土貝母皂苷乙誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究*

陳洋洋王瑞莉王 斌晁 旭△

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽712000）

土貝母皂苷乙誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡的研究*

陳洋洋1，2王瑞莉1王 斌1晁 旭1，2△

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽712000）

目的 觀察土貝母皂苷乙對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用并探討誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制。方法 用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞的活力；MTT法檢測土貝母皂苷乙對(duì)細(xì)胞的抑制率；Hoechst33342/PI熒光雙染法觀察細(xì)胞的形態(tài)；用流式細(xì)胞儀檢測土貝母皂苷乙對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果 土貝母皂苷乙能顯著抑制A549細(xì)胞的增殖，24 h的IC50為13.37 μg/mL，48 h的IC50為10.99 μg／mL，并且呈時(shí)間和劑量依賴性。Hoechst33342/PI熒光雙染法觀察到經(jīng)土貝母皂苷乙處理的細(xì)胞核皺縮、染色體聚集，核破裂形成小體，呈現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象。FCM分析結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞的凋亡率依次升高，從4.56%增加至17.62%。該研究表明土貝母皂苷乙能顯著促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。結(jié)論 土貝母皂苷乙能誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞凋亡。

土貝母皂苷乙 A549細(xì)胞 凋亡

據(jù)GLOBOCAN2012報(bào)道，肺癌的發(fā)病率與病死率位居癌癥首位，全世界有182萬人為肺癌新發(fā)的病例，約占全部腫瘤的13%，有159萬死亡病例，占19.4%［1］。土貝母味甜微苦、辛，性涼，歸肺、脾經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、祛痰利濕之功，能夠治療癰腫毒瘡、瘰疬痰核、乳癰等。研究者從土貝母中提取分離出了皂苷、甾醇類、生物堿、有機(jī)酸、糖類等物質(zhì)。其中主要活性成分是皂苷類，有16種皂苷被分離出來，研究最多的是皂苷甲、乙、丙、丁、戊［2-7］。翁昔陽等用土貝母苷甲作用鼻咽癌細(xì)胞（CNE-2Z），發(fā)現(xiàn)苷甲能使CNE-2Z細(xì)胞的基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)及使Bax表達(dá)升高，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。據(jù)胡章等報(bào)告土貝母皂苷甲能抑制人早幼粒白血病細(xì)胞，使cyclin B1的表達(dá)降低［9］。劉姬艷等研究報(bào)告土貝母皂苷甲對(duì)K562有著誘其分化的作用［10］。晁旭等研究土貝母皂苷乙作用于肝癌（HepG2）細(xì)胞后，能將腫瘤細(xì)胞滯留于G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長［11-12］。楊萍等［13］報(bào)道土貝母皂苷（含苷甲79%，苷乙21%）能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的生長，24 h的IC50值是20.0 μmol/L，流式結(jié)果顯示能將Hela細(xì)胞阻滯在G2/M期。在濃度40 μmol/L處理時(shí)，細(xì)胞形態(tài)明顯變化，出現(xiàn)核皺縮、核染色質(zhì)凝集邊聚等凋亡現(xiàn)象。據(jù)王長秀等報(bào)告，土貝母皂苷甲能抑制肺癌PGCL3的部分能力［14］。Yu TX報(bào)告土貝母皂苷甲、皂苷乙、皂苷丙都有抗炎、抗腫瘤及抗促瘤的能力，土貝母皂苷乙抑制腫瘤的作用比皂苷甲強(qiáng)，且急性毒性小于皂苷甲［15］。但是有關(guān)土貝母皂苷乙對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抑制作用及其機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。本研究的目的是探討土貝母皂苷乙對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制作用及誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制，為將土貝母皂苷乙開發(fā)成治療非小細(xì)胞肺癌的制劑提供理論依據(jù)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.2 藥物和試劑 土貝母皂苷乙購買于寶雞市晨光生物技術(shù)有限公司，純度99.99%。RPMI Medium-1640培養(yǎng)基、MTT試劑盒、胎牛血清購買于北京solarbio生物科技有限公司，細(xì)胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒、細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒購買自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 A549細(xì)胞株的培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞株，迅速放置在37℃水浴箱中，至細(xì)胞完全溶解。然后將細(xì)胞凍存管用75%酒精擦拭，移至超凈臺(tái)上，用巴氏吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，并加入10倍體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，1000 r/min離心8 min。棄上清液，使細(xì)胞重懸于10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)移至50 mL培養(yǎng)瓶中，輕搖均勻后放于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化后制成濃度為5×104個(gè)的單細(xì)胞懸液，取180 μL，分別加入96孔培養(yǎng)板中，于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，分別在加入20 μL相應(yīng)質(zhì)量濃度的土貝母皂苷乙，使培養(yǎng)液中最終藥物質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、60 μg/mL。對(duì)照組加入200 μL培養(yǎng)液。每個(gè)濃度分別安排設(shè)5個(gè)孔作為復(fù)孔。培養(yǎng)24、48 h后，棄去原有培養(yǎng)液后，每孔加入90 μL新鮮的培養(yǎng)液及10 μL MTT溶液，吹吸混勻。4 h之后，吸凈每孔中的上清液，再加入110 μL的Formazan溶解液，在搖床上晃動(dòng)10 min，使晶體充分溶解。采用RF-6100酶標(biāo)分析儀，在波長為490 nm下測定吸光值（OD值）。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)并計(jì)算平均值，用抑制率 （%）＝［（對(duì)照組平均OD值-處理組平均OD值）/對(duì)照組平均OD值］×100%的公式計(jì)算抑制率，并繪制細(xì)胞生長抑制曲線圖，計(jì)算出半數(shù)致死量的濃度（IC50）。

