耐堿性蛋白A色譜配基的構(gòu)建及性能評價

管志龍，白姝，孫彥，史清洪

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耐堿性蛋白A色譜配基的構(gòu)建及性能評價

管志龍，白姝，孫彥，史清洪

（系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072）

提出了優(yōu)化分子內(nèi)作用力提高蛋白A（SpA）的結(jié)構(gòu)域Z分子穩(wěn)定性的方法，構(gòu)建了突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?。圓二色光譜分析結(jié)果表明，突變結(jié)構(gòu)域具有與結(jié)構(gòu)域Z一致的特征峰，但突變結(jié)構(gòu)域Z?中α-螺旋含量明顯高于突變結(jié)構(gòu)域Z?。在pH 6.0下，突變結(jié)構(gòu)域Z?的熱轉(zhuǎn)變溫度（m）較結(jié)構(gòu)域Z提高了3.9℃，而突變結(jié)構(gòu)域Z?的T值僅提高了1.6℃。這表明，突變結(jié)構(gòu)域Z?中第12位引入疏水性更大的Ile殘基提高了結(jié)構(gòu)域分子的穩(wěn)定性。色譜介質(zhì)耐堿性實驗結(jié)果表明，突變結(jié)構(gòu)域Z?具有更好的耐堿性，其耐堿性在突變結(jié)構(gòu)域Z?四串聯(lián)體融合蛋白中得到了進(jìn)一步提升。研究工作為SpA色譜配基的分子改造提供了新思路。

抗體；吸附；熱力學(xué)；蛋白A色譜；示差掃描量熱；圓二色光譜；耐堿性

引 言

蛋白A（protein A，SpA）是一種來自金黃色葡萄球菌表面的膜蛋白，包含5個可與抗體特異性結(jié)合且高度同源串聯(lián)結(jié)構(gòu)域（依次為E、D、A、B和C）。SpA色譜是當(dāng)前抗體藥物制備的核心技術(shù)，一直被業(yè)界視為單克隆抗體提取單元操作的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1-3]。這一技術(shù)成功的基礎(chǔ)在于持續(xù)提升的SpA色譜介質(zhì)性能[4-5]。自首個商品化SpA色譜介質(zhì)1978年問世后的若干年中[6]，SpA色譜介質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性曾一度飽受詬病。這種狀況直到Nilsson等[7]構(gòu)建了突變結(jié)構(gòu)域B（G29A）后才得以緩解。這種突變結(jié)構(gòu)域被命名為結(jié)構(gòu)域Z，其通過消除Asn-Gly結(jié)構(gòu)的去酰胺化效應(yīng)使SpA的化學(xué)穩(wěn)定性得以明顯改善。此后，一大批以MabSelect SuRe和ProSep vA Ultra等為代表基于結(jié)構(gòu)域Z的新型SpA色譜介質(zhì)不斷地涌現(xiàn)[8-10]。

當(dāng)前除MabSelect SuRe以外的絕大多數(shù)商品化SpA色譜介質(zhì)仍無法耐受苛刻的標(biāo)準(zhǔn)原位清洗（CIP）溶液（0.5 mol·L-1NaOH溶液）。因此，需要采用折中（0.05～0.1 mol·L-1NaOH溶液）或替代（6 mol·L-1鹽酸胍溶液，pH約4.0）方法實現(xiàn)CIP操作[10]。針對上述問題，Linhult等[11]通過基因突變逐一替代結(jié)構(gòu)域Z中Asn殘基的方法研究了其對結(jié)構(gòu)域堿液耐受性的影響。結(jié)果顯示，N23T突變顯著提高了結(jié)構(gòu)域的堿液耐受性。以突變結(jié)構(gòu)域Z（F30A，N23T）為配基的SpA色譜介質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液中連續(xù)浸泡7.5 h后仍保持了70%以上的抗體結(jié)合能力；而同樣處理后的結(jié)構(gòu)域Z（F30A）的抗體結(jié)合能力僅剩25%。N23T突變對結(jié)構(gòu)域Z化學(xué)穩(wěn)定性的影響也得到了Xia等[12]的驗證。Asn殘基對化學(xué)穩(wěn)定性影響也見于蛋白G（Streptococcal protein G，SpG）結(jié)構(gòu)域C2的報道中[13]。研究發(fā)現(xiàn)，N7A和N36A雙突變的結(jié)構(gòu)域C2在堿液中最為穩(wěn)定。另外，Minakuchi等[14]發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域C的G29W和G29Y兩種突變體具有比G29A突變體更好的化學(xué)穩(wěn)定性。Palmer等[15]通過自由能隨pH變化的比較發(fā)現(xiàn)，Lys、Arg和Tyr側(cè)鏈基團(tuán)的去質(zhì)子化導(dǎo)致了SpG在堿性溶液中穩(wěn)定性降低。這種SpG蛋白中表面電荷影響穩(wěn)定性的討論為改善SpA配基的穩(wěn)定性提供了另一思路。

