園養(yǎng)大袋鼠“粗頜病”的病原分離與鑒定

李照偉，劉 霞，費(fèi)榮梅，陳 蓉，王素春

（1. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3. 南京市紅山森林動(dòng)物園，江蘇南京 210028；4. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

園養(yǎng)大袋鼠“粗頜病”的病原分離與鑒定

李照偉1，劉 霞1，費(fèi)榮梅2，陳 蓉3，王素春4

（1. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；3. 南京市紅山森林動(dòng)物園，江蘇南京 210028；4. 中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

園養(yǎng)大袋鼠“粗頜病”是一種由齒槽感染引發(fā)頑固性牙周炎，導(dǎo)致出現(xiàn)牙齦潰爛并形成潰瘍、竇道，嚴(yán)重時(shí)頜面部腫脹、壞死，上下頜骨不可逆性變形等一系列臨床癥狀為特征的口炎綜合征。本研究對(duì)江蘇省南京市紅山森林動(dòng)物園發(fā)生“粗頜病”的兩種園養(yǎng)大袋鼠進(jìn)行病原分離與鑒定，從發(fā)病大袋鼠的病變部位分離出3株細(xì)菌。依據(jù)形態(tài)特征和培養(yǎng)特性觀察，以及生化試驗(yàn)和耐藥性檢測，初步判定其中1株為糞腸球菌（Enterococcus faecalis），另2株為肺炎克雷伯菌（Klebsiella pnenmoniae）。通過全自動(dòng)藥敏分析和小鼠致病性試驗(yàn)，對(duì)分離菌株進(jìn)一步鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與初判結(jié)果一致。小鼠口腔感染試驗(yàn)可以模擬復(fù)制出發(fā)病袋鼠下頜腫脹的病變特征，只是一般注射劑量不能致死小鼠。

袋鼠；粗頜??；病原分離與鑒定；糞腸球菌；肺炎克雷伯菌

大袋鼠屬哺乳動(dòng)物綱有袋目（Marsupialia）袋鼠科（Macropididae）[1]，原產(chǎn)于澳大利亞大陸和巴布亞新幾內(nèi)亞的部分地區(qū)。大袋鼠多群居，主要以灌木嫩樹枝、青草和柔軟植物為食[2]。由于其具有較高的觀賞價(jià)值，通常在動(dòng)物園內(nèi)作為觀賞動(dòng)物飼養(yǎng)[3]。大袋鼠在園養(yǎng)過程中廣泛流行一種口炎綜合征，以齒槽感染引發(fā)頑固性牙周炎，出現(xiàn)牙齦潰爛并形成潰瘍、竇道，嚴(yán)重時(shí)頜面部腫脹、壞死，上下頜骨不可逆性變形等為主要臨床特征[4]，被Fowler等[5]命名為“粗頜病”（Lumpy Jaw）。“粗頜病”的致病菌并非單一菌株，常為多種細(xì)菌，因而難以有效控制[6-8]。發(fā)病袋鼠不分性別、品種和年齡，均有較高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及病死率，因此嚴(yán)重影響袋鼠的正常展出與觀賞，并可因預(yù)后不良導(dǎo)致死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)發(fā)病大袋鼠進(jìn)行病原菌的分離與鑒定，可為該病的治療及預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病袋鼠包括赤大袋鼠（Macropus rufus）和灰大袋鼠（Macropus giganteus）。

1.1.1 被檢材料。從發(fā)病袋鼠的口腔、牙齦、下顎，剪下痂皮、結(jié)節(jié)，或無菌采集病變部的膿汁、壞死組織。

1.1.2 培養(yǎng)基。營養(yǎng)肉湯（NB）、營養(yǎng)瓊脂（NA）平板、麥康凱瓊脂（MAC）平板、亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板、三糖鐵瓊脂（TSI）斜面，血瓊脂（BA）平板（無菌脫纖羊血購自杭州微生物試劑有限公司），按使用說明書配制。

1.1.3 試劑及試紙。草酸銨結(jié)晶紫溶液、革蘭碘溶液、95%乙醇、沙黃溶液、香柏油、二甲苯溶液，硝酸鹽還原檢測試劑、VP檢測液、甲基紅檢測試劑、苯丙氨酸檢測試劑，3% H2O2、生理鹽水、氧化酶反應(yīng)試劑及試紙、藥敏試紙、葡萄糖氧化/發(fā)酵管、微量生化鑒定管，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器。SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、DK-8D數(shù)顯恒溫水浴箱、GY-31光學(xué)顯微鏡、SYQ-DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器、THZ-C臺(tái)式恒溫振蕩器、Pico17離心機(jī)、Smart SpecTM3000紫外分光光度計(jì)、Biomerieux微生物藥敏分析鑒定系統(tǒng)等。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔級(jí)小鼠12只，雌性，體重均為20 g左右，購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 細(xì)菌學(xué)檢查

