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    大黃酸PEGPCLPEI納米粒的制備及體外評(píng)價(jià)

    2017-09-09 18:41:18
    中國(guó)中藥雜志 2017年16期
    關(guān)鍵詞:釋藥溶酶體藥量

    陳丹飛1, 朱永琴1, 張?jiān)?, 王林燕2, 魏穎慧2*

    (1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院, 浙江 杭州 310006;

    2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 浙江 杭州 310053)

    [摘要]合成聚乙二醇聚己內(nèi)酯聚乙烯亞胺(PEGPCLPEI)三嵌段聚合物載體材料,制備包載大黃酸(RH)的PEGPCLPEI納米粒(PPPRHNPS),并評(píng)價(jià)其理化性質(zhì)和體外生物學(xué)特性。通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合和麥克爾加成反應(yīng)合成得到PEGPCLPEI聚合物,相對(duì)分子質(zhì)量為95×103,臨界膠束濃度為0723 nmol·L-1。包載RH制備得到PPPRHNPS,外觀淺黃、乳光明顯,透射電鏡觀察納米粒分散均勻圓整無(wú)團(tuán)聚,粒徑為(1183±36)nm,PDI為(019±008),Zeta電位為(63±15)mV,包封率為(9364±528)%,載藥量為(857±053)%。透析法考察PPPRHNPS體外釋藥特征,48 h內(nèi)累積釋放率為7592%,釋藥曲線符合Higuchi模型方程:Q=0121 6t1/2+0069 5(R2=0887 4),呈緩釋特性。選用兔紅細(xì)胞考察其溶血率,MTT法評(píng)價(jià)其對(duì)HK2細(xì)胞的生物安全性,在0~005 mmol·L-1不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血和細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞儀考察其攝取效率,PPPRHNPS可被細(xì)胞迅速內(nèi)吞,攝取效率高,30 min內(nèi)攝取完全,經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察,PPPRHNPS能夠從溶酶體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),具有溶酶體逃逸特性。因此,該研究成功合成PEGPCLPEI聚合物和制備得到PPPRHNPS,粒徑分布均勻,包封率及載藥量較高,攝取迅速,具有緩釋特征、溶酶體逃逸特性、優(yōu)良的生物安全性,是一種良好研究前景的新型納米制劑。

    [關(guān)鍵詞]大黃酸; 聚乙二醇聚己內(nèi)酯聚乙烯亞胺; 納米粒; 體外評(píng)價(jià)

    Preparation and in vitro evaluation of rheinloaded

    PEGPCLPEI nanoparticles

    CHEN Danfei1, ZHU Yongqin1, ZHANG Yuan1, WANG Linyan2, WEI Yinghui2*

    (1. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China;

    2College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

    [Abstract]This study was aimed to synthesize the polyethyleneglycolpolycaprolactonepolyethyleneimine (PEGPCLPEI) three block polymer material, prepareRhein (RH)loaded PEGPCLPEI nanoparticles(PPPRHNPS), and then evaluate their physical and chemical properties and biological characteristics in vitro PEGPCLPEI polymer was obtained by adopting theringopening polymerization and Michael addition reaction, and their physical and chemical properties were analyzed by using NMR and gel permeation chromatography PEGPCLPEI was then used as the carriers to prepare PPPRHNPS by applying spontaneous emulsification solvent diffusion method The results showed that molecular weight of PEGPCLPEI polymer was 95×103, and critical micelle concentration was 0723 mmol·L-1 PPPRHNPS had pale yellow, opalescence faade, round and smooth without aggregation, formed of (1183(36) nm in particle size with PDI of (019±008), Zeta potential of (63±15) mV, entrapment efficiency of (9364±528)%, and drug loading of (857±053)% The accumulative release percentage of PPPRHNPS was 7592% in 48h, and the release profiles in PBS conformed to the Higuchi equation: Q=0121 6t1/2+0069 5 (R2=0887 4), presenting slow release characteristics Within the scope of the 0005 mmol·L-1, the nanoparticles had no obvious hemolysis on rabbit red blood cells and toxicity on HK2 cells In the investigation of uptake efficiency by flow cytometry, nanoparticles can be absorbed into cells quickly and internalized within 30 minutes fully, with a high uptake efficiency In confocal laser scanning microscope observation, the nanoparticles can escape from lysosome into cytoplasm Herein, this study synthesized the PEGPCLPEI polymer and prepared PPPRHNPS successfully; the nanoparticles showed uniform particle size, higher encapsulation efficiency and drugloading rate, slow release characteristics, quick uptake and internalization, lysosome escape property and good biocompatibility PPPRHNPS will be a promising pharmaceutical formulation for further developmentendprint

