試驗組BMECs中GLUT12基因相對表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組BMECs中GLUT12基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。

2.4 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs激素受體基因表達(dá)的影響

由圖5可知，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組BMECs中ER-α基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅵ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ和Ⅸ組ER-α的基因相對表達(dá)量顯著高于其他試驗組(P<0.05)。Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組BMECs中ER-β和PRLR基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組ER-β基因相對表達(dá)量顯著高于除Ⅸ組外的其他試驗組(P<0.05)，Ⅳ、Ⅶ和Ⅸ組ER-β基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅳ和Ⅵ組(P<0.05)，Ⅷ和Ⅸ組PRLR基因相對表達(dá)量顯著高于其他試驗組(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組BMECs中GPER30基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅳ、Ⅴ組與對照組間無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組BMECs中GPER30基因相對表達(dá)量顯著高于其他試驗組，Ⅶ和Ⅸ組GPER30基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖4 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達(dá)的影響

2.5 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs酪蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖6可知，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組CSN1S1基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ和Ⅸ組CSN1S1基因相對表達(dá)量顯著高于其他試驗組(P<0.05)。Ⅸ組CSN2基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，Ⅷ和Ⅸ組CSN2基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組CSN2基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ組(P<0.05)。Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組CSN3基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組CSN3基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅸ組(P<0.05)。

圖5 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs激素受體基因表達(dá)的影響

圖6 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs酪蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.6 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖7可知，Ⅵ和Ⅶ組AMPK基因相對表達(dá)量顯著高于對照組及其他試驗組(P<0.05)，其他試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組AMPK基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅷ和Ⅸ組(P<0.05)。Ⅵ和Ⅶ組PI3K基因相對表達(dá)量顯著低于對照組和其他試驗組(P<0.05)，其他各試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅲ組PI3K基因相對表達(dá)量顯著低于Ⅷ組(P<0.05)。Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組AKT基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和其他試驗組(P<0.05)，其他試驗組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ和Ⅸ組AKT基因相對表達(dá)量顯著高于其他試驗組(P<0.05)，Ⅷ組AKT基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組mTOR基因相對表達(dá)量顯著高于對照組及Ⅳ和Ⅵ組(P<0.05)，Ⅳ和Ⅵ組mTOR基因相對表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)；試驗Ⅷ組mTOR基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅸ組(P<0.05)。各試驗組4EBP1基因相對表達(dá)量與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅵ和Ⅶ組4EBP1基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅴ和Ⅸ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ組4EBP1基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；Ⅲ、Ⅷ和Ⅸ組eIF4E基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和其他試驗組(P<0.05)，其他各試驗組和對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ組eIF4E基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅲ和Ⅸ組(P<0.05)，Ⅲ、Ⅸ組eIF4E基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ和Ⅸ組S6K1基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，對照組和Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組S6K1基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ和Ⅸ組S6K1基因相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

圖7 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs mTOR信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.7 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs JAK2/STAT5信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖8可知，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組JAK2基因相對表達(dá)量顯著高于對照組和Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ組與對照組無顯著差異(P>0.05)；Ⅷ和Ⅸ組JAK2基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅳ和Ⅴ組(P<0.05)，Ⅷ組JAK2基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組STAT5基因相對表達(dá)量顯著高于對照組及其他各試驗組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ組與對照組差異不顯著(P>0.05)，Ⅷ和Ⅸ組STAT5基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅴ組(P<0.05)，Ⅷ組STAT5基因相對表達(dá)量顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。

圖8 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs JAK2/STAT5信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.8 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs酪蛋白表達(dá)及mTOR信號通路蛋白磷酸化水平的影響

由圖9可知，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ組AMPK磷酸化水平顯著低于對照組(P<0.05)，Ⅶ組AMPK磷酸化水平與對照組顯著不差異(P>0.05)。試驗組間比較，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組AMPK磷酸化水平顯著低于Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)。

圖9 BMECs中AMPK磷酸化水平

由圖10可知，與對照組相比，各試驗組均顯著提高了mTOR磷酸化水平(P<0.05)，其中，Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組mTOR磷酸化水平顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ組(P<0.05)，Ⅷ組mTOR磷酸化水平顯著高于其他試驗組(P<0.05)。

圖10 BMECs中mTOR磷酸化水平

由圖11可知，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組S6K磷酸化水平顯著高于對照組(P<0.05)，Ⅱ組S6K磷酸化水平與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。試驗組間比較，Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組S6K磷酸化水平顯著高于其他試驗組(P<0.05)，Ⅷ組S6K磷酸化水平顯著高于Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅸ組(P<0.05)，Ⅳ、Ⅴ和Ⅸ組S6K磷酸化水平顯著高于Ⅶ組(P<0.05)。

