重組旋毛蟲(chóng)plancitoxin-1-like活性位點(diǎn)突變體蛋白的核酸酶活性

廖成水，王曉利，田文靜，張夢(mèng)珂，張春杰，李銀聚，吳庭才，程相朝,3

1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023 2 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023 3 洛陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471099

重組旋毛蟲(chóng)plancitoxin-1-like活性位點(diǎn)突變體蛋白的核酸酶活性

廖成水1，王曉利2，田文靜1，張夢(mèng)珂1，張春杰1，李銀聚1，吳庭才1，程相朝1,3

1 河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023 2 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023 3 洛陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471099

廖成水, 王曉利, 田文靜, 等. 重組旋毛蟲(chóng)plancitoxin-1-like活性位點(diǎn)突變體蛋白的核酸酶活性. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(8):1315-1324.

Liao CS, Wang XL, Tian WJ, et al. Nuclease activity of the recombinant plancitoxin-1-like proteins with mutations in the active site from Trichinella spiralis. Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1315-1324.

旋毛蟲(chóng)plancitoxin-1-like (Ts-Pt) 是旋毛蟲(chóng)125種DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性區(qū)域HKD基序的核酸酶，且普遍認(rèn)為，組氨酸位點(diǎn)是DNaseⅡ的活性氨基酸位點(diǎn)。為研究Ts-Pt活性位點(diǎn)突變體蛋白的核酸酶活性，利用重疊PCR方法獲得Ts-Pt活性位點(diǎn)突變體片段，以pET-28a(+)為載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。重組Ts-Pt突變體蛋白經(jīng)親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE分析。利用瓊脂糖凝膠電泳法和核酸酶酶譜分析重組Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性。成功構(gòu)建含Ts-Pt突變體重組質(zhì)粒的基因工程菌，SDS-PAGE和親和層析純化結(jié)果顯示，重組Ts-Pt突變體蛋白呈包涵體表達(dá)。重組蛋白經(jīng)復(fù)性后并沒(méi)有表現(xiàn)出核酸酶活性，但核酸酶酶譜分析結(jié)果顯示，包涵體表達(dá)的重組Ts-Pt突變體蛋白表現(xiàn)出降解DNA的能力。同時(shí)，N端和C端活性位點(diǎn)H及HCK和DHSK突變并不影響Ts-Pt的核酸酶活性，研究結(jié)果為進(jìn)一步研究龐大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛蟲(chóng)發(fā)育和感染方面的作用提供一定的參考。

旋毛蟲(chóng)，plancitoxin-1-like，活性位點(diǎn)，突變體，核酸酶

脫氧核糖核酸酶 (DNase) 是一類(lèi)能夠催化水解DNA骨架上磷酸二酯鍵的酶類(lèi)的統(tǒng)稱，參與機(jī)體細(xì)胞凋亡和免疫保護(hù)等多種生命活動(dòng)。根據(jù)底物特異性、化學(xué)機(jī)制和生物學(xué)功能的不同，主要將DNase分為DNaseⅠ和DNaseⅡ兩大類(lèi)。根據(jù)現(xiàn)有研究資料顯示，絕大多數(shù)物種存在一種DNaseⅠ或多種DNaseⅡ同源物。2011年公布的旋毛蟲(chóng)基因組序列分析顯示，旋毛蟲(chóng)可能存在一個(gè)多達(dá) 125種 DNaseⅡ蛋白家族。旋毛蟲(chóng)擁有如此龐大的 DNaseⅡ蛋白，這在其他物種中是極為罕見(jiàn)的。DNaseⅡ家族成員氨基酸序列的N端和C端都具有典型的高度保守的活性區(qū)域，即HKD基序 (H-x-K-x(4)-D)[1]。但筆者前期利用在線生物信息學(xué)軟件 Conserved Domain Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 對(duì)旋毛蟲(chóng)125種DNase Ⅱ家族蛋白進(jìn)行保守區(qū)域分析，結(jié)果顯示，只有plancitoxin-1蛋白 (1 095 bp, GenBank AccessionNo. XM_003370715.1) 在 C端具有 1個(gè)典型DNaseⅡ活性位點(diǎn)HKD基序。對(duì)該基因進(jìn)行克隆和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增獲得的基因序列比GenBank預(yù)測(cè)的短 210 bp，并且相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列中在N端和C端都具有HKD基序，重新命名為plancitoxin-1-like (Ts-Pt)[2]。