    [Key words]rhein; PEGPCLPEI; nanoparticles; property evaluation

    大黃酸(rhein,RH)為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L、唐古特大黃R tanguticum Maxim ex Balf等傳統(tǒng)中藥分離提取的有效成分,屬于單蒽核類1,8二羥基蒽醌衍生物,藥理研究證實(shí),RH可顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞的增生、肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[1],同時(shí)RH能抑制人腎小管上皮細(xì)胞TSP1,TGFβ1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),保護(hù)腎臟固有功能[23],在對(duì)腎臟疾病的干預(yù)中發(fā)揮著多靶點(diǎn)多層次的治療作用。但是,RH溶解性差、半衰期短、腎臟富集率低、生物利用度低[4]、且具有一定的肝毒性,限制了其臨床應(yīng)用。有研究者采用新型納米粒作為藥物載體,包載RH后進(jìn)行遞藥輸送,能夠提高RH的水溶性、延長(zhǎng)半衰期和賦予緩控釋的特點(diǎn)[5]。但是普通納米粒經(jīng)細(xì)胞攝取后會(huì)直接進(jìn)入溶酶體,溶酶體作為細(xì)胞的“垃圾處理站”,其富含大量各類酸性水解酶,對(duì)進(jìn)入其中的各類物質(zhì)進(jìn)行消化和分解,從而使藥物喪失活性,極大降低了納米遞藥系統(tǒng)的療效[67]。因此,研究包載RH且具備溶酶體逃逸功能的納米粒對(duì)提高RH的藥效和促進(jìn)RH的臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

    聚乙烯亞胺(PEI)是一類廣泛應(yīng)用于核酸遞藥的陽(yáng)離子聚合物,其分子結(jié)構(gòu)由大量的各級(jí)胺構(gòu)成,在生理?xiàng)l件下分子中僅有15%~20%的胺質(zhì)子化,對(duì)生理環(huán)境的不同pH有很強(qiáng)的緩沖能力,可以有效提高遞藥體系的穩(wěn)定性;當(dāng)被細(xì)胞攝取進(jìn)入溶酶體后,由于溶酶體內(nèi)pH較低,分子中大于70%的胺被質(zhì)子化,能夠大量捕獲質(zhì)子,引起氯離子內(nèi)流進(jìn)入溶酶體,溶酶體內(nèi)的滲透壓不斷升高,最終使溶酶體破裂從而將內(nèi)吞的載體和藥物釋放到細(xì)胞質(zhì),而后發(fā)揮藥理作用[89]。因此,在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,本研究擬通過(guò)邁克爾加成反應(yīng),將PEI化學(xué)偶聯(lián)至聚乙二醇聚己內(nèi)酯上,合成三嵌段聚合物聚乙二醇聚己內(nèi)酯聚乙烯亞胺(PEGPCLPEI),合成具備溶酶體逃逸功能的聚合物。以PEGPCLPEI為藥物載體,以包封率、載藥量和粒徑為主要指標(biāo),制備包載RH的PEGPCLPEI納米粒(PPPRHNPS),并進(jìn)行藥劑學(xué)特性評(píng)價(jià);透析法考察其體外釋藥特性、MTT法評(píng)價(jià)其對(duì)HK2細(xì)胞的生物安全性、流式細(xì)胞儀考察其攝取效率、共聚焦顯微鏡考察其溶酶體逃逸特性,為PPPRHNPS體內(nèi)藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ),并為RH及同類藥物的新型納米制劑的研究提供參考。

    1材料

    RH原料藥(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度≥98%,批號(hào)201307);RH對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào)110757200206);聚乙二醇單甲醚(PEG,相對(duì)分子質(zhì)量2×103)、己內(nèi)酯、辛酸亞錫、丙烯酰氯、BOC丙氨酸、13′二甲氨基丙基3乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N羥基琥珀酰亞胺(NHS)(安耐吉化學(xué)薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司);聚乙烯亞胺(PEI,相對(duì)分子質(zhì)量18×103)、噻唑藍(lán)(MTT)(上海阿拉丁試劑有限公司);泊洛沙姆188(德國(guó)巴斯夫公司);Cy5N羥基琥珀酰亞胺酯(Cy5NHS)(杭州墨丘利生物醫(yī)藥科技有限公司);甲醇(美國(guó)Honeywell公司);磷酸(美國(guó)TEDIA公司); DMEM培養(yǎng)基(添加有45 g·L-1葡萄糖、37 g·L-1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素)、025%胰蛋白酶溶液(美國(guó)Gibco公司);細(xì)胞核染料Hoechst 33342、溶酶體綠色染料LysoTracker Green DND99(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);N,N二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、三乙胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    Bruker Avance400型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司);NanoZS 90激光粒度分析儀(英國(guó)Malvern公司);Agilentl200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司); JEM1200EX透射電鏡(日本電子株式會(huì)社); Waters1515型凝膠色譜儀(美國(guó)Waters公司);SpectraMaxM5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);ST16R臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);MillQ超純水儀(美國(guó)Millpore公司); Thermo Scientific Forma Ⅱ CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);MD200氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司);DZF6020真空干燥箱(廣州康恒儀器有限公司);CP225D電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司);等。

    兔紅細(xì)胞(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);HK2細(xì)胞(源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。

