懸尾應(yīng)激對小鼠空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的損傷效應(yīng)

王曉琴, 王功伍, 段秋燕, 滕仕通

(1. 云南師范大學 體育學院，云南 昆明 650500; 2. 云南師范大學 生命科學學院行為與認知神經(jīng)生物學實驗室，云南 昆明 650500; 3. 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心和云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明 650500)

懸尾應(yīng)激對小鼠空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的損傷效應(yīng)

王曉琴1, 王功伍2,3,*, 段秋燕2, 滕仕通2

(1.云南師范大學 體育學院，云南 昆明650500; 2.云南師范大學 生命科學學院行為與認知神經(jīng)生物學實驗室，云南 昆明650500; 3.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心和云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室，云南 昆明650500)

該文探討了連續(xù)數(shù)天短時懸尾應(yīng)激對小鼠十字迷宮空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的作用。81只成年雄性昆明小鼠被分為4大組：絕對空間記憶獲得組及鞏固組; 相對空間記憶獲得組及鞏固組。每大組又分為懸尾組(每天訓(xùn)練前或訓(xùn)練后立即接受懸尾處理20 min)和對照組。結(jié)果表明, 在空間記憶訓(xùn)練初期, 各對照組和懸尾組動物正確反應(yīng)率無明顯差異, 均在機遇水平; 隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加, 對照組成績顯著提高, 當其正確反應(yīng)率達到80%時, 懸尾組正確反應(yīng)率仍處于或略高于機遇水平, 兩組間差異顯著(P＜ 0.01); 在反轉(zhuǎn)學習中, 懸尾組正確反應(yīng)率也顯著低于對照組(P＜ 0.01)。這些表明，懸尾應(yīng)激可顯著損傷小鼠的空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的獲得和鞏固, 其中相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的鞏固受損尤為嚴重。

懸尾應(yīng)激; 空間記憶; 反轉(zhuǎn)學習; 獲得; 鞏固; KM小鼠

懸尾(tail suspension)處理可使動物處于無法擺脫的應(yīng)激狀態(tài), 易出現(xiàn)行為絕望, 與人類的抑郁癥表現(xiàn)類似, 并對很多抗抑郁藥敏感, 故與強迫游泳一起成為篩選抗抑郁藥物最常用的動物行為模型(Cryan et al, 2005; Seong et al, 2002)。懸尾處理同其他應(yīng)激方式一樣, 可通過各個感覺通道和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamus- pituitary- adrenal cortex axis, HPA軸)產(chǎn)生廣泛的心理、生理應(yīng)激效應(yīng)(Cui et al, 2008), 但懸尾處理有其獨特之處, 即可使動物的體液(尤其是血液)頭向分布。人在大部分時間里處于坐、立位狀態(tài), 循環(huán)系統(tǒng)已經(jīng)適應(yīng)了在地球重力作用下, 體液腳向集中的情形, 并升高血壓以保證頭部血液的供應(yīng)。航天員進入太空后, 處于失重狀態(tài), 其所受重力接近于零, 此時，1.5～2L的體液會迅速從下肢轉(zhuǎn)移到頭胸部, 并引發(fā)一系列的感覺神經(jīng)活動改變和心血管反應(yīng)(Wu & Shen, 2000)。動物在懸尾后頭部下垂, 軀體受重力作用方向改變, 導(dǎo)致體液向頭部轉(zhuǎn)移, 故懸尾動物體液分布改變狀況與處于失重狀態(tài)下的人相似, 可作為研究人體失重的動物模型 (Chen et al, 1993; Morey-Holton & Globus, 2002; Morey-Holton & Wronski, 1981)。雖然空間飛行可直接提供失重環(huán)境, 但又伴隨噪聲、機械振動、宇宙射線、人際交往等因素的干擾。因此，很難研究失重等單一影響因素的效應(yīng)。懸尾處理為此提供了可行的地面失重模型。