雖然有報(bào)道稱旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)時(shí)期排泄分泌物中存在核酸酶活性，但旋毛蟲(chóng)125種DNase Ⅱ蛋白中到底哪個(gè)蛋白發(fā)揮核酸酶活性仍然不清楚，筆者前期利用核酸酶酶譜證明了經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的重組Ts-Pt蛋白表現(xiàn)出一定的核酸酶活性[2]。氨基酸 N端和C端的兩個(gè)HKD基序是DNaseⅡ的活性位點(diǎn)區(qū)域，并且組氨酸可能是DNaseⅡ發(fā)揮核酸酶活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，但目前仍沒(méi)有足夠的研究證據(jù)表明組氨酸就是HKD基序的關(guān)鍵位點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)重疊PCR方法對(duì) Ts-Pt的活性位點(diǎn) HKD基序進(jìn)行突變構(gòu)建Ts-Pt突變體表達(dá)載體，經(jīng)大腸桿菌表達(dá)、純化后利用核酸酶酶譜分析各種重組突變體蛋白的核酸酶活性，試圖探討HKD基序在DNaseⅡ發(fā)揮核酸酶活性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

重組質(zhì)粒 pET28a-Ts-Pt和 Rosetta (DE3)/(pET28a-Ts-Pt) 由筆者構(gòu)建[2]，大腸桿菌Rosetta(DE3) 菌株均由洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨和酵母浸出物均購(gòu)自英國(guó) Oxoid公司；Taq DNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA連接酶、BamHⅠ和 Hind Ⅲ均購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、氨芐青霉素、卡那霉素、IPTG和咪唑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白marker購(gòu)自美國(guó)Genview公司；鮭魚(yú)精DNA和Triton X-100均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

參照旋毛蟲(chóng) plancitoxin-1-like基因 (Ts-Pt)的堿基序列 (GenBank Accession No. KF984291)設(shè)計(jì)構(gòu)建DNaseⅡ活性位點(diǎn)HKD基序突變體重組表達(dá)載體的引物 (表 1)。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。所構(gòu)建的各種突變體分別命名為 H→A、H→L、HCK→LAQ、DHSK→VLLQ和HCK/DHSK→LAQ/VLLQ。

1.2.2 Ts-Pt突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

以引物Ts-Pt上游和突變引物上游、突變引物下游和引物 Ts-Pt下游作為引物，利用 Taq DNA聚合酶從質(zhì)粒 pET28a-Ts-Pt模板上進(jìn)行PCR擴(kuò)增Ts-Pt突變體的上游和下游片段，然后以引物Ts-Pt上游和下游通過(guò)重疊PCR的方法得到 Ts-Pt突變片段。將 Ts-Pt突變片段亞克隆到pMD18-T載體中并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 DH5α。經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序正確后將Ts-Pt突變片段連接至pET-28a(+)構(gòu)建Ts-Pt突變體重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.3 Ts-Pt突變體的原核表達(dá)與蛋白純化

將Ts-Pt突變體重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta (DE3)株，經(jīng)PCR、酶切鑒定和測(cè)序正確后將重組菌接種于含卡那霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)5 h后收集菌體，經(jīng)超聲破碎儀破碎后收集沉淀。用包涵體結(jié)合緩沖液溶解包涵體，經(jīng) 0.22 μm一次性濾器過(guò)濾后利用美國(guó)GE Healthcare公司的AKTA Purifier 100系統(tǒng)純化His標(biāo)簽的表達(dá)蛋白。用透析袋梯度透析除去咪唑，采用Bradford法檢測(cè)重組蛋白的濃度。

1.2.4 SDS-PAGE

收集各種Ts-Pt突變體表達(dá)純化的重組蛋白和野生型Ts-Pt重組蛋白用于SDS-PAGE分析。取適量蛋白加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min、冰浴5 min，8 000 r/min離心5 min后取上清。將重組蛋白在12%分離膠和5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將凝膠分別于考馬斯亮藍(lán)染色液和考馬斯亮藍(lán)脫色液中進(jìn)行染色和脫色。

1.2.5 重組蛋白的復(fù)性

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)報(bào)道的包涵體復(fù)性方法進(jìn)行重組蛋白的復(fù)性[3]，即選擇 0.2 mmol/L DTT、0.3 mmol/L GSSG和3 mmol/L GSH作為復(fù)性液母液，將含有包涵體的復(fù)性液 (8 mol/L尿素) 裝入截留分子量為8 kDa的透析袋中，在4 ℃條件下，依次用含6、5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5和0 mol/L尿素的復(fù)性液進(jìn)行透析 (袋內(nèi)袋外溶液體積比為1∶50)，每4 h換液1次，同時(shí)充分?jǐn)嚢琛?/p>