    2方法

    21載體材料的合成與表征

    211PEGPCL和PEGPCLPEI的合成聚乙二醇單甲醚(PEG)和已內(nèi)酯嚴(yán)格除水后使用,取50 mL圓底燒瓶加熱抽真空干燥后,在氮?dú)獗Wo(hù)下依次加入PEG(2 g,1 mmol)、己內(nèi)酯(10 mL,90 mmol)、辛酸亞錫(082 g,2 mmol),于110 ℃攪拌反應(yīng)24 h,冷卻后將混合物溶解在少量二氯甲烷中,用冰乙醚沉淀3次,最后砂芯漏斗過(guò)濾,固體抽真空干燥得到PEGPCL約6 g,產(chǎn)率約75%。

    取PEGPCL(2 g,025 mmol)溶解于無(wú)水的二氯甲烷20 mL中,加入無(wú)水的三乙胺1 mL,氮?dú)獗Wo(hù),緩慢滴加丙烯酰氯80 μL,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6 h后,飽和食鹽水萃取3次,每次20 mL,有機(jī)相旋蒸濃縮后,用冰乙醚沉淀,砂芯漏斗過(guò)濾,固體抽真空干燥得到PEGPCLCOCHCH2約12 g,產(chǎn)率約60%。

    取PEGPCLCOCHCH2(1 g,0125 mmol)和PEI(036 g,02 mmol)溶解于10 mL DMF中,加入1 mL吡啶,60 ℃攪拌反應(yīng)12 h,將反應(yīng)液倒入截留相對(duì)分子質(zhì)量為10×103透析袋,首先于DMF中透析24 h,后轉(zhuǎn)移到純水中透析24 h,最后經(jīng)冷凍干燥得到淡黃色固體PEGPCLPEI約08 g,產(chǎn)率約65%。endprint

    通過(guò)核磁共振儀測(cè)定所得產(chǎn)物的核磁共振氫譜(1HNMR),采用凝膠色譜儀測(cè)定所得聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量及相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線。采用熒光法測(cè)定PEGPCL和PEGPCLPEI的臨界膠束濃度(CMC):以芘為熒光探針,溶于丙酮配制20 mg·L-1母液,取離心管,每管加入100 μL母液,自然揮干丙酮后,加入1 mL一系列濃度的聚合物混懸液,最終芘質(zhì)量濃度為2 mg·L-1,室溫置于搖床中搖動(dòng)過(guò)夜,酶標(biāo)儀測(cè)定聚合物混懸液中芘的熒光光譜,固定最大發(fā)射波長(zhǎng)為390 nm,掃描芘在300~360 nm激發(fā)光譜圖,計(jì)算各濃度下激發(fā)光譜圖338,333 nm熒光強(qiáng)度的比值(I338/I333),繪制聚合物濃度與I338/I333曲線,計(jì)算曲線拐點(diǎn)處濃度為聚合物CMC。

    212熒光標(biāo)記的PEGPCL和PEGPCLPEI的合成取PEGPCL(1 g,0125 mmol)、BOC丙氨酸(189 mg,1 mmol)、EDC(48 mg,025 mmol)和NHS(30 mg,025 mmol)溶于10 mL二氯甲烷中,室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h,冰乙醚沉淀后,固體溶于20 mL二氯甲烷中,加入2 mL三氟乙酸攪拌1 h,飽和食鹽水萃取3次,每次20 mL,有機(jī)相旋蒸濃縮后,用冰乙醚沉淀,固體抽真空干燥,得到氨基修飾的PEGPCLCOCH2CH2NH2(PEGPCLNH2)約045 g,產(chǎn)率約41%。

    分別取PEGPCLNH2和PEGPCLPEI各200 mg,分別溶于5 mL的DMF中,各加入Cy5NHS 1 mg和075 mg(按照理論摩爾接枝率5%投料),避光45 ℃攪拌反應(yīng)24 h,將反應(yīng)液倒入截留相對(duì)分子質(zhì)量為35×103透析袋中,首先于DMF透析12 h,后轉(zhuǎn)移到純水中透析24 h,最后經(jīng)冷凍干燥得到藍(lán)色固體粉末即Cy5標(biāo)記的PEGPCL(PEGPCLCy5)和Cy5標(biāo)記的PEGPCLPEI(PEGPCLPEICy5)。使用低相對(duì)分子質(zhì)量35×103透析膜進(jìn)行透析純化,聚合物基本沒(méi)有損失。經(jīng)酶標(biāo)儀掃描熒光波譜強(qiáng)度,按摩爾比計(jì)算,PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5熒光接枝率分別約為32%和39%。