單次懸尾處理20 min可模擬急性失重, 主要通過影響動物的神經(jīng)和心血管系統(tǒng)功能發(fā)揮其應(yīng)激效應(yīng)。有報告指出, 單次懸尾處理20 min可明顯提升小鼠血液中糖皮質(zhì)激素的水平并使之持續(xù)20 min不降低, 其情緒記憶獲得在懸尾后短時受損。單獨使用多巴胺D1受體拮抗劑SCH23390可損傷情緒記憶獲得, 但與懸尾處理同時使用卻可改善懸尾對情緒記憶獲得的損傷效應(yīng), 說明多巴胺D1受體參與了懸尾應(yīng)激的記憶損傷效應(yīng) (Wang et al, 2005, 2007)。但該種懸尾處理方式對空間記憶各過程的影響還未被深入系統(tǒng)地研究。本研究擬采用相似的懸尾處理方法(每天訓(xùn)練前或訓(xùn)練后，懸尾20 min), 探討懸尾應(yīng)激對絕對和相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習獲得和鞏固過程的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

81只雄性昆明(KM)小鼠, 購自成都達碩生物科技有限公司, 生產(chǎn)許可證編號：SCXK(川)2008-24。小鼠購入時為4周齡, 體重18～25 g。小鼠分籠飼養(yǎng), 每籠(組)10～11只, 自由飲水。動物總共分4大組, 分別為絕對空間記憶獲得組及鞏固組和相對空間記憶獲得組及鞏固組。根據(jù)是否接受懸尾處理每大組動物又分為對照組及懸尾組。正式實驗前適應(yīng)1周, 實驗者每天撫摸、抓握小鼠數(shù)次。飼養(yǎng)間保持12 h / 12 h的明暗周期變化(明亮期：7：00 —19:00), 室溫保持在(22 ± 1) ℃。所有行為訓(xùn)練均在每天明亮期同一時間進行。適應(yīng)期動物自由取食(標準飼料購自蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司)。正式實驗時, 行為訓(xùn)練完成后單獨定量喂食, 控制小鼠的體重為自由取食狀態(tài)下的90%左右。所有實驗過程均遵照國務(wù)院《實驗動物管理條例》(1998)和《云南省實驗動物管理條例》(2007)以及美國國立健康研究院《實驗動物使用和照管指南》執(zhí)行。

1.2 動物空間記憶作業(yè)

1.2.1 實驗裝置 所有空間記憶作業(yè)均使用一木制十字形迷宮進行。該迷宮放置于距離地面50 cm的平臺上, 每臂長30 cm, 寬5 cm, 高12 cm, 四臂中央?yún)^(qū)為5 cm × 5 cm的正方形。四臂末端內(nèi)側(cè)1.5 cm處均裝有直徑 3 cm, 高 1 cm的圓筒狀塑料食槽(圖1)。迷宮正上方懸掛有兩盞40 W日光燈用于照明。實驗期間, 迷宮位置不變, 周圍分布的門窗、實驗臺、實驗桌和藥品柜用作空間記憶參照物。

圖1 十字迷宮空間記憶作業(yè)流程圖Fig. 1 The flow diagram of the spatial memory tasks in plus maze