1.5 熒光雙染檢測 取滅菌后的蓋玻片，置于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，按2 mL/孔接種于6孔板中。24 h后，每孔分別加入體積為0.222 mL的土貝母皂苷乙，最終濃度為5、10、20、40和60 μg／mL；對(duì)照組加入同樣的培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h后，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量Hoechst33342染液，10 min后棄去染色液，用PBS洗2遍，再加入適量PI染液處理10 min后，PBS輕輕洗細(xì)胞1次。然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率 將A549細(xì)胞懸液按每孔1×106個(gè)/mL接種于6孔板培養(yǎng)板中，至對(duì)數(shù)生長期，加入相應(yīng)濃度土貝母皂苷苷乙溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌后，離心，加入150 μL緩沖液混勻，使其濃度為1×106個(gè)/mL。加入2.5 μL AnnexinV-FITC混勻避光10 min，然后加入5 μL PI，用流式細(xì)胞儀（EpicsXL-MCL）檢測其凋亡率，分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測結(jié)果 見圖1，圖2，表1。在5、10、20、40、60 μg/mL質(zhì)量濃度時(shí)，土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞的抑制率分別為28.2%、39.7%、56.3%、78%、88.5%；對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率分別為明顯高于對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率，說明A549細(xì)胞比Hela細(xì)胞21.9%、33.1%、41.7%、61.4%、65.3%。該結(jié)果顯示A549細(xì)胞比Hela細(xì)胞對(duì)土貝母皂苷乙更加敏感。MTT檢測結(jié)果顯示，土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞的IC50為13.37 μg/mL，對(duì)Hela細(xì)胞的IC50為25.78 μg/mL，說明土貝母皂苷乙誘導(dǎo)前者凋亡的能力比后者的強(qiáng)。土貝母皂苷乙作用A549細(xì)胞24 h的IC50為13.37 μg/mL，48 h的IC50為10.99 μg/mL。與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞的生長有抑制作用，且呈明顯的時(shí)間依賴及劑量依賴性。

2.2 熒光雙染檢測結(jié)果 見圖3。從圖3中，可以看出對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核比較完整，呈均勻的分布，經(jīng)土貝母皂苷乙處理的細(xì)胞核皺縮、染色體聚集，核破裂形成小體。凋亡現(xiàn)象較明顯，初步可判斷這一典型的凋亡特征能通過土貝母皂苷乙誘導(dǎo)產(chǎn)生。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率的結(jié)果 見表2，圖4～5。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，用質(zhì)量濃度為5、10、20、40、60 μg/mL的土貝母皂苷乙處理A549細(xì)胞，早期的凋亡率分別為3.57%，11.16%，15.48%，20.87%，23.59%，晚期凋亡率分別為2.88%，10.31%，11.44%，12.45%，13.28%。與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明土貝母皂苷乙有明顯的促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡的作用，且在一定范圍內(nèi)與濃度劑量呈依賴關(guān)系。

圖1 土貝母皂苷乙對(duì)A549及Hela抑制率的影響

圖2 土貝母皂苷乙對(duì)A549不同時(shí)間的抑制率

表1 土貝母皂苷乙對(duì)A549及Hela的抑制率結(jié)果比較（±s）

表1 土貝母皂苷乙對(duì)A549及Hela的抑制率結(jié)果比較（±s）

與對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

土貝母對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率（%）1.305±0.097 1.085±0.707 - -0.932±0.022△0.740±0.018△28.208±6.738△21.892±2.239△0.783±0.010△0.611±0.02△39.724±5.068△33.052±3.531△土貝母皂苷乙20 μg/mL組 5 0.569±0.022△0.389±0.041△56.270±2.790△△41.706±3.006△土貝母皂苷乙40 μg/mL組 5 0.285±0.013△0.186±0.174△78.046±2.212△△61.442±1.520△△土貝母皂苷乙60 μg/mL組 5 0.150±0.036△0.077±0.028△88.506±2.737△△65.256±1.379△△組別 n 土貝母對(duì)A549細(xì)胞的OD值土貝母對(duì)Hela細(xì)胞的OD值土貝母對(duì)A549細(xì)胞的抑制率（%）對(duì)照組 5土貝母皂苷乙5 μg／mL組 5土貝母皂苷乙10 μg/mL組 5