由圖12可知，與對照組相比，各試驗組均顯著提高了α-酪蛋白表達(dá)量(P<0.05)。試驗組間比較，Ⅷ和Ⅸ組α-酪蛋白表達(dá)量顯著高于其他試驗組(P<0.05)，Ⅷ組α-酪蛋白表達(dá)量顯著高于Ⅸ組(P<0.05)。

圖11 BMECs中S6K磷酸化水平

圖12 BMECs中α-酪蛋白表達(dá)量

3 討 論

3.1 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs增殖率的影響

BMECs的數(shù)量和代謝活力決定乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)，而BMECs的數(shù)量主要取決于細(xì)胞的增殖和凋亡之間的平衡[19]。前人研究表明，在BMECs培養(yǎng)基中單獨添加葡萄糖、催乳素、雌激素和氨基酸均能夠促進(jìn)BMECs的增殖[12,20-25]。近年來有些研究表明，激素之間具有相互作用，外源添加雌激素和催乳素的協(xié)同作用能夠提高大鼠和小鼠乳腺上皮細(xì)胞的增殖率[26]。切除大鼠卵巢后，使用外源的雌激素和催乳素處理大鼠，5 d后發(fā)現(xiàn)大鼠的乳腺上皮細(xì)胞增殖率在2種激素單獨處理的細(xì)胞增殖率之間[27]，田青等[28]試驗還研究發(fā)現(xiàn)，胰島素、催乳素和氫化可的松組合添加能夠提高BMECs的增殖率。金亞亞等[29]試驗表明，組合添加100 ng/mL雌激素和200 ng/mL催乳素對BMECs的增殖率促進(jìn)效果最佳。本試驗研究結(jié)果表明，葡萄糖、雌激素和催乳素組合添加的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組顯著提高了BMECs的增殖率；葡萄糖和催乳素組合添加量分別為14.0 mmol/L和100 ng/mL時BMECs的增殖率顯著高于組合添加量為17.5 mmol/L和200 ng/mL；并且在葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時促進(jìn)效果最好，原因可能是PI3K/AKT/mTOR信號通路在哺乳動物體內(nèi)中主要與細(xì)胞生長和增殖有關(guān)，組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素后，一方面葡萄糖促進(jìn)細(xì)胞能量生成，為細(xì)胞生長提供充足的能量供應(yīng)，另一方面雌激素和催乳素通過與其受體結(jié)合，活化了PI3K，并進(jìn)一步促進(jìn)AKT的磷酸化，活化的AKT直接磷酸化mTOR，從而促進(jìn)了細(xì)胞增殖。在新近的研究中，人們逐漸認(rèn)識到一種膜性的雌激素受體，被定義為GPER30，又稱HPR30[30-32]。Filardo等[33]發(fā)現(xiàn)，GPER30在乳腺中有較強(qiáng)的表達(dá)。楊振山[34]研究表明，雌激素通過GPER30基因的表達(dá)促進(jìn)山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖。本試驗研究結(jié)果表明，葡萄糖、雌激素和催乳素組合添加的Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組均提高了BMECs中GPER30基因相對表達(dá)量，原因可能是雌激素上調(diào)了GPER30的表達(dá)，并使AKT/mTOR通路活性增加，從而促進(jìn)BMECs增殖。

前人研究發(fā)現(xiàn)，GLUTs的基因相對表達(dá)量受到奶牛生理階段的影響，干奶期的奶牛乳腺組織中GLUT1的基因和蛋白的表達(dá)量顯著低于泌乳期[35]，并且Zhao等[36]研究結(jié)果表明，在奶牛產(chǎn)犢前的40 d到產(chǎn)犢后的7 d內(nèi)，奶牛乳腺組織中GLUTs基因表達(dá)量能夠增加到上百倍，其原因可能是奶牛在不同生理階段乳腺組織對葡萄糖的攝取受到泌乳相關(guān)激素及機(jī)體器官等調(diào)控的結(jié)果。體外研究證明，泌乳期奶牛乳腺組織對葡萄糖的攝取依靠的是BMECs膜上的GLUTs[37]。本試驗與前人研究結(jié)果相近，葡萄糖、雌激素和催乳素組合添加的Ⅷ和Ⅸ組提高了BMECs中GLUT1、GLUT8和GLUT12基因相對表達(dá)量，且葡萄糖和雌激素組合添加量為17.5 mmol/L和100 ng/mL時BMECs中GLUT1和GLUT8基因相對表達(dá)量顯著高于組合添加量為14.0 mmol/L和200 ng/mL時；在葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時促進(jìn)效果最好，與BMECs增殖率的結(jié)果相一致?？赡苁瞧咸烟?、雌激素和催乳素組合添加通過增加了GLUT1、GLUT8和GLUT12在BMECs中的基因相對表達(dá)量，促進(jìn)乳腺組織對葡萄糖的攝取，從而提高了BMECs的增殖率。