1.2.2 訓(xùn)練方法 根據(jù)空間信息性質(zhì)的不同, 我們設(shè)計了絕對空間記憶作業(yè)和相對空間記憶作業(yè)。在絕對空間記憶作業(yè)中, 固定迷宮的一臂為目標臂(東側(cè)臂), 其臂端食槽內(nèi)放置新鮮去皮向日葵籽作為獎勵, 其余三臂為起始臂, 其臂端無食(圖1A)。每天訓(xùn)練10次(采用半隨機表法確定10次訓(xùn)練中起始臂的順序), 當對照組動物連續(xù)兩天在作業(yè)中的正確反應(yīng)率保持在80 %以上(即在10次訓(xùn)練中有8次以上動物能進入目標臂并獲得食物獎勵)時, 對照組和懸尾組動物均停止訓(xùn)練。然后改對側(cè)臂為目標臂(西側(cè)臂), 其余三臂為起始臂, 照以上方法繼續(xù)進行訓(xùn)練, 當對照組動物在作業(yè)中達到80 %的正確反應(yīng)率標準時, 兩組動物均停止訓(xùn)練, 此即絕對空間反轉(zhuǎn)學習作業(yè)。在相對空間反轉(zhuǎn)學習作業(yè)中,起始臂不固定(采用半隨機表法確定10次訓(xùn)練中起始臂的順序), 且每次訓(xùn)練均須動物從起始臂出發(fā)后向右轉(zhuǎn)才能到達目標臂獲得食物獎勵(即正確反應(yīng)), 即目標臂總是起始臂的右側(cè)臂, 起始臂改變了,目標臂也就跟著改變(圖1B)。每天訓(xùn)練10次, 當對照組動物連續(xù)兩天在作業(yè)中的正確反應(yīng)率保持在80%以上時, 對照組和懸尾組動物均停止訓(xùn)練; 然后，改變目標臂與起始臂的相對位置(目標臂改為起始臂的左側(cè)臂), 動物須從起始臂出發(fā)后向左轉(zhuǎn)才能到達目標臂并獲得食物獎勵(即正確反應(yīng)), 此為相對空間反轉(zhuǎn)學習作業(yè)。當對照組動物在作業(yè)中達到80 %的正確反應(yīng)率時, 對照組和懸尾組動物均停止訓(xùn)練。動物在迷宮中每完成一次作業(yè), 即用酒精棉球擦拭迷宮中央?yún)^(qū), 以消除氣味影響。由于各組動物訓(xùn)練任務(wù)和處理不同, 所以訓(xùn)練天數(shù)也不盡相同。

1.2.3 懸尾應(yīng)激方法 每天同一時間將懸尾組小鼠尾部懸掛于1.5 m高的木質(zhì)橫梁上持續(xù)20 min(圖1C), 對照組小鼠僅接受相應(yīng)的操作動作, 但未受實際的懸尾處理。觀察懸尾處理對記憶獲得的影響時, 懸尾后立即進行行為訓(xùn)練; 觀察其對記憶鞏固的影響時, 則每天在行為訓(xùn)練結(jié)束后立即進行懸尾;觀察其對反轉(zhuǎn)學習的獲得或鞏固時, 則分別在反轉(zhuǎn)學習訓(xùn)練之前或之后進行懸尾。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

空間記憶作業(yè)正確次數(shù)的組間(懸尾處理動物與其對照組)比較均采用非配對樣本t-檢驗(unpaired samplest-test)。動物訓(xùn)練成績隨訓(xùn)練時間的變化采用重復(fù)測量的雙因子方差分析(two-way ANOVA with repeated measure)進行比較。所有比較均以P＜0.05為差異顯著標準。

2 結(jié) 果

2.1 懸尾處理小鼠的總體行為表現(xiàn)

動物在懸尾過程開始時, 掙扎激烈, 幾分鐘后,活動量減少，甚至不再有明顯的肢體動作。懸尾過程中及之后, 多數(shù)小鼠排糞、排尿等應(yīng)激反應(yīng)明顯增加。經(jīng)連續(xù)5～7 d的20 min懸尾處理之后, 懸尾各組多數(shù)動物幾乎不再出現(xiàn)明顯的掙扎現(xiàn)象, 放回鼠籠后，其活躍程度明顯低于對照組, 食量下降。