    22藥物測(cè)定方法的建立

    精密配制濃度為010 g·L-1的RH對(duì)照品母液,稀釋至質(zhì)量濃度為01,05,1,5,10,20,40,80 mg·L-1系列溶液,采用HPLC進(jìn)行測(cè)定。色譜柱Platisil ODS型(46 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相甲醇01%磷酸(75∶25),流速10 mL·min-1;柱溫25 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,以峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1,10,40 mg·L-1的3種濃度RH溶液,分別在日內(nèi)測(cè)定5次并且連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算RH的日內(nèi)、日間精密度。按處方量的80%,100%,120%精密稱取RH,分別加入處方比例的輔料,攪拌混合,用甲醇溶解定容后,經(jīng)022 μm微孔濾膜過(guò)濾后測(cè)定藥物濃度,計(jì)算RH回收率。

    23納米粒的制備和表征

    采用乳化溶劑揮發(fā)法制備PPPRHNPS:稱取適量RH和20 mg PEGPCLPEI溶于2 mL體積比為2∶1的丙酮甲醇的混合溶劑中,構(gòu)成有機(jī)相;另取10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(泊洛沙姆188)水溶液作為水相;800 r·min-1攪拌下將有機(jī)相以緩慢滴加到水相中,滴畢,繼續(xù)攪拌30 min,減壓蒸出有機(jī)溶劑和部分水,調(diào)整體積至10 mL,即得到具有黃色乳光的PPPRHNPS混懸液。同法制備載RH的PEGPCL納米粒(PPRHNPS)、熒光標(biāo)記的納米粒PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS,以及未載藥的空白納米粒PPPNPS和PPNPS。

    取少量PPPRHNPS混懸液,蒸餾水稀釋后經(jīng)粒徑儀測(cè)定其平均粒徑及Zeta電位。取一滴PPPRHNPS混懸液滴于銅網(wǎng)上,放于烤燈下蒸干溶劑,經(jīng)20%磷鎢酸溶液負(fù)染,置于透射電子顯微鏡觀察其微觀形貌特征。精密量取1 mL PPPRHNPS混懸液置于離心管中,于2×104 r·min-1離心30 min,取上清液經(jīng)HPLC測(cè)定游離的RH濃度,計(jì)算包封率和載藥量。

    24體外釋藥特性考察

    選擇含2%聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(吐溫80)的pH 74 PBS緩沖液作為釋放介質(zhì),采用透析法考察PPPRHNPS體外釋藥特性:分別取PPPRHNPS混懸液、PPRHNPS混懸液和RH溶液(RHsol)適量(折合RH質(zhì)量為05 mg)加入透析袋內(nèi),用透析夾封口后置于200 mL釋放介質(zhì)中,放于37 ℃恒溫水浴振蕩(60 r·min-1)中恒溫振蕩,分別于025,05,1,2,3,4,6,8,12,24,48 h取釋放介質(zhì)1 mL,補(bǔ)加等量空白釋放介質(zhì),試樣處理后經(jīng)HPLC測(cè)定RH含量,計(jì)算累積釋放百分率(Q),繪制并擬合體外釋藥曲線。

    25體外溶血實(shí)驗(yàn)

    取抗凝后的新鮮兔血,加入離心管,于2 000 r·min-1離心5 min去除上層血清和蛋白后,用pH 74的PBS緩沖液重懸沖洗并離心3次,直至上清液不顯紅色,最后PBS緩沖液稀釋配制濃度約為1×108個(gè)/mL紅細(xì)胞儲(chǔ)備液。在離心管中加入一定質(zhì)量濃度的PPPNPS混懸液和PPNPS混懸液,PBS緩沖液稀釋至系列梯度濃度,使得總體積為900 μL,最后加入100 μL的紅細(xì)胞儲(chǔ)備液。將離心管置于37 ℃恒溫?fù)u床中振蕩,2 h后,于2 000 r·min-1離心5 min分離出未破裂的紅細(xì)胞。收集上層液200 μL,使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在540 nm處的吸光度(A)。以相應(yīng)PBS溶液作為陰性對(duì)照,純水溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算溶血率(hemolysis ratio),溶血率=(A樣-A陰)/(A陽(yáng)-A陰) ×100%。

    26細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK2細(xì)胞,025%胰蛋白酶消化、收集、離心后,用DMEM培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至密度為5×104個(gè)/mL,取96孔板,每孔加入180 μL,穩(wěn)定12 h后,實(shí)驗(yàn)組分別加入系列梯度濃度的納米制劑混懸液20 μL,對(duì)照組加入等量的PBS,各組平行6孔。48 h后每孔加入20 μL的 5 g·L-1 MTT溶液,繼續(xù)孵育4 h,離心棄上清后加入200 μL 二甲亞砜,置于振蕩器上振蕩1 min,以570 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)和以620 nm為校正波長(zhǎng),用酶標(biāo)儀測(cè)定的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率(cell viability),細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/ A對(duì)照組×100%。endprint

    27細(xì)胞攝取效率考察

    將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,取12孔板,每孔加入1 mL細(xì)胞懸液,穩(wěn)定培養(yǎng)12 h。于一定的時(shí)間點(diǎn)加入100 μL等量熒光強(qiáng)度的PPPCy5RHNPS或PPCy5RHNPS,使其孵育0,025,05,1,15,2,3 h,吸棄培養(yǎng)基,PBS沖洗3遍,胰酶消化,收集細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定HK2細(xì)胞在不同孵育時(shí)間攝取各納米制劑的平均熒光強(qiáng)度,繪制攝取速率曲線,評(píng)價(jià)HK2對(duì)各納米制劑的攝取效率。

