解郁合歡湯、血府逐瘀湯、天王補(bǔ)心丹抗抑郁作用初步篩選研究

賈銣，方宇驊，陳喆鳴，陳燕，張淑玲，王玉露

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

解郁合歡湯、血府逐瘀湯、天王補(bǔ)心丹抗抑郁作用初步篩選研究

賈銣，方宇驊，陳喆鳴，陳燕，張淑玲，王玉露

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的從解郁合歡湯、血府逐瘀湯和天王補(bǔ)心丹3種復(fù)方水煎劑中初步篩選出有潛在抗抑郁效果的復(fù)方。方法取健康SPF級(jí)雄性KM小鼠50只，根據(jù)曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分成空白組、鹽酸氟西汀組、解郁合歡湯組、血府逐瘀湯組和天王補(bǔ)心丹組5組，每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d。每周進(jìn)行懸尾試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)觀測(cè)小鼠行為學(xué)變化；給藥結(jié)束后測(cè)定小鼠自發(fā)活動(dòng)；行為學(xué)試驗(yàn)結(jié)束后，用Western Blot法測(cè)定小鼠海馬p-GSK3β的表達(dá)量。結(jié)果①與空白組相比，血府逐瘀湯組和天王補(bǔ)心丹組在給藥第1周和第2周均能顯著縮短小鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間，作用與鹽酸氟西汀組相當(dāng)，其中天王補(bǔ)心丹組作用最顯著；解郁合歡湯組有作用趨勢(shì)，但無顯著性差異。②3種復(fù)方均不影響小鼠自發(fā)活動(dòng)。③3種復(fù)方均能增加小鼠海馬p-GSK3β的表達(dá)量，天王補(bǔ)心丹組作用最顯著。結(jié)論天王補(bǔ)心丹抗抑郁效果較強(qiáng)，其作用機(jī)制可能與增加海馬p-GSK3β的表達(dá)有關(guān)。

抗抑郁；行為學(xué)；解郁合歡湯；血府逐瘀湯；天王補(bǔ)心丹；Western Blot

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是當(dāng)今社會(huì)上一種常見的精神疾病，它對(duì)患者的行為、思想及精神狀態(tài)產(chǎn)生負(fù)面、消極的影響［1］。臨床常用的抗抑郁西藥雖然藥效顯著，但有明顯毒副作用，可誘發(fā)躁狂、煩躁不安、情緒激動(dòng)、失眠和行為混亂等問題［2-3］。考慮到抑郁癥治療需要長(zhǎng)期用藥，所以探尋毒副作用更小的抗抑郁藥十分重要，傳統(tǒng)中藥或許能對(duì)抑郁癥治療提供幫助。

相對(duì)于現(xiàn)代抗抑郁藥物，傳統(tǒng)中藥抗抑郁藥物的發(fā)展更為緩慢，也更加注重臨床效果。具有抗抑郁效果（或類抗抑郁效果）的中藥復(fù)方，按照抑郁癥對(duì)應(yīng)癥狀分類，主要可分為3類，即疏肝解郁類、養(yǎng)心安神類和活血化瘀類。解郁合歡湯出自清代費(fèi)伯雄的《醫(yī)醇剩義》［4］，具有疏肝清火解郁、養(yǎng)血安神功效；血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》［5］，具有活血祛瘀、行氣止痛功效；天王補(bǔ)心丹出自《世醫(yī)得效方》［6］，具有滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)心安神功效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所定義的抑郁癥與中醫(yī)郁癥相似［7］。解郁合歡湯［8］、血府逐瘀湯［9］、天王補(bǔ)心丹［10］的主治癥皆與抑郁癥的病征相似，結(jié)合臨床案例我們推測(cè)這3種復(fù)方均具有抗抑郁作用。本研究通過探究3種復(fù)方對(duì)抑郁模型小鼠的行為學(xué)和海馬p-GSK3β表達(dá)的影響，以期篩選出抗抑郁效果較顯著的復(fù)方。

