朝醫(yī)八物君子湯拮抗房顫及對Cx40、Cx43表達的影響

金玉　張默函　洪蘭++崔昊震

【摘要】本文通過觀察朝醫(yī)八物君子湯拮抗房顫及對心房肌縫隙連接蛋白Cx40、Cx43蛋白表達的影響得出結(jié)論，朝醫(yī)八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘發(fā)房顫的作用，其機制主要與提高Cx40、Cx43蛋白表達水平有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】朝醫(yī)八物君子湯；房顫；Cx40；Cx43

【中圖分類號】R285.5 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2017.03..02

朝醫(yī)八物君子湯是來源于《東醫(yī)壽世保元》中的少陰人方劑，其主要組成由人參、黃芪[1]、白術(shù)、白芍、當歸、川芎、陳皮，甘草等8味藥物構(gòu)成，具有補脾和脾，補氣和血之功效，臨床上?？捎糜谥委熒訇幦梭@悸、怔忡等疾病。本研究通過采用急性房顫模型，觀察和探討八物君子湯對房顫大鼠心房肌CX40和CX43蛋白表達、心房肌細胞微結(jié)構(gòu)變化及對ANP分泌的影響，旨在闡明八物君子湯拮抗房顫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

實驗動物均采用雄性SD大鼠（體重為200±20 g）。由延邊大學(xué)實驗動物科提供，合格證號：SCXK（吉）2011-0007。八物君子湯的8味藥材均購自延吉市中醫(yī)醫(yī)院。烏頭堿（美國Sigma公司）CX40和CX43多克隆抗體（美國Abcam公司）、辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗（北京中山生物技術(shù)公司）；ANP檢測試劑盒為北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品（批準號S10950156）。

1.2 制備八物君子湯提取物

取人參100 g、黃芪、白術(shù)、白芍、當歸、川芎、陳皮、甘草各50 g切碎，分2次煎煮，每次加入10倍量的水，煎煮2 h，將2次濾液混勻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮。凍干后，最終獲得黃褐色粉末狀藥物，并儲存于-20℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 急性房顫模型的制備

用20%烏拉坦將雄性SD大鼠麻醉，快速開胸摘取心臟，并剝離左心房，將其固定在Choi等研制的離體搏動心房灌流裝置中。同時給予1.5 Hz的電刺激（電刺激時間為0.3 ms；電壓為30 V）來維持體外左心房搏動，用氧飽和的HEPES緩沖液[pH 7.4；（mmol·L-1）：NaC1 118，KC1 4.7，CaC12 2.5，MgC1 1.2，NaHCO3 25，葡萄糖10，HEPES 10，牛血清白蛋白 0.1%]對左心房組織進行持續(xù)性灌流，灌流約60 min心房搏動可達到穩(wěn)定狀態(tài)。急性房顫模型是在心房灌流模型建立后，先經(jīng)過1個正常對照循環(huán)（12 min）灌流后，繼以烏頭堿（6×10-7 mol/L）誘發(fā)房顫的方法制備急性房顫模型，房顫以BL-420S生理記錄儀上顯示出現(xiàn)異常心跳波作為急性房顫模型成功的標志。

1.4 動物分組及藥物干預(yù)

選擇10只SD大鼠作為正常對照組，用氧飽和的HEPES緩沖液進行5個循環(huán)（60 min）的持續(xù)灌流。其余30只隨機分為AI模型組（6×10-7 mol/L）和AI+BJD高劑量組（1×10-3 g/mL）及AI+BJD低劑量組（3×10-4 g/mL），每組各10只。AI模型組在進行1個循環(huán)（12 min）正常灌流后，進行4個循環(huán)（48 min）的烏頭堿藥物灌流；AI+BJD高低劑量組在進行1個正常循環(huán)（12 min）和2個循環(huán)（60 min）BJD預(yù)處理后，在BJD持續(xù)灌流的狀態(tài)下給予2個循環(huán)（24 min）的烏頭堿進行灌流。

1.5 烏頭堿誘發(fā)房顫發(fā)生所需時間檢測

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預(yù)過程中，測定烏頭堿誘發(fā)房顫發(fā)生所需的時間變化的平均值。