    28細(xì)胞攝取機(jī)制考察

    將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,取規(guī)格為35 mm的玻底培養(yǎng)皿,每皿加入1 mL細(xì)胞懸液,穩(wěn)定培養(yǎng)24 h。采用激光共聚焦顯微鏡觀察PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS的細(xì)胞攝取過(guò)程及胞內(nèi)分布:首先按照Hoechst 33342試劑盒和LysoTracker Green DND99試劑盒操作指南,每皿加入02 μL LysoTracker Green DND99標(biāo)準(zhǔn)液,20 min后每皿滴加2滴Hoechst 33342標(biāo)準(zhǔn)液,孵育30 min后,吸取培養(yǎng)基,PBS沖洗一遍,加入新鮮DMEM培養(yǎng)基,然后加入100 μL PPPCy5RHNPS或110 μL PPCy5RHNPS混懸液,分別于孵育15 min,1 h和3 h觀察,激光共聚焦顯微鏡分別選取DAPI通道、488 nm通道和640 nm通道3個(gè)光源通道,考察各納米制劑的細(xì)胞攝取過(guò)程及胞內(nèi)分布情況。

    3結(jié)果

    31載體材料的表征

    聚合物PEGPCLPEI的合成路線見(jiàn)圖1A,圖1B為PEGPCL的1HNMR(CDCl3,400 Hz)δ:138[10077H,COCH2CH2CH2CH2CH2O],163[20045H,COCH2CH2CH2CH2CH2O],229[9989H,OCOCH2],338(3H,CH3O),365[18055H,CH2CH2O],406[9823H,CH2OCO],通過(guò)聚乙二醇上單甲氧基的3個(gè)氫為基準(zhǔn),推算出合成的PEGPCL的相對(duì)分子質(zhì)量約為77×103(2 000+100/2×114 =7 700)。圖1C為PEGPCLCOCHCH2的的1HNMR圖譜,峰位和大小與B圖一致,多出的1組峰為反應(yīng)結(jié)合丙烯酰的3個(gè)氫,55~65(359H,OCOCHCH2),積分氫數(shù)量大于理論值,表明產(chǎn)物中有少量未除盡的丙烯酰,并不影響下一步反應(yīng)。圖1D為PEI的核磁圖譜,其相對(duì)分子質(zhì)量為18×103,積分約為170個(gè)氫,256[170H,CH2CH2NH]。圖1E為最終合成得到的PEGPCLPEI,1HNMR(CD3OD,400 Hz):由于單甲氧基與甲醇的溶劑峰重合,因而采用聚乙二醇主鏈上的180個(gè)氫作為基準(zhǔn)進(jìn)行校正計(jì)算,129[10041H,COCH2CH2CH2CH2CH2O],153[19987H,COCH2CH2CH2CH2CH2O],227[9854H,OCOCH2],355[180H,CH2CH2O],396[9939H,CH2OCO],250[195H,CH2CH2NH],相對(duì)分子質(zhì)量約為98×103(7 700+195/4×43=9 796),通過(guò)PEI峰位氫的實(shí)際值和理論值對(duì)比計(jì)算,合成得到的PEGPCLPEI純度約為90%,能夠符合載體材料的純度要求。

    各聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量及相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線見(jiàn)圖2A,PEGPCLPEI相對(duì)分子質(zhì)量分布均一,PDI為108,而PEGPCL和PEI相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線范圍更寬,主要由于純化PEGPCLPEI采用相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)10×103透析袋進(jìn)行透析,能夠除掉小相對(duì)分子質(zhì)量的聚合物,使相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線范圍更窄。通過(guò)儀器自帶聚乙烯做內(nèi)參的相對(duì)分子質(zhì)量曲線方程,計(jì)算得到重均相對(duì)分子質(zhì)量約為95×103,與核磁估算的結(jié)果基本一致。選用熒光探針Cy5對(duì)PEGPCL和PEGPCLPEI進(jìn)行熒光標(biāo)記,經(jīng)酶標(biāo)儀掃描熒光波譜強(qiáng)度,按摩爾比計(jì)算,PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5熒光接枝率分別約為32%,39%。

    采用熒光法測(cè)定聚合物的CMC,以338,333 nm熒光強(qiáng)度的比值(I338/I333)與聚合物濃度擬合曲線,曲線拐點(diǎn)處濃度為聚合物CMC[10]。隨著PEGPCL