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察。無菌采集發(fā)病袋鼠下頜感染部位膿汁[9]，接種于NB中，分別置37 ℃燭缸和37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行厭氧培養(yǎng)和有氧培養(yǎng)，24～48 h后將其涂片染色鏡檢；待菌液渾濁度足夠時(shí)，將增菌液分三區(qū)劃線接種于BA平板后，置37 ℃燭缸和37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)增菌24～48 h，挑取單個(gè)可疑菌落，對(duì)其涂片染色鏡檢。1.2.2 細(xì)菌純培養(yǎng)。將染色鏡檢后的單個(gè)可疑菌落分別進(jìn)行BA平板接種、NB純培養(yǎng)，將培養(yǎng)物置37 ℃燭缸和37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后涂片染色鏡檢，觀察是否出現(xiàn)雜菌。如已達(dá)到純培養(yǎng)目的，則繼續(xù)觀察細(xì)菌的形態(tài)以及在需氧環(huán)境和厭氧環(huán)境中的生長情況[10]。

1.2.3 細(xì)菌鑒別培養(yǎng)。挑取單個(gè)可疑菌落，將其分三區(qū)劃線接種于MAC平板、BS平板和TSI斜面，置37 ℃生化培養(yǎng)箱，24 h后觀察。

1.3 生化試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物，對(duì)其進(jìn)行觸酶、氧化酶、葡萄糖氧化/發(fā)酵等試驗(yàn)；參考細(xì)菌編碼鑒定系統(tǒng)，接種微量生化鑒定管，置37℃生化培養(yǎng)箱，24 h后鑒定生化特性[11]。

1.4 耐藥性檢測及全自動(dòng)藥敏分析鑒定

根據(jù)抗生素敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)[12]，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行耐藥性檢測。置37℃生化培養(yǎng)箱，24 h后測量抑菌圈直徑，判斷細(xì)菌對(duì)14種藥物的敏感性。將3株純培養(yǎng)物送檢江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院進(jìn)行全自動(dòng)藥敏分析鑒定。

1.5 動(dòng)物試驗(yàn)

取純培養(yǎng)物，將其接種于NB中，37 ℃，180 r/min振搖12～14 h，至細(xì)菌的生長對(duì)數(shù)期；以滅菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，測定OD600nm值；將菌液濃度稀釋至1.0×108CFU/mL，進(jìn)行小鼠口腔感染試驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為4組，每組3只，設(shè)空白對(duì)照組。除對(duì)照組外，其余各組分別注射不同細(xì)菌。用無菌注射器吸取稀釋菌液0.1～0.2 mL/只，進(jìn)行小鼠口腔注射[10]（空白對(duì)照組不注射），觀察小鼠1周內(nèi)的發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌學(xué)鑒定

2.1.1 細(xì)菌形態(tài)。經(jīng)分離、純化后得到3株不同的菌株。其中：第1株為革蘭陽性球菌，多呈雙球形態(tài)，染色均勻，無鞭毛、芽孢和莢膜；第2株和第3株均為革蘭陰性短桿菌，染色均勻，兩端鈍圓呈棒狀，無規(guī)則散在，無鞭毛和芽孢，有莢膜。

2.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)特征。3株細(xì)菌均為需氧菌：第1株菌液渾濁度較低，管低見少量沉淀，振搖后沉淀呈螺旋上升；第2株和第3株菌液渾濁度較高，呈均勻渾濁。細(xì)菌分離培養(yǎng)后，接種第1株菌的BA平板上可見白色不透明針尖狀菌落。菌落直徑0.5 mm左右，表面光滑，邊緣整齊；初分離時(shí)有狹窄溶血，傳代后溶血現(xiàn)象不明顯。接種第2株和第3株菌的BA平板上可見乳白色圓形小菌落。菌落直徑1～2 mm，表面光滑、濕潤，邊緣整齊，不溶血。細(xì)菌純培養(yǎng)后，接種第2株和第3株菌的MAC平板上出現(xiàn)呈玫紅色圓形菌落。菌落直徑1 mm左右，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，生長良好，個(gè)別呈同心圓狀。接種第2株和第3株菌的BS平板上出現(xiàn)黑色圓形或橢圓形菌落。菌落直徑0.5～1 mm，表面濕潤、光滑，邊緣整齊，生長良好；接種第2株菌和第3株菌的TSI斜面出現(xiàn)產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，整個(gè)斜面呈黃色，穿刺線無變化，菌株無動(dòng)力。