2.2 懸尾處理對小鼠絕對空間記憶的影響

在訓(xùn)練初期約1周左右(5～8 d)的時間內(nèi), 各懸尾組和其對照組的空間記憶成績均處于隨機水平(正確次數(shù)在3、4次左右), 未見明顯差異(非配對樣本t-檢驗：P＞ 0.05); 之后對照組動物的記憶成績隨訓(xùn)練時間的延長而顯著提高, 懸尾組動物的成績或呈略有提高或停滯不前, 與其對照組相比差異顯著(非配對樣本t-檢驗：P＜ 0.05; 重復(fù)測量的雙因子方差分析：懸尾主效應(yīng),P＜ 0.01; 訓(xùn)練主效應(yīng),P＜0.01; 懸尾×訓(xùn)練交互效應(yīng),P＜ 0.01)(圖2, 圖3)。以上數(shù)據(jù)表明, 懸尾處理可損傷小鼠絕對和相對空間記憶的獲得和鞏固過程。

2.3 懸尾處理對小鼠空間反轉(zhuǎn)學習的影響

對照組動物在絕對和相對空間反轉(zhuǎn)學習作業(yè)中的成績經(jīng)2～3 d訓(xùn)練后迅速提高, 懸尾組動物的成績停滯不前。從第2～3 d開始, 各懸尾組與對照組的成績出現(xiàn)顯著差異(非配對樣本t-檢驗：P＜0.05; 重復(fù)測量的雙因子方差分析：懸尾主效應(yīng),P＜0.01; 訓(xùn)練主效應(yīng),P＜ 0.01; 懸尾×訓(xùn)練交互效應(yīng),P＜ 0.01)(圖2, 圖3)。以上數(shù)據(jù)表明, 懸尾處理可損傷小鼠絕對和相對空間反轉(zhuǎn)學習的獲得和鞏固過程。

3 討 論

3.1 懸尾處理損傷空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的獲得和鞏固過程

圖2 懸尾處理對小鼠十字迷宮絕對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習作業(yè)成績的影響Fig. 2 The effects of tail suspension on the performance of absolute spatial memory and its reversal learning task in a plus maze in mice

圖3 懸尾處理對小鼠十字迷宮相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習作業(yè)成績的影響Fig. 3 The effects of tail suspension on the performance of relative spatial memory and its reversal learning task in a plus maze in mice

本研究結(jié)果證明, 連續(xù)每天短時高空懸尾應(yīng)激(20 min)可致小鼠絕對和相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的獲得和鞏固過程顯著受損, 其中相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的鞏固過程的受損更為嚴重。懸尾動物的成績雖然明顯低于對照組, 但隨著訓(xùn)練也有所提高(在相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的鞏固過程中成績未見明顯提高), 說明懸尾動物的學習記憶功能處在相對緩慢的恢復(fù)過程中。在連續(xù)每天短時高空懸尾處理過程中, 動物可能會逐漸適應(yīng)這種懸尾處理, 但能否完全恢復(fù)正常尚屬未知。Wang et al (2005, 2007)采用一次性步入法發(fā)現(xiàn)使用同樣的懸尾處理方法, 經(jīng)單次高空懸尾處理20 min可導(dǎo)致被動回避行為, 即情緒記憶獲得功能受損, 若懸尾處理后休息20 min后再測試, 則未見情緒記憶受損,說明單次懸尾的記憶損傷效應(yīng)是暫時的、可逆的；但從本研究結(jié)果來看, 連續(xù)多天每天短時高空懸尾應(yīng)激造成的記憶損傷效應(yīng)可能因涉及的記憶過程、記憶信息類型不同而異。似乎相對空間記憶及其反轉(zhuǎn)學習的鞏固過程對懸尾處理更敏感一些。至于機體能否恢復(fù)正常, 取決于機體的適應(yīng)調(diào)整能力能否消除損傷的累積效應(yīng)。