    或PEGPCLPEI聚合物濃度的逐漸增大,芘的激發(fā)光強(qiáng)度迅速增大,最大激發(fā)波長(zhǎng)逐漸由333 nm紅移至338 nm,PEGPCL在濃度為02 nmol·L-1附近開(kāi)始出現(xiàn)熒光強(qiáng)度的突變,PEGPCLPEI在濃度為1 nmol·L-1附近出現(xiàn)明顯的熒光強(qiáng)度的突變,見(jiàn)圖3。通過(guò)對(duì)I338/I333與聚合物濃度擬合曲線,計(jì)算拐點(diǎn)處的濃度,PEGPCL和PEGPCLPEI的CMC分別為0303,0723 nmol·L-1。PEGPCLPEI的CMC大于PEGPCL的原因主要由于其分子中引入的嵌段PEI為親水性結(jié)構(gòu),與疏水嵌段PCL偶聯(lián)后在一定程度上會(huì)阻礙疏水內(nèi)核結(jié)構(gòu)的形成,隨著濃度的增加,疏水嵌段PCL的強(qiáng)大疏水作用最終占據(jù)主導(dǎo),促成自組裝形成膠束結(jié)構(gòu)。

    32藥物測(cè)定

    經(jīng)HPLC測(cè)定,以峰面積A為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,RH在05~40 mg·L-1呈良好的線性關(guān)系,回歸方程A=71272C-12817,R2=0999 8。低中高濃度RH溶液的日內(nèi)和日間精密度RSD分別為054%,047%,058%和105%,086%,072%,均小于2%。按處方量的80%,100%,120%加入RH后,回收率分別為(9663±238)%,(9701±075)%,(9727±156)%,均符合方法學(xué)要求。

    33納米粒制劑的表征

    制備得到的PPPRHNPS混懸液呈淺黃色、乳光明顯,經(jīng)熒光探針Cy5標(biāo)記后PPPCy5RHNPS呈現(xiàn)一定的淡藍(lán)色,測(cè)得平均粒徑為(1183±36)nm,PDI為(019±008),Zeta電位為(63±15)mV,見(jiàn)圖4。用透射電鏡觀察,PPPRHNPS呈圓球顆粒,大小均勻,分布良好,粒子之間未見(jiàn)明顯粘連及團(tuán)聚現(xiàn)象。制備得到的其他納米粒制劑粒徑均分布在100 nm左右,PDI在01~03,見(jiàn)表1。以PEGPCL為載體所制備的納米粒均帶負(fù)電,而以PEGPCLPEI為載體所制備得到的納米粒均帶正電,這主要由于嵌段PEI中各級(jí)胺的質(zhì)子化賦予了納米粒正電特性。采用高速離心法考察各納米制劑的包封率和載藥量,經(jīng)HPLC測(cè)定,PPRHNPS和PPPRHNPS包封率分別為(4736±381)%和(9364±528)%,載藥量分別為(231±038)%和(857±053)%,PEGPCL中引入嵌段PEI后能夠顯著提高RH的包封率和載藥量。endprint

    34體外釋藥考察

    RH原藥、PPRHNPS和PPPRHNPS的釋藥曲線見(jiàn)圖5,RH原藥在釋放介質(zhì)中釋藥很快,4 h內(nèi)時(shí)藥物累計(jì)釋放率接近90%。PPRHNPS釋藥行為可以分為突釋和緩釋兩相,開(kāi)始時(shí)釋放較快,3 h時(shí)藥物的累積釋放率為5514%,隨后釋藥曲線漸趨平穩(wěn),緩慢釋藥,于48 h時(shí)累積釋放率為9127%。PPPRHNPS釋藥曲線更加平穩(wěn),具有明顯的緩控釋特性,3 h內(nèi)藥物的累積釋放率為3126%,沒(méi)有顯著的突釋現(xiàn)象,于48 h內(nèi)累積釋放率為7592%。PPRHNPS中RH主要以疏水作用的物理包埋方式載入納米粒中,載藥不穩(wěn)定,釋放較快;而PPPRHNPS中除了物理包埋方式,RH中的羧酸根以及酚羥基與嵌段PEI的多級(jí)胺能夠酸堿離子結(jié)合,主要以離子對(duì)的形式包載,載藥更加穩(wěn)定,釋藥平穩(wěn)而緩慢。

    采用經(jīng)典的零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型對(duì)PPPRHNPS體外釋藥特性進(jìn)行方程擬合,見(jiàn)表2,PPPRHNPS在PBS緩沖液中的釋藥行符合Higuchi模型方程,為Q=0121 6t1/2+0069 5(R2=0887 4)。