在前人工作基礎(chǔ)上[16]，本文提出了通過優(yōu)化分子內(nèi)作用力提高結(jié)構(gòu)域Z分子整體穩(wěn)定性的方法，其是通過對結(jié)構(gòu)域Z非關(guān)鍵氨基酸殘基中去酰胺化效應(yīng)的消除（N11T和N23T）和疏水性相互作用的強(qiáng)化（A12I和Q32T）兩種途徑實現(xiàn)的?；谏鲜鏊悸?，本文構(gòu)建了兩種突變結(jié)構(gòu)域，分別命名為Z?和Z?（如圖1所示）。借助于圓二色（CD）光譜、示差掃描量熱（DSC）分析和抗體吸附實驗，系統(tǒng)地比較了結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的分子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及抗體結(jié)合能力；進(jìn)而構(gòu)建了結(jié)構(gòu)域Z和Z?四串聯(lián)體融合蛋白Z4和Z?4，實現(xiàn)了SpA色譜配基堿液耐受性的進(jìn)一步提升。本研究工作為SpA色譜配基的分子改造提供了新思路。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

結(jié)構(gòu)域Z及突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成。含有融合蛋白Z4和Z?4的表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-Z4和pET-30a(+)- Z?4由生工生物工程（上海）有限公司構(gòu)建并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）大腸桿菌中表達(dá)。Q Sepharose FF和Sepharose FF凝膠購自通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國）有限公司。實驗用的抗體、1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）和縮水甘油醚三甲基氯化銨（GTMAC）為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，購自天津博瑞星科技有限公司。蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)品Blue Plus Protein Maker (14×103～100×103)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物為英國Oxoid公司產(chǎn)品，其和其他化學(xué)試劑均購自當(dāng)?shù)?，化學(xué)試劑除特殊說明外均為分析純試劑。

1.2 圓二色光譜分析

結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的CD光譜分析采用JASCO J-180圓二色光譜儀在0.15 mg·ml-1濃度和1 mm光程條件下完成。樣品緩沖液為含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS溶液（pH 6.0）。CD光譜采用連續(xù)掃描模式，掃描速度為50 nm·min-1，掃描波長范圍為250～190 nm，每個樣品重復(fù)掃描3次。分析中以樣品緩沖液為參照扣除背景干擾。

1.3 示差掃描量熱分析

結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的DSC分析采用MicroCal VP-DSC示差掃描量熱儀（GE Healthcare, PA, USA）在1.0 mg·ml-1濃度下完成。樣品分別溶解于含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS溶液（pH 6.0）和0.1 mol·L-1NaOH溶液中。DSC的溫度掃描范圍為25～110℃，升溫速率為1℃·min-1。實驗數(shù)據(jù)采用MicroCal Origin軟件的MN2State模型進(jìn)行擬合，得到熱變性溫度m。

1.4 蛋白表達(dá)與純化

含表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-Z4和pET-30a(+)-Z?4的BL21（DE3）大腸桿菌在37℃下于LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)后，挑選單菌落置于10 ml含30 μg·ml-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜作為種子液。種子液按照1:100（體積比）接種于200 ml LB液體培養(yǎng)基（卡那霉素的終濃度為30 μg·ml-1）。上述菌液在37℃培養(yǎng)后加入終濃度為0.5 mmol·L-1IPTG；含pET-30a(+)-Z4的BL21（DE3）大腸桿菌在37℃下誘導(dǎo)6 h后收集菌體；pET-30a(+)-Z?4的BL21（DE3）大腸桿菌在20℃下誘導(dǎo)過夜后收集菌體。收集的菌體復(fù)懸于20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）后，于冰浴中超聲破碎。細(xì)胞破碎液于12000 r·min-1下離心收集上清液。

