湖北省某規(guī)?；i場豬繁殖與呼吸綜合征的診斷及流行毒株GP5基因特性分析

李孝文，章洪皸，樊翠華，姜 平

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2. 國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系黃陂綜合試驗(yàn)站，湖北武漢 430344；3. 西藏新好科技有限公司，西藏拉薩 850000）

湖北省某規(guī)?；i場豬繁殖與呼吸綜合征的診斷及流行毒株GP5基因特性分析

李孝文1，3，章洪皸2，樊翠華2，姜 平1

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095；2. 國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系黃陂綜合試驗(yàn)站，湖北武漢 430344；3. 西藏新好科技有限公司，西藏拉薩 850000）

2016年湖北省某豬場暴發(fā)一起疫情。通過病史調(diào)查、臨床觀察、實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該疫情為豬繁殖與呼吸綜合征。對病原測序分析的結(jié)果顯示：其Nsp2基因存在30個(gè)氨基酸缺失；ORF5基因與WUH1野毒株同源性最高。此外，生產(chǎn)母豬群和后備豬群血清樣品的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）ELISA N蛋白抗體S/P值離散度較大，證明該病原為高致病性PRRSV。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；診斷；ORF5；感染狀態(tài)

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病[1-3]。1996年我國首次發(fā)生該病[4]。2006年由高致病性PRRSV（HP-PRRSV）引發(fā)的疫情在我國多個(gè)養(yǎng)豬省份暴發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失[11]。PRRSV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，基因全長約15 kb[5-6]，基因變異性較高[7]。PRRSV可分為2個(gè)基因型（Genotype），基因組同源性為60%[8-10]。ORF5基因編碼的GP5蛋白與病毒免疫保護(hù)相關(guān)。不同基因型毒株的ORF5基因存在較大變異，同型毒株中ORF5的變異也較大。此外，PRRSV 的Nsp2基因變異也較大。相對PRRSV傳統(tǒng)毒株VR2332，我國HP-PRRSV Nsp2編碼區(qū)存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失[11-14]。我國商品化的PRRS活疫苗有高致病性弱毒疫苗（JXA1-R株、HuN4-F112株、TJM-F92株和GDr180株）及經(jīng)典弱毒疫苗（CH-1R株、R98株）和進(jìn)口減毒活疫苗（Ingelvac PRRS MLV VR2332株）。這些疫苗對控制和減緩PRRS疫情起到了積極作用。但近年來，臨床上不斷出PRRS疫情，疫情有抬頭趨勢。

通過對2016年湖北省某規(guī)?；i場一起疫情的病史調(diào)查、臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該疫情為高致病性PRRS疫情。本研究為該地區(qū)規(guī)?；i場的PRRS防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病豬場基本情況

該豬場免疫PRRS江西毒株（JXA1-R）減毒活疫苗。110日齡后備豬免疫1頭份，母豬產(chǎn)后1周免疫1頭份，產(chǎn)房仔豬2周后免疫0.5頭份，公豬不免疫。

該豬場定期進(jìn)行豬瘟、偽狂犬病抗原監(jiān)測，持續(xù)進(jìn)行豬瘟和偽狂犬病的免疫跟蹤，為豬瘟和偽狂犬病抗原雙陰性場。偽狂犬病 gE抗體陽性率為0，豬瘟抗體陽性率為100%。2015年11—12月該豬場曾暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情，產(chǎn)房死淘率超過30%。

1.2 疫病調(diào)查和臨床觀察

根據(jù)病豬體溫、食欲、精神狀態(tài)、皮膚發(fā)紺等表觀癥狀以及是否有咳嗽、流鼻涕等呼吸道癥狀進(jìn)行判斷，然后根據(jù)發(fā)病豬有無神經(jīng)癥狀進(jìn)行分析。

1.3 病理學(xué)檢查

按照常規(guī)方法對發(fā)病和死亡豬進(jìn)行系統(tǒng)解剖，觀察主要內(nèi)臟器官的病理變化。同時(shí)，采集病變肺臟樣本，固定于4%的多聚甲醛中，室溫放置至少48 h，常規(guī)石蠟包埋制片，并用蘇木精&伊紅染色（H&E染色），光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 RT-PCR檢測