    35細(xì)胞溶血和細(xì)胞毒性考察

    采用兔紅細(xì)胞考察PPNPS和PPPNPS細(xì)胞溶血現(xiàn)象,見(jiàn)圖6A,隨著聚合物濃度的增加,PPNPS

    和PPPNPS均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,在低于005 mmol·L-1時(shí)紅細(xì)胞溶血率小于5%,具有良好的溶血耐受性。采用MTT法測(cè)定了PPNPS和PPPNPS對(duì)HK2的細(xì)胞毒性,見(jiàn)圖6,孵育48 h后,在聚合物濃度達(dá)到01 mmol·L-1時(shí),HK2細(xì)胞的存活率仍然保持在90%以上,具備良好的生物安全性。此外,在相同濃度下,PPPNPS比PPNPS具有更高的溶血率和細(xì)胞毒性,主要因?yàn)镻EGPCLPEI聚合物中的嵌段PEI具有較強(qiáng)的正電特性,其結(jié)構(gòu)中多級(jí)胺所生成的銨鹽能夠引起紅細(xì)胞溶血和細(xì)胞毒性,這一問(wèn)題也是陽(yáng)離子聚合物及陽(yáng)離子脂質(zhì)體等新型納米制劑普遍存在的弊端[11]。由于PPPNPS包載RH具有較高的包封率和載藥量,能夠以較低的濃度滿足給藥劑量,在0~005 mmol·L-1,不會(huì)引起紅細(xì)胞溶血和細(xì)胞毒性,仍具備良好的生物相容性。

    36細(xì)胞攝取效率考察

    納米制劑在不同時(shí)間點(diǎn)的攝取情況見(jiàn)圖7,各納米粒制劑隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)不斷被攝取進(jìn)入細(xì)胞中,熒光強(qiáng)度及計(jì)數(shù)陽(yáng)性率不斷增加。PPCy5RHNPS攝取較緩慢,在90 min時(shí)能夠達(dá)到被完全攝取,而PPPCy5RHNPS攝取十分迅速,15 min內(nèi)約有60%的納米粒制劑被攝取進(jìn)入細(xì)胞,30 min基本達(dá)到完全攝取,具有較高的攝取效率。由于細(xì)胞膜表

    37細(xì)胞攝取機(jī)制考察

    激光共聚焦顯微鏡觀察PPCy5RHNPS和PPPCy5RHNPS攝取入胞過(guò)程,見(jiàn)圖8,PPCy5RHNPS攝取入胞較為緩慢,15 min只有極少的納米粒攝取進(jìn)入細(xì)胞(紅色部分),1 h時(shí)大部分進(jìn)入細(xì)胞,但是攝取入胞的納米粒處置進(jìn)入溶酶體,3 h時(shí)納米粒仍然完全分布在溶酶體內(nèi)(綠色和紅色完全重合,顯黃色),如果藥物無(wú)法從溶酶體中盡快逃逸釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,可能會(huì)被逐漸分解變質(zhì)而喪失活性。PPPCy5RHNPS細(xì)胞攝取較為迅速,15 min時(shí)大量粘附于細(xì)胞膜表面周圍(紅色圓環(huán))并攝取入胞,1 h內(nèi)完全攝取并分布于溶酶體中,3 h時(shí)可見(jiàn)有大量納米粒逃逸出溶酶體擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(紅色分布整個(gè)細(xì)胞并只有少量與綠色重合),從而使藥物發(fā)揮療效。此種溶酶體逃逸特性正是由于PPPCy5RHNPS中嵌段PEI具有大量荷正電的氨基,在質(zhì)子海綿效應(yīng)作用下,溶脹破裂溶酶體,使PPPCy5RHNPS逃逸出溶酶體,最后釋放藥物。

    4討論

    納米粒作為新型藥物載體,能夠包載RH等難溶性藥物進(jìn)行遞藥輸送,可以提高難溶性藥物的水溶性、延長(zhǎng)半衰期和賦予緩控釋的特點(diǎn),從而提高藥物療效。大部分嵌段聚合物制備得到的納米粒主要通過(guò)相似相溶原理依賴其疏水性內(nèi)核區(qū)來(lái)包載藥物,少量吸附于納米粒的表面和殼層內(nèi),往往難以達(dá)到理想的包封率和載藥量[1213]。雖然有研究報(bào)道采用介孔結(jié)構(gòu)的無(wú)機(jī)納米粒能夠具備極高的包封率和載藥量,但是受限于體內(nèi)難降解和生物相容性差而無(wú)法實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化[14]。目前有較多研究者采用共價(jià)偶聯(lián)制備前藥納米粒、超分子組裝體和聚集體、金屬絡(luò)合物以及酸堿離子對(duì)等方法提高納米粒的包封率和載藥量,本研究合成制備的三嵌段聚合物PEGPCLPEI中嵌段PEI具有大量的多級(jí)胺,在生理環(huán)境中顯堿性,帶正電,RH具有羧酸基團(tuán)和酚羥基團(tuán),顯酸性,帶負(fù)電,兩者可以形成酸堿離子對(duì),從而包載RH具有較高的包封率和載藥量。