2.2 生化試驗(yàn)

將3株純培養(yǎng)物分別進(jìn)行葡萄糖氧化/發(fā)酵（O/ F）試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和觸酶試驗(yàn)，并將菌落接種于微量生化鑒定管中，置37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，菌株1（O/F）試驗(yàn)氧化型，觸酶試驗(yàn)、尿素、蔗糖、精氨酸水解、木糖、木糖醇、密二糖、葡磷胨水均為陰性，乳糖、甘露糖、麥芽糖、覃糖、甘露醇、N-乙酰葡胺、果糖、山梨醇、硝酸鹽還原均為陽性；菌株2和3（O/F）試驗(yàn)發(fā)酵型，氧化酶試驗(yàn)、硫化氫、苯丙氨酸、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、動(dòng)力、山梨醇、鳥氨酸、氨基酸對(duì)照均為陰性，葡萄糖酸鹽、尿素、產(chǎn)氣、賴氨酸、棉子糖、側(cè)金盞花醇、木糖均為陽性。根據(jù)生化試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合其形態(tài)及染色特性、分離培養(yǎng)特性、菌落特征等，初步鑒定分離菌株為1株糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和2株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pnenmoniae）。

2.3 耐藥性檢測及全自動(dòng)藥敏分析鑒定

通過K-B紙片擴(kuò)散法，結(jié)合抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)分離菌進(jìn)行耐藥性檢測（表1）。結(jié)果顯示：菌株1對(duì)復(fù)方新諾明、先鋒霉素IV、頭孢吡肟、氨芐西林、頭孢西丁、新霉素、青霉素G耐藥，對(duì)慶大霉素、紅霉素、氯霉素、諾氟沙星、阿米卡星、四環(huán)素、阿莫西林敏感；菌株2和菌株3對(duì)氨芐西林、慶大霉素、青霉素G、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、阿莫西林、先鋒霉素IV耐藥，對(duì)新霉素、紅霉素處于中介敏感，對(duì)諾氟沙星、阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢西丁、氯霉素敏感。

表1 耐藥性檢測結(jié)果（抑菌圈直徑） （單位：mm）

將3株純培養(yǎng)物進(jìn)行全自動(dòng)藥敏分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與耐藥性檢測結(jié)果一致（表2）；進(jìn)一步鑒定分離菌株，確定1株為糞腸球菌，另2株為肺炎克雷伯菌。

表2 微生物藥敏分析鑒定結(jié)果

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

將3株菌接種于NB振搖12 h后，用紫外分光光度計(jì)分別測定OD600nm值（3株菌液濃度分別2.6×108、5.6×108、6.7×108CFU/mL）。將菌液濃度均稀釋至1.0×108CFU/mL，以0.1～0.2 mL/只對(duì)小鼠進(jìn)行口腔注射，對(duì)照組不注射，觀察1周。小鼠感染試驗(yàn)顯示：感染24 h后，感染組小鼠精神狀態(tài)較好，飲食、飲欲正常，除頜部有非常輕微腫脹外，與對(duì)照組小鼠體況基本相似；感染48 h后，小鼠食欲開始減弱，頜部腫脹開始顯現(xiàn)，并輕微發(fā)紅；感染72 h后，小鼠精神逐漸沉郁，食欲驟降，甚至不食，不愿意活動(dòng)，常打堆抱團(tuán)不動(dòng)，飲水量減少，其頜部腫脹明顯，常以前爪搔抓頜部，有疼痛表現(xiàn)（觸摸腫脹部小鼠回避閃躲）。