表1 本研究中所用的PCR擴(kuò)增引物序列Table 1 The primer sequences for PCR amplification in this study

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定復(fù)性重組 Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性

配制 50 mmol/L 10×Acetate緩沖液 (pH 5.0)，按下列參數(shù)配制20 μL反應(yīng)體系：10×緩沖液 2 μL，鮭魚(yú)精 DNA 0.2 μg，重組 Ts-Pt突變體蛋白或野生型Ts-Pt重組蛋白10 μg，補(bǔ)充ddH2O至總體積20 μL?；靹蚝笾糜谒″?7 ℃反應(yīng) 1 h后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA降解程度并拍照。

1.2.7 重組Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶酶譜分析

核酸酶的酶譜分析與SDS-PAGE相似，差別在于酶譜在膠內(nèi)添加底物DNA，且樣品不進(jìn)行加熱處理及上樣緩沖液中不含 β-巰基乙醇。取 50 μg重組Ts-Pt突變體蛋白或野生型Ts-Pt重組蛋白，加入不含 β-巰基乙醇的上樣緩沖液，37 ℃水浴鍋孵育15 min后上樣，按10 mA/濃縮膠和20 mA/分離膠于4 ℃冰箱中進(jìn)行橫流電泳。電泳結(jié)束后取出分離膠置于平皿中，用預(yù)冷 ddH2O洗滌后于預(yù)冷復(fù)性液輕搖孵育30 min，換液4次，預(yù)冷ddH2O洗滌后轉(zhuǎn)移至37 ℃預(yù)熱的反應(yīng)液中，反應(yīng)2 d后于含有EB染料中輕搖染色10 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察膠內(nèi)底物DNA降解情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ts-Pt突變體重組表達(dá)載體的鑒定

利用重疊 PCR方法將旋毛蟲(chóng) Ts-Pt氨基酸序列第58和236位的H突變?yōu)锳或L，第58/59和60位的HCK突變?yōu)長(zhǎng)AQ，第235、236、237和238位的DHSK突變?yōu)閂LLQ，各突變體PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在750-1 000 bp之間出現(xiàn)特異性條帶，大小均與野生型Ts-Pt相等 (圖1A)。目的片段亞克隆至pMD18T構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定目的條帶與預(yù)期結(jié)果相符(圖 1B)。測(cè)序正確后回收酶切目的片段與pET-28a(+)相連構(gòu)建 Ts-Pt突變體重組表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示，各種Ts-Pt突變體重組表達(dá)質(zhì)粒的目的基因片段已成功突變。

2.2 重組Ts-Pt突變體蛋白的鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示，各種Ts-Pt突變體重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3) 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在分子質(zhì)量34-43 kDa之間均得到一條重組蛋白，大小與野生型重組Ts-Pt蛋白一致 (圖2A)。為了研究重組蛋白的核酸酶活性，利用His-Trap經(jīng)AKTA Purifier 100純化系統(tǒng)純化表達(dá)的重組蛋白 (圖2B)。但親和層析純化結(jié)果顯示，原核表達(dá)的重組Ts-Pt蛋白呈包涵體表達(dá) (圖3)。

圖1 Ts-Pt突變體的PCR擴(kuò)增和酶切鑒定Fig. 1 PCR amplification and enzyme digestion of Ts-Pt with active site mutant. (A) PCR amplification of Ts-Pt gene with active site mutant. M: DL2 000 DNA ladder; 1: ddH2O; 2: wild-type Ts-Pt; 3: H→A; 4: H→L;5: HCK→LAQ; 6: DHSK→VLLQ; 7: HCK/DHSK→LAQ/VLLQ. (B) Enzyme digestion of pMD18T-Ts-Pt with active site mutant. M: DL15 000 DNA ladder; 1:wild-type Ts-Pt; 2: H→A; 3: H→L; 4: HCK→LAQ; 5:DHSK→VLLQ; 6: HCK/DHSK→ LAQ/VLLQ.