本研究中一個值得注意的現(xiàn)象是, 在空間記憶訓(xùn)練初期約1周左右(5～8 d)的時間內(nèi), 各懸尾組和其對照組的空間記憶成績均處于隨機水平, 之后對照組動物成績迅速提高, 兩組之間拉開差距; 而在反轉(zhuǎn)學習訓(xùn)練的第2～3 d開始, 對照組動物的成績就已經(jīng)顯著高于懸尾組。最可能的一個原因是, 在訓(xùn)練初期, 對照組動物要適應(yīng)訓(xùn)練規(guī)則, 并建立相應(yīng)的行為反應(yīng)策略和記憶的“空間認知地圖”, 這可能需要較長的時間(大約1 周); 而在反轉(zhuǎn)學習中,由于動物已在空間記憶訓(xùn)練中建立有效的反應(yīng)策略, 反轉(zhuǎn)學習無須改變策略, 只需要調(diào)整反應(yīng)方向即可, 故可迅速作出調(diào)整。

3.2 懸尾處理與失重的記憶損傷效應(yīng)

經(jīng)典的頭低位失重模型的應(yīng)激作用較小, 主要用于探討人類失重(下肢不負重)的長期效應(yīng) (Chen et al, 1993; Shen et al, 1989; Wu et al, 2000)。Wu et al (2000)使用矩形水迷津和跳臺實驗發(fā)現(xiàn)頭低位懸尾模擬失重7 d或12 d可損傷小鼠絕對空間記憶、被動回避學習, 而懸尾5 h則未見損傷效應(yīng)。另有報告指出, 頭低位懸尾模擬失重7 d可造成大鼠分辨學習(Y-迷宮)和被動回避學習(避暗法)的明顯損傷,這種損傷在模擬失重結(jié)束后經(jīng)3 d的恢復(fù)仍未見明顯改善 (Sun et al, 2009; Xu et al, 2005)。這些研究均提示, 長期失重可造成動物的學習和記憶損傷, 但短時間的頭低位懸尾不會造成損傷。

以上模擬失重的方法與本研究采用的方法有所不同, 不同之處在于, 首先，前者采用大鼠或小鼠前肢著地、后肢離地，保持頭部 ～ 30°下傾的懸尾倒立連續(xù)數(shù)天的方法(Chen et al, 1993); 而本研究和Wang et al (2005, 2007)采用的是頭下尾上完全垂直的懸尾方法, 在更高的凈水壓力下, 會有更多體液向頭胸部集中, 從而導(dǎo)致動物更強烈的應(yīng)激。這也可能是本研究懸尾20 min即可致記憶損傷, 而Wu et al (2000)懸尾5 h未見記憶損傷的主要原因。其次, 本研究采用的是每天僅懸尾處理20 min, 而前者則是全天24 h一直給予懸尾處理。長時記憶主要分為三個階段, 即獲得、鞏固和提取。前人的研究主要關(guān)注長期懸尾對學習和記憶的總體效應(yīng), 但不能說明其主要影響學習和記憶的哪個過程。而本研究則明確表明, 急性懸尾應(yīng)激至少可損傷空間長時記憶及其反轉(zhuǎn)學習的獲得和鞏固, 但是否影響已鞏固記憶的提取過程尚需進一步探討。