    統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn),采用納米遞藥系統(tǒng)在治療各類疾病的研究中,往往難以達(dá)到預(yù)期治療效果,主要由于納米遞藥體系發(fā)揮療效依賴于最終輸送至靶點(diǎn)的有效藥量[1516]。大多數(shù)載藥納米粒經(jīng)過(guò)血液循環(huán)、體內(nèi)分布、進(jìn)入組織器官,經(jīng)細(xì)胞攝取吞噬后會(huì)直接進(jìn)入溶酶體,而溶酶體不是藥物的作用靶點(diǎn),其作為細(xì)胞的“垃圾處理站”,富含大量酸性水解酶,能對(duì)進(jìn)入其中的各類外源性物質(zhì)和內(nèi)源性廢物進(jìn)行消化和分解,如果載藥納米粒不能夠及時(shí)從溶酶體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),藥物就可能失去活性,極大降低納米遞藥系統(tǒng)的療效。PEI在基因遞藥系統(tǒng)中被廣泛用于溶脹溶酶體,促進(jìn)核酸藥物的溶酶體逃逸[89],其分子結(jié)構(gòu)由大量的各級(jí)胺構(gòu)成,由于溶酶體內(nèi)pH較低,分子中的胺被質(zhì)子化,引起氯離子內(nèi)流進(jìn)入溶酶體,溶酶體內(nèi)的滲透壓不斷升高,使溶酶體破裂從而將內(nèi)吞的載體納米粒釋放到細(xì)胞質(zhì),接觸作用靶點(diǎn)。本研究運(yùn)用PEI的特性,偶聯(lián)嵌段PEI至聚乙二醇聚己內(nèi)酯聚合物上,不僅能夠促進(jìn)載RH的納米粒從溶酶體逃逸,而且能夠賦予納米粒正電的特性,大大提高了納米粒的攝取效率。

    本研究成功合成了三嵌段聚合物PEGPCLPEI,制備了包載大黃酸的PEGPCLPEI納米粒,該納米粒包封率和載藥量較高,粒徑分布均勻,體外釋藥具有緩釋特性,表面荷正電,細(xì)胞攝取迅速,具備溶酶體逃逸的特性,具有良好的生物安全性。本研究為納米粒體內(nèi)藥效學(xué)考察奠定基礎(chǔ),為RH及同類藥物新型納米制劑的研究提供參考。endprint

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Hao H, Shao Z, Tang D, et al Preventive effects of rutin on the development of experimental diabetic nephropathy in rats[J] Life Sci, 2012, 91(19): 959

    [2]Tang D, Wei Y, Gao Y, et al Retracted: protective effects of rutin on rat glomerular mesangial cells cultured in high glucose conditions[J] Phytother Res, 2011, 25(11): 1640

    [3]CervantesLaurean D, Schramm D D, Jacobson E L, et al Inhibition of advanced glycation end product formation on collagen by rutin and its metabolites[J] J Nutr Biochem, 2006, 17(8): 531

    [4]Peng Y, Sun J G, Wang G J, et al Pharmacokinetic study of rhein and its carboxylesterification derivatives in rats [J] Chin J Nat Med, 2009, 7(3):228

    [5]Yuan Z, Gu X Preparation, characterization, and in vivo study of rheinloaded poly (lacticcoglycolic acid) nanoparticles for oral delivery[J] Drug Des Dev Ther, 2015, 9(4): 2301

    [6]Martens T F, Remaut K, Demeester J, et al Intracellular delivery of nanomaterials: how to catch endosomal escape in the act[J] Nano Today, 2014, 9(3): 344

    [7]Blanco E, Shen H, Ferrari M Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery[J] Nat Biotechnol, 2015, 33(9): 941

    [8]Guan S, Rosenecker J Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vectorbased delivery systems[J] Gene Ther, 2017, 24(3): 133

    [9]Lchelt U, Wagner E Nucleic acid therapeutics using polyplexes: a journey of 50 years (and beyond)[J] Chem Rev, 2015, 115(19): 11043

    [10]Topuzogullari M, Bulmus V, Dalgakiran E, et al pHand temperatureresponsive amphiphilic diblock copolymers of 4vinylpyridine and oligoethyleneglycol methacrylate synthesized by RAFT polymerization[J] Polymer, 2014, 55(2): 525

    [11]Manaargadoo Catin M, Ali Cherif A, Pougnas J L, et al Hemolysis by surfactantsa review[J] Adv Colloid Interface, 2016, 228(2): 1

    [12]Rosenblatt K M, Bunjes H Evaluation of the drug loading capacity of different lipid nanoparticle dispersions by passive drug loading[J] Eur J Pharm Biopharm, 2017, 117(8): 49

    [13]Reddy B, Yadav H K S, Nagesha D K, et al Polymeric micelles as novel carriers for poorly soluble drugsreview[J] J Nanosci Nanotechno, 2015, 15(6): 4009

    [14]Shi Y, Miller M L, Di Pasqua A J Biocompatibility of mesoporous silica nanoparticles[J] Comment Inorg Chem, 2016, 36(2): 61

    [15]Wilhelm S, Tavares A J, Dai Q, et al Analysis of nanoparticle delivery to tumours[J] Nat Rev Mater, 2016, 1(5): 16014

    [16]謝智奇,皇甫銘一,韓旻腫瘤微環(huán)境MMP酶響應(yīng)性納米給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2017, 34(6):903

    [責(zé)任編輯孔晶晶]endprint

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