圖2 重組Ts-Pt突變體蛋白的純化及SDS-PAGE分析Fig. 2 Purification and SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins. (A) SDS-PAGE analysis of the recombinant proteins.a: wild-type Ts-Pt; b: H→A; c: H→L; 5: HCK→LAQ; d: DHSK→VLLQ; e: HCK/DHSK→LAQ/VLLQ. M: prestained protein marker; 1: E. coli lysate without IPTG; 2: E. coli lysate with IPTG. (B) Purification of the recombinant proteins.

圖3 重組Ts-Pt蛋白的親和層析純化Fig. 3 Purification of the recombinant proteins by affinity chromatography. (A) Purification of inclusion body. (B)Purification of soluble protein.

2.3 瓊脂糖凝膠電泳法分析復(fù)性重組 Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性

收集復(fù)性的重組Ts-Pt突變體蛋白，采用瓊脂糖凝膠電泳法分析復(fù)性重組Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性，結(jié)果如圖 3所示，與 DNaseⅡ標(biāo)準(zhǔn)品相比，各種復(fù)性的重組Ts-Pt突變體蛋白并未表現(xiàn)出降解鮭魚(yú)精DNA的能力 (圖4)。

2.4 核酸酶酶譜分析重組 Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性

核酸酶酶譜分析結(jié)果顯示，在紫外燈照射下聚丙烯酰胺凝膠之間有一條黑色條帶，大小與SDS-PAGE一致 (圖5)。DNaseⅡ標(biāo)準(zhǔn)品活性較強(qiáng)，降解區(qū)域呈片狀，而B(niǎo)SA蛋白陰性對(duì)照則未見(jiàn)降解 DNA的現(xiàn)象。這說(shuō)明表達(dá)的各種Ts-Pt突變體蛋白經(jīng)SDS-PAGE的膠內(nèi)復(fù)性后能夠降解鮭魚(yú)精DNA。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳法分析重組Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性Fig. 4 Detection of the nuclease activity of the recombinant proteins by agarose gel electrophoresis. 1:ddH2O; 2: DNaseⅡ; 3: wild-type Ts-Pt; 4: H→A; 5:H→L; 6: HCK→LAQ; 7: DHSK→VLLQ; 8:HCK/DHSK→LAQ/VLLQ.

圖5 核酸酶酶譜分析重組Ts-Pt突變體蛋白的核酸酶活性Fig. 5 Detection of the nuclease activity of the recombinant proteins by nuclease-zymography. (A)Nuclease-zymography analysis of the recombinant proteins, after staining with ethidium bromide and exposure to UV light. (B) The same gel was stained with Coomassie Brilliant blue after zymography. 1: wild-type Ts-Pt; 2: DNase Ⅱ;3: BSA. 4: H→A; 5: H→L; 6: HCK→LAQ; 7: DHSK→VLLQ; 8: HCK/DHSK→LAQ/VLLQ.

3 討論

DNaseⅡ于20世紀(jì)40年代首先發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中，隨后陸續(xù)報(bào)道了其生物學(xué)特性。但直至1998年首次克隆到人類(lèi)DNaseⅡ[4]，對(duì)其研究才深入到分子水平。之后的研究發(fā)現(xiàn)，DNaseⅡ廣泛存在于低等的原核生物和高等的哺乳動(dòng)物中[5]，包括牛、馬、豬、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚(yú)、非洲蟾蜍、果蠅、海星、河豚、類(lèi)鼻疽桿菌、盤(pán)基網(wǎng)柄菌、雞痘病毒、金絲雀痘病毒、岡比亞按蚊、廣桿屬線蟲(chóng)和秀麗隱桿線蟲(chóng)等20多種生物。從目前已報(bào)道的序列上分析，大部分哺乳動(dòng)物具有DNaseⅡα和DNaseⅡβ兩種同源物，而秀麗隱桿線蟲(chóng)是已知存在最多 DNaseⅡ同源物的物種[6]，多達(dá)10余種，而其他絕大多數(shù)物種只有一種或少數(shù)幾種同源物。