上清液經(jīng)0.45 μm針頭濾器過濾后采用Q Sepharose FF離子交換色譜柱純化得到目標(biāo)蛋白，其步驟如下：填充于XK 16/26色譜柱中的Q Sepharose FF經(jīng)20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）平衡至少5CV后，連續(xù)輸入上清液直至穿透。目標(biāo)蛋白收集以含1 mol·L-1NaCl的20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）為洗脫液，通過1%洗脫液/min的線性梯度洗脫分步回收。目標(biāo)蛋白經(jīng)透析和凍干后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SpA色譜介質(zhì)合成

通過結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?以及融合蛋白Z4和Z?4分別偶聯(lián)于Sepharose FF合成5種SpA色譜介質(zhì)，步驟簡述如下：將經(jīng)去離子水反復(fù)清洗并抽干的凝膠Sepharose FF（10 g）加入到裝有75%（質(zhì)量）GTMAC（5 ml）和0.645 mol·L-1NaOH（5 ml）混合溶液的錐形瓶中，懸浮液在170 r·min-1和25℃下反應(yīng)過夜。收集的凝膠經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗后，稱取2 g抽干后凝膠重懸于 4.6 mol·L-1NaOH溶液（1.2 ml）中并加入4 ml BDDE。上述懸浮液于170 r·min-1和25℃下反應(yīng)2 h以引入環(huán)氧基團(tuán)活化Sepharose FF?；罨z經(jīng)去離子水反復(fù)沖洗并抽干后用于SpA色譜介質(zhì)合成。

活化Sepharose FF在10 mmol·L-1NaHCO3溶液中平衡過夜后，轉(zhuǎn)移至含有配基的10 mmol·L-1NaHCO3溶液中。上述懸浮液于170 r·min-1和37℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)去離子水反復(fù)清洗后轉(zhuǎn)移至巰基乙醇（1 ml）和含0.5 mol·L-1NaCl的0.2 mol·L-1NaHCO3（9 ml）的混合溶液中于37℃下反應(yīng)2 h封閉凝膠表面殘留的環(huán)氧基團(tuán)。SpA色譜配基的修飾密度通過Water C18反相色譜柱測定反應(yīng)前后溶液中配基濃度變化后計算得到。本文中合成的5種SpA色譜介質(zhì)依據(jù)配基的種類分別命名為Z SepFF、Z? SepFF、Z? SepFF、Z4SepFF和Z?4SepFF。

1.6 SpA色譜介質(zhì)耐堿性實驗

SpA色譜介質(zhì)的耐堿性實驗分別在濃度為0.1和0.5 mol·L-1的NaOH溶液中進(jìn)行。簡要步驟如下：SpA色譜介質(zhì)在NaOH溶液中浸泡2、6和12 h；繼而經(jīng)去離子水沖洗后，SpA色譜介質(zhì)于含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS緩沖液（pH 7.5）中平衡過夜；稱取10 mg 平衡后的介質(zhì)依次轉(zhuǎn)入裝有10 ml濃度為0.2～3.0 mg·ml-1抗體溶液的錐形瓶中。上述懸浮液在25℃和120 r·min-1條件下反應(yīng)過夜達(dá)到吸附平衡。最后，在4000 r·min-1下離心收集上清液，在280 nm下測定上清液中抗體濃度，根據(jù)質(zhì)量守恒計算出抗體吸附量。根據(jù)式(1)的Langmuir吸附等溫線可計算出抗體飽和吸附容量m（mg·g-1）和解離常數(shù)d（mg·ml-1）

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的圓二色光譜

本文利用CD光譜分析了結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?在含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS溶液（pH 6.0）和0.1 mol·L-1NaOH溶液中的二級結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律。3種結(jié)構(gòu)域的CD光譜結(jié)果如圖2所示。

圖2（a）中結(jié)構(gòu)域Z的CD光譜顯示，其在190～200 nm間有一正特征峰，而在208和222 nm附近各有一負(fù)特征峰。這與典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)CD特征峰相吻合[17-18]。此外，Jendeberg等[19]在200～250 nm的CD光譜掃描結(jié)果也顯示，結(jié)構(gòu)域Z在208和222 nm附近各有一個負(fù)特征峰。迄今結(jié)構(gòu)域Z及其與抗體復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)的研究均表明，結(jié)構(gòu)域Z分子由空間上3條反向平行α-螺旋構(gòu)成[19-21]。由圖2（a）結(jié)果可知，本文中結(jié)構(gòu)域Z不僅與文獻(xiàn)報道的結(jié)構(gòu)域Z一級序列相同而且均有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)，由此證明兩種分子具有相同的空間結(jié)構(gòu)。