1 材料與藥品

1.1 動(dòng)物及分組SPF 級(jí)KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始正式實(shí)驗(yàn)，自由飲水進(jìn)食。鹽酸氟西汀組每天給予鹽酸氟西?。?0 mg／kg）灌胃，解郁合歡湯組按照《醫(yī)醇剩義·卷二》組方，血府逐瘀湯組和天王補(bǔ)心丹組均按《方劑學(xué)》［11］所記載劑量換算成小鼠用量，空白組給予蒸餾水灌胃。每只小鼠給藥量：解郁合歡湯、血府逐瘀湯和天王補(bǔ)心丹分別為6.8 g／kg、7.8 g／kg和13.2 g／kg，每日灌胃1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2 藥品解郁合歡湯組成：合歡花6 g，郁金6 g，沉香1.5 g，當(dāng)歸6 g，白芍3 g，丹參6 g，柏子仁6 g，山梔4.5 g，柴胡3 g，薄荷3 g，茯神6 g，紅棗5枚，橘餅12 g。血府逐瘀湯組成：當(dāng)歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g。天王補(bǔ)心丹水煎劑組成：丹參9 g，當(dāng)歸10 g，人參10 g，茯苓12 g，五味子8 g，麥冬10 g，天冬9 g，生地黃15 g，玄參10 g，遠(yuǎn)志9 g，酸棗仁12 g，柏子仁10 g，桔梗8 g。以上藥材均購(gòu)自福州回春藥店和福州瑞來春堂，經(jīng)楊成梓教授鑒定均屬《中國(guó)藥典》收載藥材。復(fù)方水煎劑制備方法：上述藥材適量3倍水浸泡30 min，文火煎煮1 h，過濾，濾液備用；濾渣加入3倍量水煎煮1 h，過濾，合并濾液，濃縮至預(yù)設(shè)的濃度，藥液于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸氟西汀膠囊（百憂解，禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)：1017A），使用蒸餾水配成相應(yīng)濃度藥液（10 mg／kg）。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料懸尾實(shí)驗(yàn)裝置（自制）；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)裝置（自制）；小鼠曠場(chǎng)箱（自制）。

2 方法

2.1 分組小鼠根據(jù)初次曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分為5組：空白組、鹽酸氟西汀組、解郁合歡湯組、血府逐瘀湯組、天王補(bǔ)心丹組，每組10只。

2.2 小鼠懸尾試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［12］，將小鼠尾部距尖端約2 cm（1／3）處用膠帶粘貼于橫桿上，前肢距離臺(tái)面約5 cm。錄像記錄6 min內(nèi)小鼠的掙扎狀況，記錄后4 min內(nèi)小鼠不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)的時(shí)長(zhǎng)。小鼠轉(zhuǎn)體、扭曲等掙扎行為皆屬于活動(dòng)狀態(tài)；小鼠前肢小幅擺動(dòng)而軀干及后肢不動(dòng)視為靜止?fàn)顟B(tài)。該實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)第6天和第13天給藥1 h后進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)前不禁食、不禁水。

2.3 小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)參考文獻(xiàn)［12］，將小鼠置于盛有水的大燒杯中，大燒杯水深18 cm，水浴加熱至并保持水溫為（25±1）℃。對(duì)6 min內(nèi)的小鼠游泳錄像，對(duì)后4 min內(nèi)小鼠活動(dòng)情況進(jìn)行分析，記錄后4 min內(nèi)小鼠不動(dòng)狀態(tài)持續(xù)的時(shí)長(zhǎng)。小鼠游泳等掙扎行為皆屬于活動(dòng)狀態(tài)；小鼠前肢小幅擺動(dòng)而整體未在水中游動(dòng)視為靜止?fàn)顟B(tài)。該實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)第7天和第14天給藥1 h后進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)前不禁食、不禁水。

2.4 小鼠自發(fā)活動(dòng)測(cè)定參考文獻(xiàn)［13］，在行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，在第14天將小鼠放置于小鼠曠場(chǎng)箱內(nèi)，對(duì)5 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)狀況進(jìn)行觀察。實(shí)驗(yàn)裝置為50 cm×50 cm×40 cm木箱，周壁黑色，底部等分為25方格，分別記錄小鼠水平得分（三爪以上跨入鄰格的次數(shù)）和垂直得分（兩前肢離地1 cm以上的次數(shù)）。

2.5 Western Blot法檢測(cè)小鼠海馬p-GSK3β的表達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭，在低溫環(huán)境下迅速取出小鼠雙側(cè)海馬并提取總蛋白，用BCA法測(cè)定其蛋白含量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出目標(biāo)蛋白后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）上；將NC膜浸于含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液（Tris buffered saline，TBS）中室溫封閉2 h，用含0.05%吐溫20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，一抗（p-GSK3β 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST漂洗3次，二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，漂洗干凈，凝膠成像儀顯影。采用p-GSK3β與β-actin的吸光度比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（Means±SEM）表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）的Dunnett’s檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.13 種復(fù)方對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間影響見圖1。

圖1 3種復(fù)方給藥2周內(nèi)對(duì)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間影響

3.23 種復(fù)方對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間影響見圖2。

圖2 3種復(fù)方給藥2周內(nèi)對(duì)小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間影響