圖3 土貝母皂苷乙作用A549細(xì)胞24 h后熒光雙染結(jié)果

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測土貝母皂苷乙誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率的影響比較（%，±s）

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測土貝母皂苷乙誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率的影響比較（%，±s）

組別 n對(duì)照組 5土貝母皂苷乙5 μg／mL組 5土貝母皂苷乙10 μg/mL組 5早期凋亡率 晚期凋亡率0.504±0.124 0.614±0.123 3.572±0.188 2.882±0.165 11.158±1.110△10.306±1.308△土貝母皂苷乙20 μg/mL組 5 15.480±1.378△11.436±1.182△土貝母皂苷乙40 μg/mL組 5 20.866±1.484△12.446±1.263△土貝母皂苷乙60 μg/mL組 5 23.590±1.232△13.280±1.263△

圖4 土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞早期及晚期凋亡率的影響

圖5 流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞凋亡率的結(jié)果

3 討 論

本研究通過用不同濃度的土貝母皂苷乙分別處理A549細(xì)胞、Hela細(xì)胞，分析不同濃度的土貝母皂苷乙對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果表明，土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞及Hela細(xì)胞都有殺傷效應(yīng)，從而抑制細(xì)胞的增殖。同等濃度的土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用比Hela細(xì)胞更強(qiáng)。

筆者用倒置顯微鏡觀察了不同時(shí)間點(diǎn)土貝母皂苷乙作用于A549細(xì)胞后的形態(tài)。結(jié)果顯示，土貝母皂苷乙濃度越高、處理時(shí)間越長，A549細(xì)胞死亡率越高。提示土貝母皂苷乙對(duì)A549細(xì)胞的生長有抑制作用，且呈時(shí)間及劑量依賴效應(yīng)。本研究還用Hoechst及PI染液對(duì)土貝母皂苷乙處理的A549細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察細(xì)胞凋亡效應(yīng)。結(jié)果顯示，貝母皂苷乙處理后，對(duì)照組A549細(xì)胞核完整，均勻分布；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的核皺縮、染色體聚集，有凋亡小體形成。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨著濃度增加，細(xì)胞早期的凋亡率分別為3.57%，11.16%，15.48%，20.87%，23.59%，晚期凋亡率分別為2.88%，10.31%，11.44%，12.45%，13.28%，提示低濃度時(shí)早期與晚期的凋亡率差別不明顯；當(dāng)濃度增大時(shí)早期的凋亡率明顯高于晚期的，說明土貝母皂苷乙在高濃度時(shí)可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞早期凋亡，且與濃度有一定的依賴關(guān)系。

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Re search on Apoptosis of Nonsmall-cell Lung Cancer A549 Induced by Tubeimosides

Ⅱ CHEN Yangyang，WANG Ruili，WANG Bin，et al. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi，Xianyang 712046，China.

Objective：To investigate the inhibitory effect of tubeimosidesⅡ on the proliferation of non-small cell lung cancer A549 cells and the mechanism of its induction.Methods：Trypan blue staining method was used to detect cell viability；MTT was used to detect the inhibition rate detection of tubeimosidesⅡ；Hoechst33342/PI double fluorescent staining method was used to to observe cell morphology；the effect of tubeimosidesⅡon cell apoptosis rate was detected with flow cytometry.Results：TubeimosidesⅡcould significantly inhibit the proliferation of A549 cells.IC50of 24 h was 13.37 μg/mL，and IC50 of 48h was 10.99 μg/mL in a time and dose dependent manner.Hoechst33342/PI fluorescence double staining method was used to observe the nuclear shrinkage，chromosome aggregation，nuclear fragmentation，and apoptosis of the treated cells.FCM analysis showed that with the increase of drug concentration，the apoptotic rate of cells increased sequentially，from 4.56%to 17.62%.This study showed that tubeimosidesⅡcould significantly promote the apoptosis of A549 cells，and showed dose-dependent effects in a certain range.Conclusion：TubeimosidesⅡ can induce apoptosis of non-small cell lung cancer A549 cells.

TubeimosidesⅡ；A549 cell；Apoptosis

R730.59

A

1004-745X（2017）08-1336-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.007

2017-05-19）

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2015JM8475）

△通信作者（電子郵箱：chaoxu2004@126.com）