(a) 100 mmol·L-1NaCl in 20 mmol·L-1PBS buffer (pH 6.0); (b) 0.1 mol·L-1NaOH solution

突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?在pH 6.0下的CD光譜結(jié)果亦繪于圖2（a）中。從中可知，突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?具有與結(jié)構(gòu)域Z一致的特征峰，即分別為190～200 nm間的正特征峰和208與222 nm附近兩個負(fù)特征峰。由此可知，結(jié)構(gòu)域Z中氨基酸突變（如圖1所示）并未引起突變結(jié)構(gòu)域分子二級結(jié)構(gòu)的改變，突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?保持了與結(jié)構(gòu)域Z相同的二級結(jié)構(gòu)。而在0.1 mol·L-1NaOH溶液中，結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?中僅有222 nm附近的負(fù)特征峰仍然可見[圖2（b）]。圖2（a）結(jié)果進(jìn)一步顯示，在222 nm下突變結(jié)構(gòu)域Z?比突變結(jié)構(gòu)域Z?和結(jié)構(gòu)域Z具有更強(qiáng)的負(fù)特征峰，表明突變結(jié)構(gòu)域Z?的α-螺旋含量更高。對比圖1中結(jié)構(gòu)域序列發(fā)現(xiàn)，其變化趨勢與結(jié)構(gòu)域中第12位上Trp（-0.9）、Ala（1.8）和Ile（4.5）殘基的Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)增加相一致[22-23]。這說明在結(jié)構(gòu)域Z的12位引入疏水性更大的氨基酸殘基有利于提高α-螺旋含量。

2.2 結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的示差掃描量熱分析

為了進(jìn)一步考察其對結(jié)構(gòu)域分子穩(wěn)定性的影響，本文采用DSC測量結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的熱轉(zhuǎn)變溫度m。不同條件下，結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的偏摩爾熱容（ΔC）隨溫度變化結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，在含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS溶液（pH 6.0）中結(jié)構(gòu)域Z的m為75.3℃。這個結(jié)果與Dincbas-Renqvist等[24]通過CD光譜[]222變化測定的結(jié)構(gòu)域Z在pH 5.7下熱轉(zhuǎn)變溫度（m=78.5℃）非常接近。相同條件下，突變結(jié)構(gòu)域Z?的m為76.9℃，其較結(jié)構(gòu)域Z提高了1.6℃；突變結(jié)構(gòu)域Z?的m為79.2℃，其相較于結(jié)構(gòu)域Z和Z?分別提高了3.9℃和2.3℃。同樣的趨勢也出現(xiàn)在0.1 mol·L-1NaOH溶液中。如圖3（b）所示，0.1 mol·L-1NaOH溶液中結(jié)構(gòu)域Z、Z?和Z?的m分別降至61.6、64.8和62.8℃。對比突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?的氨基酸序列（如圖1所示）可以發(fā)現(xiàn)，兩者之間唯一差別在于突變結(jié)構(gòu)域Z?第12位上的Trp替換為突變結(jié)構(gòu)域Z?中疏水性更大的Ile。由此，突變結(jié)構(gòu)域Z?分子內(nèi)的疏水性相互作用得到了強(qiáng)化，從而顯著提高突變結(jié)構(gòu)域的分子穩(wěn)定性。而當(dāng)Kyte-Doolittle疏水性指數(shù)較小的Trp存在時，突變結(jié)構(gòu)域Z?的m值較突變結(jié)構(gòu)域Z?下降。突變結(jié)構(gòu)域Z?不僅在3種結(jié)構(gòu)域中具有最高的m值而且其在0.1 mol·L-1NaOH溶液中的m值接近Minakuchi等[14]報道的中性條件下結(jié)構(gòu)域B的熱轉(zhuǎn)變溫度（m= 67.5℃）。這說明突變結(jié)構(gòu)域Z?具有更好的分子穩(wěn)定性。

(a) 100 mmol·L-1NaCl in 20 mmol·L-1PBS buffer (pH 6.0); (b) 0.1 mol·L-1NaOH solution