3.33 種復(fù)方對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)影響見表1。

表1 3種復(fù)方對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)影響（Means±SEM）次

3.43 種復(fù)方對(duì)小鼠海馬區(qū)p-GSK3β表達(dá)影響見圖3。

圖3 3種復(fù)方給藥2周后對(duì)小鼠海馬區(qū)p-GSK3β表達(dá)影響

4 討論

天王補(bǔ)心丹在懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中均表現(xiàn)出改善抑郁絕望狀態(tài)的效果，并能顯著增加小鼠海馬p-GSK3β的表達(dá)，說明天王補(bǔ)心丹有很好的抗抑郁作用，其作用機(jī)制可能與影響海馬p-GSK3β的表達(dá)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟趯?duì)3種可能有抗抑郁效果的中藥復(fù)方進(jìn)行初篩，因此沒有采用慢性應(yīng)激模型，而是直接采用對(duì)正常小鼠給藥并對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)方法測(cè)定來初步斷定藥物是否有抗抑郁效果。懸尾試驗(yàn)是Stem等［14］介紹的一種較為簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)抗抑郁藥物效果的實(shí)驗(yàn)方法。在某些實(shí)驗(yàn)中，小鼠在不可逃避的應(yīng)激條件下，表現(xiàn)出的不動(dòng)狀態(tài)反映了放棄求生動(dòng)作的絕望行為，這種絕望行為可模擬出人類的抑郁狀態(tài)。根據(jù)此原理，研究者采用小鼠懸尾試驗(yàn)，從而復(fù)制出小鼠的絕望行為模型，用以評(píng)價(jià)抗抑郁藥物的作用。懸尾試驗(yàn)?zāi)苤苯臃从承∈蟮捏w能狀態(tài)和激惹和絕望程度，也可間接反映小鼠的情志如肝氣肝火盛衰、氣虛程度。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)是Porsolt等人［15］介紹的一種比較直觀評(píng)價(jià)抗抑郁藥物的試驗(yàn)方法。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^小鼠靜止時(shí)間直觀地反映小鼠的體能和絕望程度，也是一種評(píng)價(jià)小鼠虛證乏力狀態(tài)的理想試驗(yàn)方法。本研究測(cè)試中發(fā)現(xiàn)：3種復(fù)方均有一定程度的抗抑郁效應(yīng)，并且從第1周就開始有效，其中血府逐瘀湯和天王補(bǔ)心湯作用優(yōu)于解郁合歡湯，而天王補(bǔ)心丹在懸尾試驗(yàn)中表現(xiàn)出了顯著的抗抑郁作用優(yōu)勢(shì)，可篩選為進(jìn)一步研究的抗抑郁藥物。為了避免假陽性結(jié)果，我們還進(jìn)行了小鼠曠場(chǎng)試驗(yàn)以驗(yàn)證藥物對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)沒有影響，說明其不動(dòng)時(shí)間的縮短并非藥物的中樞興奮作用引起的。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）被視為神經(jīng)可塑性的標(biāo)志［16］，可促進(jìn)神經(jīng)元的成長(zhǎng)和分化，并參與調(diào)控神經(jīng)元形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的整個(gè)過程，是抑郁癥發(fā)病和治療的關(guān)鍵因素。隨著對(duì)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的深入研究，新近在BDNF相關(guān)信號(hào)通路研究中，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的作用越來越受到矚目。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥死亡患者大腦前額皮層的GSK3β活性升高，并伴隨Akt活性的降低［17］；臨床上能夠升高大腦5-HT水平的抗抑郁藥例如單胺氧化酶抑制劑、氟西汀、丙咪嗪還有5-HT本身能夠增強(qiáng)GSK3β的磷酸化；基因阻斷小鼠抑制GSK3β磷酸化過程可抵消抗抑郁藥氟西汀的促神經(jīng)元再生作用［18］；雜合子GSK3β敲除小鼠在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和懸尾試驗(yàn)中表現(xiàn)出抗抑郁樣行為［19］；選擇性GSK3β抑制劑能在抑郁癥動(dòng)物模型上產(chǎn)生抗抑郁作用并促進(jìn)神經(jīng)元再生［20－21］。這些都預(yù)示著這一機(jī)制在抗抑郁藥物治療過程中可能起著相關(guān)作用，GSK3β有可能成為抗抑郁治療的重要潛在的靶標(biāo)。因而近年來圍繞與GSK3β相關(guān)的抑郁細(xì)胞信號(hào)通路也越來越受到研究者的關(guān)注，主要有兩種信號(hào)通路：Wnt／GSK3β／β-catenin信號(hào)通路和PI3K／AKt／GSK3β信號(hào)通路，其中p-GSK3β可抑制GSK3β的活性，使BDNF表達(dá)增強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)擬在行為學(xué)篩選的基礎(chǔ)上探索藥物的抗抑郁機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)3種復(fù)方對(duì)小鼠海馬p-GSK3β表達(dá)均有增強(qiáng)，以天王補(bǔ)心丹作用最為顯著。因此我們得出結(jié)論：天王補(bǔ)心丹有較好的抗抑郁效應(yīng)，其抗抑郁機(jī)制可能與GSK3β信號(hào)通路有關(guān)。

［1］BELMAKER R H，AGAM G.Major depressive disorder［J］.N Engl J Med，2008，358（1）：55-68.