3.3 懸尾處理損傷記憶的可能機制

懸尾處理可引發(fā)機體生理和心理的各種急慢性應(yīng)激反應(yīng)。急性應(yīng)激可通過HPA軸導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素釋放增加, 并使交感神經(jīng)興奮, 腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)也會一過性的釋放增加, 但GABA的釋放減少,并涉及相應(yīng)的受體 (Arnsten, 2009; Elzinga et al, 2005; Haggstrom et al, 1984; Mitsushima et al, 2008; Roozendaal et al, 2009; Tollenaar et al, 2008; Yuen et al, 2009)。慢性應(yīng)激則可通過引發(fā)相關(guān)的基因表達以及神經(jīng)元形態(tài)學的改變對包括學習和記憶在內(nèi)的神經(jīng)功能產(chǎn)生損傷作用(Lee et al, 2009; Mcewen, 2001; Mizoguchi et al, 2000)。以上應(yīng)激效應(yīng)也可在懸尾倒立模擬失重的動物或航天飛行動物上觀察到(Cui et al, 2008; Sun et al, 2006, 2009; Zheng et al, 2008)。與其它應(yīng)激方式不同, 懸尾處理可通過體位的轉(zhuǎn)換, 使動物全身體液在重力的作用下發(fā)生頭向再分配, 繼而引發(fā)強烈的心血管反應(yīng), 并改變?nèi)碛绕涫悄X部血液循環(huán)、血液流變性以及血管、神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變(Bi et al, 2004; Meng et al, 1997; Shen et al, 1989; Wu & Shen, 2000)。同時，體位的改變可干擾前庭等感覺器官、運動等系統(tǒng)的功能,使空間定向、運動知覺以及運動平衡、協(xié)調(diào)等能力受到損傷 (Shen, 2003; Yang & Shen, 2003)。除此之外, 在本研究中還觀察到動物活動減少、食量降低的現(xiàn)象, 但不能確定此為懸尾應(yīng)激的結(jié)果還是懸尾間接導(dǎo)致記憶損傷的原因之一?？偟恼f來, 懸尾處理造成的影響與一般應(yīng)激方式有相似之處, 但也有很多不同的地方, 是一種獨特的應(yīng)激方式。懸尾處理可能通過以上過程導(dǎo)致應(yīng)激, 繼而影響學習和記憶等認知功能。

致謝：云南師范大學生命科學學院2003級的汪和、王浩行和王偉花同學曾參與部分動物行為訓(xùn)練和數(shù)據(jù)收集等工作, 在此對他們的辛勤付出表示衷心的感謝！

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Impairment effects of tail suspension stress on spatial memory and its reversal learning in mice

WANG Xiao-Qin1, WANG Gong-Wu2,3,*, DUAN Qiu-Yan2, TENG Shi-Tong2

(1. School of Physical Education, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China; 2. Laboratory of Behavioral and Cognitive Neurobiology, School of Life Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650500, China; 3. Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass, Ministry of Education & Key Laboratory of Yunnan for Biomass Energy and Biotechnology of Environment, Kunming 650500, China)

Present work investigated the effects of tail suspension stress (TSS) on spatial memory acquisition, consolidation, and its reversal learning in mice. Eighty-one adult male KM mice were divided into four groups (each group including a TSS subgroup and its control subgroup): absolute spatial memory acquisition and consolidation groups (group AA and CA); relative spatial memory acquisition and consolidation groups (group AR and CR). TSS (20 min) was performed immediately before (acquisition) or after (consolidation) a daily training. Results showed that there was no significant difference between control animals and TSS animals in each group in early spatial memory training days (5-8 d of training). Along with training, the performance of control animals improved significantly, but the performance of TSS animals improved slightly (group AA, CA and AR) or even did not change (group CR) (P＜ 0.01). Reversal learning was also impaired in TSS animals (P＜ 0.01). The results indicated that TSS could impair spatial memory acquisition, consolidation and reversal learning (especially the relative spatial memory consolidation and its reversal learning) in mice.

Tail suspension stress; Spatial memory; Reversal learning; Acquisition; Consolidation; KM mice

Q189; Q427

A

0254-5853-(2011)04-0428-07

10.3724/SP.J.1141.2011.04428

2011-06-05；接受日期：2011-06-28

中國科學院“西部之光”人才培養(yǎng)計劃項目(2008);云南省運動人體科學實驗教學示范中心建設(shè)項目(2009);國家自然科學基金項目(31060142)

?通訊作者(Corresponding author)，王功伍, Tel: +86-871-5516068, Fax: +86-871-5516759, E-mail: waov@tom.com

王曉琴（1978－），碩士，講師，主要從事運動生理學和神經(jīng)生物學研究；E-mail: xiaoqinwang2001@yahoo.com.cn