2.3 融合蛋白Z4與Z?4表達(dá)與純化

采用Q Sepharose FF離子交換色譜柱對BL21（DE3）大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白Z4和Z?4進(jìn)行純化。離子交換色譜平衡后，連續(xù)輸入細(xì)胞破碎后的上清液直至穿透；上樣后清洗除去未吸附的蛋白樣品，然后引入洗脫液通過線性梯度洗脫吸附組分并收集電導(dǎo)率為6～10 mS·cm-1的洗脫峰。實驗結(jié)果如圖4所示。圖4（a）為融合蛋白Z4的色譜圖及電泳照片。從中可以看出，陰離子交換色譜Q-Sepharose FF收集的洗脫蛋白質(zhì)分子量介于26×103～27×103，其與融合蛋白Z4的理論分子量相當(dāng)。該目標(biāo)蛋白的純度達(dá)到95%以上。相同的結(jié)果也出現(xiàn)在圖4（b）中。經(jīng)離子交換色譜Q Sepharose FF純化收集的融合蛋白Z?4同樣具有95%以上的純度。兩種融合蛋白直接用于SpA親和色譜介質(zhì)的合成。

2.4 SpA色譜介質(zhì)的耐堿性分析

本文中突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?與結(jié)構(gòu)域Z分別偶聯(lián)于瓊脂糖凝膠Sepharose FF表面合成Z SepFF、Z? SepFF和Z? SepFF 3種SpA色譜介質(zhì)。3種色譜介質(zhì)的SpA配基密度依次為9.7、9.7和9.5 mg·g-1介質(zhì)。上述3種介質(zhì)分別浸于0.1 mol·L-1NaOH溶液2、6和12 h后，測定其抗體吸附能力。抗體在Z SepFF和Z? SepFF介質(zhì)上的靜態(tài)吸附結(jié)果如圖5所示。抗體吸附的Langmuir參數(shù)列于表1中。結(jié)果顯示，Z SepFF和Z? SepFF介質(zhì)在含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS緩沖液（pH 7.5）中的抗體飽和吸附容量相當(dāng)，分別為22.1和21.4 mg·ml-1。但是，抗體在Z? SepFF介質(zhì)上的吸附量非常低（本文未列出）。對比圖1中突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?的序列可知，兩者間唯一差別在于突變結(jié)構(gòu)域Z?中Ile替換為突變結(jié)構(gòu)域Z?中Trp。這種差別也導(dǎo)致突變結(jié)構(gòu)域Z?中α-螺旋含量及m值的降低。本文將專注于Z SepFF和Z? SepFF介質(zhì)的耐堿性分析。浸泡于0.1 mol·L-1NaOH溶液12 h后，Z SepFF和Z? SepFF介質(zhì)的m值也僅略微降低不到10%（如表1所示）。

本文進(jìn)一步合成了Z4SepFF和Z?4SepFF介質(zhì)。Z4SepFF和Z?4SepFF介質(zhì)的SpA配基密度分別為9.5和9.3 mg·g-1介質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較了上述4種SpA色譜介質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液（0.5 mol·L-1NaOH溶液）的耐受性。實驗結(jié)果如圖6所示。從中可以看出，Z SepFF介質(zhì)的抗體吸附容量隨著浸泡時間的延長下降得最為顯著，在標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液中浸泡12 h后僅保留了50%的抗體吸附能力。這種抗體吸附容量的下降程度與Linhult等[11]報道相近，其發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域Z在0.5 mol·L-1NaOH溶液浸泡12 h后的抗體吸附量相當(dāng)于浸泡1 h后的65%。圖6結(jié)果進(jìn)一步顯示，Z? SepFF對標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液的耐受性更好，其在標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液中浸泡12 h后仍保留了初始抗體吸附容量的62%。本文中融合蛋白Z4和Z?4的引入不僅提高了SpA色譜介質(zhì)的抗體吸附容量而且進(jìn)一步提高了其對堿液的耐受性。在含100 mmol·L-1NaCl的20 mmol·L-1PBS緩沖液（pH 7.5）中，抗體在Z4SepFF和Z?4SepFF介質(zhì)上的m分別達(dá)到55.4和57.9 mg·ml-1。這不僅比von Roman等[25]報道的以結(jié)構(gòu)域B四串聯(lián)體融合蛋白為配基SpA色譜介質(zhì)的m高出25%，也接近商品化MabSelect Xtra和MabSelect SuRe介質(zhì)的m值[26]。