1.6 心房灌流液中ANP分泌量變化檢測

各組大鼠在急性房顫模型和藥物干預(yù)過程中，測定第1（12 min）、第3（36 min）、第5（60 min）循環(huán)結(jié)束前4 min的ANP分泌水平變化的平均值。

1.7 心房組織內(nèi)CX40、CX43蛋白表達檢測

采用Western-blot法檢測在急性房顫和藥物干預(yù)過程中心房組織內(nèi)CX40、CX43蛋白水平變化。灌流實驗結(jié)束后迅速取出心房組織，稱重后將根據(jù)組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，并測定蛋白樣品的濃度。制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液封閉PVDF膜上的非特異性位點，并分別加入1∶200稀釋的兔抗大鼠CX40、CX43多克隆一抗（美國Abcam公司），在4℃孵育過夜，洗滌后續(xù)加入1∶3000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，在室溫下孵育1h后洗膜。采用圖像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以-actin為內(nèi)參，計算CX40、CX43蛋白的相對表達含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料均以“x±s”表示，采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 烏頭堿誘發(fā)房顫及藥物干預(yù)后房顫發(fā)生所需時間變化的影響

各組大鼠在建立急性房顫模型和藥物干預(yù)過程中測定房顫發(fā)生所需時間變化，發(fā)現(xiàn)BJD高、低劑量組均比AI模型組烏頭堿誘發(fā)房顫所需的時間明顯延長（P<0.05）。BJD高劑量組結(jié)果中有4只大鼠沒有出現(xiàn)烏頭堿誘發(fā)房顫，即完全抑制了烏頭堿作用，而低劑量組則未出現(xiàn)完全抑制的結(jié)果，高低劑量組之間相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 八物君子湯拮抗烏頭堿誘發(fā)房顫時對ANP分泌的影響

烏頭堿誘發(fā)房顫時心房明顯增加ANP分泌量（P<0.05）；BJD預(yù)處理時均出現(xiàn)ANP分泌量上調(diào)的趨勢，尤其是高劑量組結(jié)果顯示具有明顯增加心房組織ANP分泌的作用（P<0.05）；BJD高低劑量組預(yù)處理后，用烏頭堿誘發(fā)房顫，發(fā)現(xiàn)心房組織ANP分泌量明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，BJD高劑量組對心房組織ANP分泌的抑制作用顯著高于低劑量組（P<0.05）。

2.3 各組心房組織中對CX40、CX43蛋白水平變化的影響

3 討 論

心臟即是泵血器官，又具有內(nèi)分泌功能。ANP是心房組織分泌的，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)水鈉平衡和血液動力學(xué)及改善心肌重構(gòu)等重要作用的肽類物質(zhì)。研究表明，房顫上調(diào)心房組織對ANP分泌量，其機制可能與房顫時心房壓力持續(xù)增高，交感神經(jīng)興奮性增強，激活血管緊張素Ⅱ受體，介導(dǎo)心房肌細胞產(chǎn)生增生和間質(zhì)纖維化，進而造成心房體積變大，心房肌細胞結(jié)構(gòu)重塑等病理過程有關(guān)[2，3]。本實驗中發(fā)現(xiàn)八物君子湯可有效降低因烏頭堿誘發(fā)房顫導(dǎo)致的心房組織對ANP分泌量，且呈濃度依賴性。本研究結(jié)果提示八物君子湯能有效改善房顫導(dǎo)致的心房組織損傷，故出現(xiàn)ANP分泌顯著減弱的狀況。

綜上所述，朝醫(yī)方八物君子湯具有拮抗烏頭堿誘導(dǎo)的急性房顫的作用，其作用機制可能與抑制心房組織CX40、CX43蛋白表達水平密切相關(guān)。另外，八物君子湯成分比較復(fù)雜，其具體的藥效成分及作用機制還有待于進一步深入研究。

參考文獻

[1] 李 杰，李俊鋒，魏婷婷.黃芪苷Ⅳ對心律不齊大鼠的作用及其相關(guān)機制[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（14）：2076-2079.

本文編輯：劉欣悅endprint