3.2 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素通過JAK-STAT信號通路影響B(tài)MECs酪蛋白的合成

JAK是一類酪氨酸激酶家族，JAKs家族中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)TYK2、JAK1、JAK2和JAK3 4個成員，其中在乳腺組織中檢測到了JAK2的表達(dá)。STAT是JAK的作用底物，在泌乳動物乳腺中發(fā)現(xiàn)了STAT蛋白，并且STAT5是STATs中首個被認(rèn)為是乳腺組織中十分重要的信號通路成員，它在BMECs增殖、分化和泌乳方面起到必不可少的作用。有研究表明，催乳素能夠激活JAK/STAT通路，與膜上受體結(jié)合促進(jìn)BMECs乳蛋白的合成[38]。Yonekura等[39]研究表明，JAK/STAT通路相關(guān)蛋白受到PRLR的調(diào)控，通過激活JAK/STAT途徑，催乳素與受體結(jié)合促進(jìn)BMECs乳蛋白的合成。

有研究表明，通過給奶牛飼喂大豆黃酮(植物類雌激素)時發(fā)現(xiàn)，大豆黃酮可以顯著提高乳蛋白的含量[40-43]。武開樂等[42]體內(nèi)試驗研究表明，添加外源性雌激素能夠顯著提高α-酪蛋白的表達(dá)量，且外源性雌激素對β-酪蛋白的表達(dá)也有顯著的促進(jìn)效果。本試驗與前人研究結(jié)果相一致，葡萄糖、雌激素和催乳素組合添加的試驗組均提高了BMECs中酪蛋白基因相對表達(dá)量和酪蛋白表達(dá)量，并且在葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時酪蛋白基因相對表達(dá)量和酪蛋白表達(dá)量高于其他試驗組，其原因可能是酪蛋白受到雌激素和催乳素的調(diào)控[43-44]，通過激活JAK/STAT通路，促進(jìn)BMECs乳蛋白的合成[45]。雌激素有3個受體由不同的基因編碼，分別為ER-α、ER-β和GPER30。ER-α的功能是調(diào)節(jié)乳導(dǎo)管生長和形態(tài)的形成，ER-β的功能是保護(hù)細(xì)胞，抑制細(xì)胞不受控的增殖，GPER30的功能是促進(jìn)BMECs增殖。本試驗的結(jié)果表明，葡萄糖、雌激素和催乳素組合添加的Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ組提高了BMECs中ER-α、ER-β、PRLR和GPER30基因相對表達(dá)量、酪蛋白基因表達(dá)量和酪蛋白表達(dá)量，并且在葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時提高效果最好,原因可能是此濃度下葡萄糖、催乳素和雌激素能夠很好的互作，一是催乳素增加了雌激素的活性，激活JAK/STAT信號通路，二是當(dāng)有催乳素時，催乳素會與2個PRLR結(jié)合形成復(fù)合物，JAK2被激活，從而導(dǎo)致PRLR上的酪氨酸殘基磷酸化，之后2個STAT5蛋白通過SH2功能域結(jié)合，STAT5的酪氨酸殘基被磷酸化后從復(fù)合物中脫離，2個STAT5蛋白通過各自磷酸化的酪氨酸和對方的SH2功能域結(jié)合，形成STAT5二聚體，最后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與啟動子上的熒光素酶報告基因載體(GAS)序列結(jié)合，激活酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[46]，進(jìn)而促進(jìn)乳蛋白的生成。

3.3 組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素對BMECs AMPK/mTOR信號通路合成酪蛋白的影響

mTOR是非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因為其處于調(diào)節(jié)生長的中心而受到了廣大學(xué)者們的研究[47]。在BMECs合成乳蛋白的過程中，mTOR的上游主要由磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(LKB1)/AMPK/mTOR和PI3K/AKT/mTOR信號通路調(diào)控，下游主要由mTOR/4EBP1和mTOR/S6K信號通路的調(diào)控。在泌乳動物乳腺細(xì)胞中，調(diào)控mTOR活性的信號物質(zhì)主要包括ATP的活化、生長因子和氨基酸，PI3K/AKT/mTOR信號通路與細(xì)胞的生長和增殖的關(guān)系十分密切。缺陷AMPK的小鼠會出現(xiàn)葡萄糖耐受異常和胰島素抵抗的現(xiàn)象[48]，這表明AMPK的作用主要是作為葡萄糖的感受器。試驗研究表明，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白能夠刺激雌激素和催乳素的表達(dá)，并通過AMPK/mTOR信號通路在翻譯水平上促進(jìn)酪蛋白的合成[49]。