(a) chromatography of SpA-Z4and native PAGE image; (b) chromatography of SpA-Z?4and native PAGE image; F and P stands for feedstock and product, respectively

表1 不同堿液浸泡時間t后Z SepFF和Z? SepFF介質(zhì)的Langmuir參數(shù)

在標(biāo)準(zhǔn)CIP溶液中浸泡12后，Z4SepFF和Z?4SepFF的m分別降至60%和68%。這表明SpA色譜介質(zhì)的堿液耐受性得到進(jìn)一步改善。耐堿性實驗結(jié)果不僅證明了突變結(jié)構(gòu)域Z?具有更好的堿液耐受性，而且這種堿液耐受性在突變結(jié)構(gòu)域Z?四串聯(lián)體融合蛋白為配基的SpA色譜介質(zhì)中得到了提高。

3 結(jié) 論

本文通過對結(jié)構(gòu)域Z非關(guān)鍵氨基酸殘基中去酰胺化效應(yīng)的消除（N11T和N23T）和疏水性相互作用的增強(qiáng)（Q31T和A12I）提高SpA蛋白結(jié)構(gòu)域Z分子整體穩(wěn)定性。突變結(jié)構(gòu)域Z?和Z?的CD光譜結(jié)果顯示，兩者的特征峰與結(jié)構(gòu)域Z相一致。這表明突變結(jié)構(gòu)域中氨基酸的替換并未引起結(jié)構(gòu)域分子二級結(jié)構(gòu)的改變。突變結(jié)構(gòu)域Z?在222 nm下具有最強(qiáng)的負(fù)特征峰，暗示著其α-螺旋含量要明顯高于其他分子。在pH 6.0下，突變結(jié)構(gòu)域Z?的m較突變結(jié)構(gòu)域Z?提高了2.3℃，達(dá)到了79.2℃。這一結(jié)果表明，突變結(jié)構(gòu)域Z?中第12位替換為疏水性更大的Ile顯著提高了結(jié)構(gòu)域分子的穩(wěn)定性。SpA色譜介質(zhì)耐堿性實驗結(jié)果表明，突變結(jié)構(gòu)域Z?具有更好的堿液耐受性，這種堿液耐受性在以其四串聯(lián)體融合蛋白為配基的SpA色譜介質(zhì)中得到了進(jìn)一步提高。

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Construction and characteristics of alkali-tolerance mutants of Z domain for protein A chromatography

GUAN Zhilong, BAI Shu, SUN Yan, SHI Qinghong

(Key Laboratory of Systems Bioengineering of Ministry of Education, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

A novel strategy to optimize intramolecular interaction of Z domain was proposed to improve alkali-tolerance of the domain ofprotein A (SpA) and two mutants of Z domain, named as Z? domain and Z? domain, were prepared to evaluate their alkali tolerance as the ligand for protein A chromatography. The result of circular dichroism showed that both the mutants had the identical characteristic peaks to Z domain whilst Z? domain had higher α-helix content than Z? domain. At pH 6.0, heat transition temperature of Z? domain increased by 3.9℃ compared with domain Z whilst heat transition temperature of Z? domain increased merely by 1.6℃. It indicated that the introduction of more hydrophobic Ile at position 12 in Z? domain improved the stability of the Z? domain. Using Z, Z? and their tetrameric domains as the ligand for protein A adsorbents, adsorption performance of SpA adsorbents was evaluated after their exposure in alkaline solutions. The results demonstrated that domain Z? had a higher alkali tolerance among three domains and the tolerance was further improved by applying a tetrameric Z? domain. The research provided a new clue for the development of alkali-tolerance protein A ligand.

antibody; adsorption; thermodynamics; protein A chromatography; differential scanning calorimetry; circular dichroism; alkali tolerance

10.11949/j.issn.0438-1157.20170366

TQ 028.8

A

0438—1157（2017）09—3459—07

2017-04-10收到初稿，2017-05-10收到修改稿。

史清洪。

管志龍（1989—），男，碩士研究生。

國家自然科學(xué)基金項目(21276189, 21476166)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(15JCYBJC48500)；生化工程國家重點實驗室開放基金(2014KF-03)。

Receiving date: 2017-04-10.

Prof. SHI Qinghong, qhshi@tju.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21276189, 21476166), the Tianjin Natural Science Foundation (15JCYBJC48500) and the Open Funding Project of the State Key Laboratory of Biochemical Engineering (2014KF-03).