3株菌均可引起小鼠的臨床反應(yīng)，復(fù)制出頜部腫脹的病變特征，但該劑量菌液不能致死小鼠，因此判定菌株致病力不強(qiáng)。第8天全部處死小鼠，進(jìn)行剖檢，可見下頜部有明顯的局部膿腫，個(gè)別嚴(yán)重者牙髓腔較對(duì)照組小鼠增大，有明顯的空洞，小鼠肝臟、脾臟腫大，呈淡粉色，個(gè)別感染小鼠心臟有淤血。分別取各組小鼠病變肝臟、脾臟以及頜部膿汁接種于BA平板，然后將其置37 ℃生化培養(yǎng)箱，24 h后可觀察到與之前純培養(yǎng)相似的菌落；挑取單個(gè)可疑菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭染色鏡檢，可見細(xì)菌形態(tài)與分離菌株形態(tài)相同，證明在本試驗(yàn)病例分離出的菌株為糞腸球菌和肺炎克雷伯菌。

3 討論

根據(jù)本次試驗(yàn)結(jié)果，可以初步確診感染袋鼠的病原為糞腸球菌和肺炎克雷伯菌。其中，糞腸球菌是條件致病菌，一般棲居于各種溫血和冷血?jiǎng)游锏那荒c，對(duì)環(huán)境耐受性極強(qiáng)，存活力持久[13]；肺炎克雷伯菌是動(dòng)物呼吸道和腸道內(nèi)的寄生性條件致病菌，只在特殊條件下（免疫力低下、長期使用抗菌藥等）才會(huì)引起化膿性感染[14]。本園袋鼠由于存在近親交配、長期攜帶賈第蟲、病毒侵害等問題，個(gè)體免疫力較差，易被這些條件致病菌引起發(fā)病。

“粗頜病”多因牙周炎、口腔黏膜損傷等引發(fā)頜部骨髓炎，因此定期口腔檢查和局部清創(chuàng)消炎是防治的關(guān)鍵[8]。“粗頜病”致病菌并非單一。國內(nèi)多家動(dòng)物園已分離到多種細(xì)菌，且均為條件致病菌[4，7-8]，其主要通過發(fā)病袋鼠眼部、鼻腔及口腔的膿性分泌物傳播，因此應(yīng)避免同群袋鼠通過相互接觸而感染。相較于野生袋鼠以柔軟植物為食，圈養(yǎng)袋鼠飼料偏于粗硬，易造成口腔損傷，且紅薯、土豆等高淀粉飼料易在口腔內(nèi)發(fā)酵，這為致病菌生長繁殖提供了有利條件和環(huán)境[15]。因此，應(yīng)改善園養(yǎng)袋鼠飲食，減輕飼料纖維硬度，避免齲齒形成（飼料糖分過高）和牙齒松動(dòng)脫落（攝入鈣量不足）[16]。此外，袋鼠天性膽小謹(jǐn)慎，因此飼養(yǎng)場地應(yīng)盡可能開闊、安靜，以減少應(yīng)激，增強(qiáng)袋鼠免疫力。只要堅(jiān)持“養(yǎng)防重于治療”的原則，就可有效控制此病發(fā)生。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Pathogen Isolation and Identifcation for“Lumpy Jaw”of Kangaroos in Zoos

Li Zhaowei1，Liu Xia1，F(xiàn)ei Rongmei2，Cheng Rong3，Wang Suchun4
（1. Guizhou Provincial Animal Disease Prevention and Control Center，Guiyang，Guizhou 550008；2. Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095；3. Hongshan Forest Zoo，Nanjing，Jiangsu 210028；4. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

“Lumpy Jaw”of kangaroos in zoos is an oral inflammation syndrome caused by alveolus infection，which was characterized by refractory periodontitis，ulcerated gums resulting in ulcer and sinus，swelling and necrosis in maxillofacial region and irreversible malposition of maxillary and mandible seriously. In this study，the pathogens of“Lumpy Jaw” in park kangaroos from Nanjing Hongshan Forest Zoo were isolated and identified. Three strains of bacteria were isolated and were identified as Enterococcus faecalis and Klebsiella pnenmoniae，respectively，by their morphology，cultural characteristics，biochemical characteristics and drug sensitivity. By full-automatic analysis of drug sensitivity and pathogenicity in mice experiment，further identification of the isolated strains were carried out，and the results were consistent with the former. The oral infection of mice experiment showed that the symptoms of“Lumpy Jaw” in the mice could be simulated，but general dozes could not contribute to death of mice.

kangaroo；Lumpy Jaw；pathogen isolation and identification；Enterococcus faecalis；Klebsiella pnenmoniae

S851.3

A

1005-944X（2017）09-0107-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.028

科技部科技基礎(chǔ)性專項(xiàng)（SQ2012FY3260033）