病毒核酸提?。翰捎肨akara公司的RNAiso Plus試劑盒，按產(chǎn)品說明書，對采集的發(fā)病豬新鮮組織樣品進(jìn)行核酸提取。

根據(jù)GenBank中Lelystad（M96262）、CH-1a（AY032626）和JXA1（EF112445）毒株基因序列，設(shè)計(jì)并合成2對引物。Nsp2 F：5′-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3′；Nsp2 R：5′-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3′。HPPRRSV和經(jīng)典PRRSV毒株Nsp2基因擴(kuò)增長度分別為678 bp和768 bp。ORF7 F：5′-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3′；ORF7 R：5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′。歐洲型毒株和美洲型毒株ORF7基因擴(kuò)增長度分別為389 bp和434 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄操作按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系25 μL：10×Easy Taq Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各1 μL、rTaq DNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 14 μL、cDNA模板4 μL。反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖中凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。

1.5 ORF5基因擴(kuò)增與序列分析

PCR引物序列：ORF5 F：5′-ATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGCGTGCTGT-3′；ORF5 R：5′-GAGACGACCCCATTGTTCCGCTGAAACTCTG-3′。利用ORF5引物對PRRSV陽性樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)見上述步驟。將PCR產(chǎn)物膠回收純化后與pMD-18T載體連接。對重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定正確后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。應(yīng)用MegAlign軟件對測序獲得的GP5序列進(jìn)行比對分析，并利用MEGA5.2軟件，根據(jù)Neighbor-Joining運(yùn)算法繪制遺傳進(jìn)化樹（比對值為1 000個(gè)重復(fù)）。

1.6 ELISA抗體檢測

采集血清樣品59份，其中生產(chǎn)母豬44份、后備母豬15份。采用ELISA方法檢測PRRS抗體。關(guān)于PRRS抗體的陽性或陰性，通過計(jì)算樣品與陽性對照的比值（S/P）進(jìn)行判定：S/P值大于2.5時(shí)，判定樣品可能存在PRRSV野毒感染。具體操作方法和步驟按照IDEXX試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果

該豬場位于湖北省南部，2013年初從某種豬公司引入后備豬投產(chǎn)使用，至2014年5月存欄基礎(chǔ)母豬1 200頭左右。該規(guī)模場持續(xù)生產(chǎn)至2016年4月，生產(chǎn)成績穩(wěn)定。2016年4月引入后備母豬1 200頭。此后豬群出現(xiàn)持續(xù)20余天的發(fā)燒和呼吸道癥狀。2016年6月后備豬入群、配種。隨后母豬群出現(xiàn)零星流產(chǎn)、返情和產(chǎn)死胎現(xiàn)象。10月后備母豬在妊娠后期出現(xiàn)持續(xù)發(fā)燒、流產(chǎn)癥狀；11月經(jīng)產(chǎn)母豬出現(xiàn)繁殖障礙。產(chǎn)仔舍仔豬發(fā)燒、出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腿部腫脹等；斷奶轉(zhuǎn)至保育舍，在42日齡左右出現(xiàn)喘氣、發(fā)燒、突然倒地死亡現(xiàn)象，咳喘比例超過20%，腿部腫脹、角弓反張等神經(jīng)癥狀多見。保育期呼吸道癥狀明顯，伴隨高燒和高死淘率，外觀耳尖發(fā)紺（圖1）。

圖1 豬場妊娠母豬流產(chǎn)和保育仔豬臨床癥狀

2.2 病理變化

產(chǎn)房仔豬肺臟支氣管和細(xì)支氣管中充滿大量白色粘液；肺部出現(xiàn)明顯的“間質(zhì)性肺炎”外表觀狀；肺尖葉開始呈現(xiàn)彌漫性病變，肺臟發(fā)生實(shí)變；2周齡仔豬出現(xiàn)肺臟肋骨壓痕。扁桃體、頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)等器官未見眼觀病變。保育仔豬淋巴結(jié)腫大，支氣管充滿大量泡沫，肺臟質(zhì)地變硬，肺尖葉呈現(xiàn)彌散性病變（圖2）。

組織病理學(xué)檢查：病豬肺臟顯微結(jié)構(gòu)完全消失；小葉間隔增厚；大量炎性細(xì)胞及壞死細(xì)胞碎片浸潤于肺泡腔及支氣管周圍（圖3）。

圖2 發(fā)病仔豬肺臟肉眼病變

圖3 發(fā)病仔豬肺臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果（放大倍數(shù)為20×10）

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

PRRSV ORF7基因RT-PCR結(jié)果顯示，檢測樣品中可擴(kuò)增出434 bp的片段，表明該豬場中有美洲型PRRSV存在（圖4-a）。

PRRSV Nsp2基因RT-PCR結(jié)果顯示，擴(kuò)增條帶大小約678 bp（圖4-b），表明該豬場存在HPPRRSV毒株感染。

圖4 豬場臨床樣品ORF7基因和Nsp2基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 ORF5基因序列分析結(jié)果