［2］BIRMES P，COPPIN D，SCHMITT L，et al.Serotonin syndrome：a brief review［J］.CMAJ，2003，168（11）：1439-1442.

［3］BOYER E W，SHANNON M.The serotonin syndrome［J］.N Engl J Med，2005，352（11）：1112-1120.

［4］邵文虎.解郁合歡湯治療抑郁癥舉隅［J］.河北中醫(yī)，1996，18（5）：33-34.

［5］李繼娥.名方“血府逐瘀湯”臨床應(yīng)用研究［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9（11）：2.

［6］葉琳.天王補(bǔ)心丹臨床應(yīng)用研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（2）：507-508.

［7］李青，聶皎.抑郁癥中醫(yī)病機(jī)再認(rèn)識(shí)［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2013，34（8）：85.

［8］張光茹，孫巧，王界成，等.解郁合歡湯治療抑郁癥的臨床觀察［J］.青海醫(yī)藥雜志，2009，39（8）：84-85.

［9］孫燕霞，李淑萍.活血化瘀法治療腦卒中抑郁臨床療效觀察［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2013，8（9）：89，111.

［10］范海燕.產(chǎn)后抑郁癥中西醫(yī)結(jié)合治療的研究［J］.醫(yī)學(xué)信息，2011，24（2）：772-773.

［11］謝鳴.方劑學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社.2016：206，240.

［12］WANG Y L，WANG J X，HU X X，et al.Antidepressant-like effects of albiflorin extracted from Radix paeoniae Alba［J］.J Ethnopharmacol，2016（179）：9-15.

［13］WANG Q S，DING S L，MAO H P，et al.Antidepressant-like effect of ethanol extract from Zuojin Pill，containing two herbal drugs of Rhizoma Coptidis and Fructus Evodiae，is explained by modulating the monoaminergic neurotransmitter system in mice［J］. J Ethnopharmacol，2013，148（2）：603-609.

［14］STERU L，CHERMAT R，THIERRY B，et al.The tail suspension test：a new method for screening antidepressants in mice［J］. Psychopharmacology（Berl），1985，85（3）：367-370.

［15］PORSOLT R D，LE PICHON M，JALFRE M.Depression：a new animal model sensitive to antidepressant treatments［J］.Nature，1977，266（5604）：730-732.

［16］CALABRESE F，MOLTENI R，RACAGNI G，et al.Neuronal plasticity：a link between stress and mood disorders［J］.Psychoneuroendocrinology，2009，34（Suppl 1）：S208-216.

［17］KAREGE F，PERROUD N，BURKHARDT S，et al.Alteration in kinase activity but not in protein levels of protein kinase B and glycogen synthase kinase-3beta in ventral prefrontal cortex of depressed suicide victims［J］.Biol Psychiatry，2007，61（2）：240-245.

［18］EOM T Y，JOPE R S.Blocked inhibitory serine-phosphorylation of glycogen synthase kinase-3alpha／beta impairs in vivo neural precursor cell proliferation［J］.Biol Psychiatry，2009，66（5）：494-502.

［19］BEAULIEU J M，MARION S，RODRIGUIZ R M，et al.A betaarrestin 2 signaling complex mediates lithium action on behavior［J］.Cell，2008，132（1）：125-136.

［20］KAIDANOVICH-BEILIN O，MILMAN A，WEIZMAN A，et al. Rapid antidepressive-like activity of specific glycogen synthase kinase-3 inhibitor and its effect on beta-catenin in mouse hippocampus［J］.Biol Psychiatry，2004，55（8）：781-784.

［21］LANGE C，MIX E，F(xiàn)RAHM J，et al.Small molecule GSK-3 inhibitors increase neurogenesis of human neural progenitor cells［J］. Neurosci Lett，2011，488（1）：36-40.

R285.5

A

1000-338X（2017）04-0031-03

2017－03－10

福建省教育廳中青年教育科研項(xiàng)目課題（JAT160235）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題（X2015026）

賈銣（1978—），女，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥神經(jīng)精神藥理學(xué)研究。

王玉露（1975—），女，醫(yī)學(xué)博士，副教授。E-mail：luoyang5466@163.com