泌乳動物的乳腺是個耗能多的組織，尤其在乳蛋白合成的過程中要消耗大量的葡萄糖。體內(nèi)試驗研究表明，高產(chǎn)奶牛乳腺組織每天能夠消耗掉2 kg的葡萄糖，占奶牛乳腺組織內(nèi)葡萄糖總量的80%以上[50]。泌乳奶牛瘤胃灌注葡萄糖能夠提高乳蛋白產(chǎn)量[43-44，51]，在體外培養(yǎng)BMECs的試驗中表明，添加外源葡萄糖能夠增加乳蛋白合成率[52]。本試驗研究結(jié)果與前人相一致，BMECs培養(yǎng)基中添加葡萄糖時，能夠增加酪蛋白基因相對表達(dá)和酪蛋白表達(dá)，原因可能是葡萄糖為酪蛋白合成提供了能量，還作為信號物質(zhì)通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控乳蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。

對于2條下游的通路，mTOR/S6K通路中S6K是細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成的正調(diào)控信號，在胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運翻譯過程中起關(guān)鍵作用。研究表明，葡萄糖和激素之間存在著協(xié)同作用，雌激素對葡萄糖能量代謝系統(tǒng)的調(diào)控，能夠直接或者間接影響相關(guān)蛋白的表達(dá)[53]，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白能夠促進(jìn)催乳素和雌激素的表達(dá)，通過mTOR信號通路在翻譯水平上促進(jìn)酪蛋白的生成[49]。激素還能夠協(xié)同調(diào)控乳腺的發(fā)育以及乳成分的合成，催乳素和糖皮質(zhì)激素在分娩前后分泌增加從而調(diào)節(jié)β-酪蛋白的表達(dá)[54]。這說明營養(yǎng)素和泌乳相關(guān)激素組合添加對乳蛋白合成具有互作效應(yīng)，并通過mTOR通路調(diào)控乳蛋白的合成。本試驗研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，Ⅷ組BMECs中CSN1S1和CSN3基因相對表達(dá)量高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組，原因可能是催乳素的添加提高了mTOR底物S6K1和4EBP1基因相對表達(dá)量及其磷酸化水平，進(jìn)而刺激乳蛋白的合成；Ⅵ和Ⅶ組的AMPK磷酸化水平顯著高于其他試驗組，原因可能是當(dāng)營養(yǎng)不足，能量缺乏時胞內(nèi)ATP/ADP比值降低，AMPK被激活；Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組的mTOR磷酸化水平顯著高于其他試驗組；Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ組的酪蛋白表達(dá)量顯著高于其他試驗組；葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時,CSN1S1、CSN2和CSN3基因相對表達(dá)量高于其他試驗組；PI3K、AKT、mTOR、eIF4E和S6K1基因相對表達(dá)量高于其他試驗組；BMECs酪蛋白的蛋白表達(dá)以及mTOR磷酸化水平的表達(dá)均顯著高于對照組和其他試驗組；這表明葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL是促進(jìn)BMEC酪蛋白合成的最佳比例，荷斯坦奶牛體內(nèi)葡萄糖、雌激素和催乳素正常濃度分別為4 mmol/L、640 pg/mL和27 ng/mL，可能是由于三者在該比例下在分子水平上產(chǎn)生了相互促進(jìn)的作用，能最大程度地激活mTOR信號通路，進(jìn)而促進(jìn)了酪蛋白的基因和蛋白表達(dá)。

4 結(jié) 論

各試驗組均在不同程度上促進(jìn)了BMECs的增殖率并且Ⅷ和Ⅸ組BMECs相對增殖率顯著高于其他試驗組，且Ⅷ組(葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL)的效果最佳；組合添加葡萄糖、雌激素和催乳素的添加量分別為14.0 mmol/L、100 ng/mL和200 ng/mL時對BMECs酪蛋白合成的促進(jìn)效果最佳；葡萄糖和催乳素組合添加對酪蛋白合成的影響最大。