針對4個(gè)臨床樣品和12株GenBank公布的有代表性毒株的ORF5基因全序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，本次研究的4株P(guān)RRSV分離株均屬美洲型毒株，與HP-PRRSV WUH1毒株同源性最高，隸屬同一分支（圖5）。

2.5 種豬血清抗體調(diào)查結(jié)果

利用IDEXX PRRSV抗體檢測試劑盒，對生產(chǎn)母豬群和后備豬群血清樣品中N蛋白抗體進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，母豬群與后備豬群PRRS抗體S/ P值大于2.5的占比分別為40.9%和30.0%，離散系數(shù)分別是61.6%和48.5%（表2），提示生產(chǎn)母豬與后備母豬感染了PRRSV野毒。

3 討論

PRRSV具有廣泛的變異和毒株多樣性特點(diǎn)，導(dǎo)致疫病的局部暴發(fā)和再流行[3，11，16-18]。2006年HP-PRRSV導(dǎo)致的疫情在我國南方多省暴發(fā)，并成為我國優(yōu)勢流行毒株。2011年高致病性PRRS活疫苗在我國獲批，并在田間得到廣泛使用，為該病的控制發(fā)揮了重要作用。但隨著豬群免疫選擇壓力的增加，PRRSV遺傳和演化相應(yīng)加速[20]。一些毒力稍低的PRRSV毒株Nsp2基因同樣存在30個(gè)不連續(xù)氨基酸缺失[15]。PRRSV經(jīng)典毒株和低致病性毒株時(shí)有報(bào)道[19]。歐洲型PRRSV在我國相繼出現(xiàn)，使得PRRSV感染更為復(fù)雜[21]。因此，定期監(jiān)測和調(diào)查豬場PRRSV毒株多樣化及分析野生毒株的遺傳及演化進(jìn)程，對臨床上PRRS的防控具有重要意義。本研究通過臨床診斷、病理變化、RT-PCR、血清學(xué)檢測和測序分析，確診本次疫情為高致病性PRRS疫情。

PRRSV致病和免疫機(jī)制目前尚不十分清楚，疫苗免疫效果尚不理想，因此該病防控需要依靠綜合性防控措施。該豬場建場以來，疫情一直穩(wěn)定，但本次發(fā)病嚴(yán)重，持續(xù)時(shí)間較長，其原因可能是：首先，豬場原本無PRRSV感染情況，為擴(kuò)大養(yǎng)豬生產(chǎn)規(guī)模引進(jìn)后備母豬，但沒有經(jīng)過系統(tǒng)檢測，引進(jìn)的后備母豬可能存在健康帶毒問題。其次，該豬場采用母豬舍、保育舍和育肥舍組成的兩點(diǎn)式飼養(yǎng)管理模式，發(fā)生疫情時(shí)無法迅速切斷病毒的水平傳播途徑，導(dǎo)致豬場疫情持續(xù)時(shí)間較長。本次發(fā)病病原屬于HP-PRRSV。該流行毒株可能存在抗原性變異。由該病原引發(fā)的疫情近年來在湖北省其它豬場也有類似報(bào)道[22]。因此，加強(qiáng)該流行毒株的變異監(jiān)測，建立該病綜合防控體系十分必要。

同時(shí)，我國豬場尚缺乏完善的生物安全措施；無序引種和引入帶毒種豬造成多毒株在豬場共存和循環(huán)。還有，不加限制地大范圍使用PRRSV減毒活疫苗造成了PRRSV的廣泛傳播。因此，合理、有條件地使用PRRSV減毒活疫苗對該病防控十分重要。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Diagnosis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome and Characteristics Analysis of GP5 Gene of Epidemic Strains in a Large-scaled Swine Farm in Hubei Province

Li Xiaowen1，3，Zhang Hongjun2，F(xiàn)an Cuihua2，Jiang Ping1
（1. College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210095；2. Huangpi Comprehensive Experimental Station，National Pig Industry Technology System，Wuhan，Hubei 430344；3. Tibet Xinhao Technology Co. Ltd，Lasa，Tibet 850000）

An outbreak of PRRS was confirmed at a swine farm in Hubei Province in 2016，by means of history investigations，clinical symptom observations and laboratory diagnoses. The results of the PRRSV isolate sequencing indicated that it had a 30-amino-acid（30-aa）deletion in the Nsp2-coding region. And the homology between ORF5 gene and WUH1 wild strain was the highest. In addition，the S/P values of PRRSV，ELISA and N protein antibodies were highly dispersed in sows and reserve pig serum samples，indicating that the pathogen was highly pathogenic PRRSV.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）；diagnosis；ORF5；infection status

S852.23

B

1005-944X（2017）09-0011-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.004

國家生豬產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目（CARS-36）

姜 平