旋毛蟲(chóng)是一種寄生于骨骼肌細(xì)胞的重要人獸共患胞內(nèi)寄生蟲(chóng)，約55個(gè)國(guó)家1.1億人感染，死亡率在0.2%左右，主要分布于中國(guó)、阿根廷和一些東歐國(guó)家等[7]。旋毛蟲(chóng)生活史包括新生幼蟲(chóng)、肌幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)。Mitreva等通過(guò)構(gòu)建旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)、新生幼蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng) 3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的抑制性差減雜交cDNA文庫(kù)，篩選到28個(gè)期特異性DNaseⅡ家族基因，其中成蟲(chóng)期家族12個(gè)、新生幼蟲(chóng)期家族15個(gè)、肌幼蟲(chóng)期家族1個(gè)。雖然 3個(gè)時(shí)期 DNaseⅡ間的基因相似性非常低，僅介于32%-36%，但家族內(nèi)成員的基因相似性則高達(dá) 94%-99%。但是根據(jù) 2011年公布的旋毛蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)顯示，旋毛蟲(chóng)擁有其他寄生性線蟲(chóng)和非寄生性線蟲(chóng)所無(wú)法比擬的 DNaseⅡ基因家族，達(dá)到驚人的125個(gè)DNaseⅡ蛋白家族，并且一半以上的基因被認(rèn)為編碼排泄/分泌產(chǎn)物[8]。雖然旋毛蟲(chóng)具有如此龐大的DNaseⅡ蛋白家族，但旋毛蟲(chóng)為何表現(xiàn)出完全不一樣的DNaseⅡ數(shù)量，DNaseⅡ在旋毛蟲(chóng)發(fā)育和感染中的作用以及125個(gè)DNaseⅡ蛋白家族是否真具有核酸酶活性，目前關(guān)于這些相關(guān)研究報(bào)道較少。

水解酶活性的檢測(cè)研究的方法包括瓊脂糖凝膠電泳、分光光度計(jì)和膠內(nèi)酶譜，瓊脂糖凝膠電泳法是最為直接的，但瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)法一樣存在非特異性問(wèn)題。目前特異性檢測(cè)酶活性的研究方法主要包括膠內(nèi)酶譜、原位酶譜和體內(nèi)酶譜3種酶譜方法[9-10]。膠內(nèi)酶譜已在各種生物體蛋白質(zhì)、多肽、低聚糖、多糖、脂質(zhì)以及核酸酶的檢測(cè)、分析和鑒定中得到廣泛應(yīng)用[11]。膠內(nèi)酶譜中的核酸酶酶譜是指在SDS-PAGE過(guò)程中在分離膠中加入DNA作為底物，核酸酶降解的區(qū)域EB染色在紫外燈下呈黑色條帶，可直接觀察活性核酸酶的分子量大小[12]。相對(duì)于瓊脂擴(kuò)散法的定性和分光光度計(jì)的定量，膠內(nèi)酶譜具有定性和定量的優(yōu)勢(shì)[13]，膠內(nèi)酶譜可通過(guò)分子量大小直接特異觀察核酸酶活性[10]。膠內(nèi)酶譜已成為研究核酸酶活性的一種常用方法[14]，通過(guò)膠內(nèi)核酸酶酶譜的方法已證實(shí)了許多動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)組織及其分泌排泄物的天然核酸酶。

對(duì)于真核生物表達(dá)或原核生物可溶性表達(dá)的核酸酶蛋白可直接分析核酸酶活性。但一些蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，外源基因在大腸桿菌中呈高水平表達(dá)時(shí)，由于新生肽鏈的聚集速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛋白正確折疊的速率，就會(huì)形成無(wú)活性的蛋白聚集體即包涵體[15]。分子和蛋白技術(shù)的不斷發(fā)展使得包涵體經(jīng)合適的復(fù)性過(guò)程獲得生物活性蛋白成為可能。在本研究中，在重組Ts-Pt以及各種突變體蛋白的表達(dá)過(guò)程中，通過(guò)改變各種表達(dá)參數(shù) (培養(yǎng)基、表達(dá)載體、宿主菌、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等) 仍然無(wú)法獲得可溶性蛋白。同時(shí)通過(guò)梯度稀釋、透析和柱上復(fù)性等復(fù)性方法進(jìn)行包涵體復(fù)性，利用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)復(fù)性后得到的少量蛋白進(jìn)行核酸酶活性分析，并未觀察到降解DNA的能力 (部分?jǐn)?shù)據(jù)未提供)。利用核酸酶酶譜分析呈包涵體表達(dá)的重組Ts-Pt及突變體蛋白，結(jié)果證明了表達(dá)蛋白具有核酸酶活性。但是需要指出的是，完全闡明包涵體表達(dá)的蛋白經(jīng)膠內(nèi)酶譜表現(xiàn)出活性的確切理論對(duì)于目前現(xiàn)有的技術(shù)仍是個(gè)挑戰(zhàn)。從包涵體的體外溶解變性和復(fù)性原理可能可以解釋這種膠內(nèi)變性復(fù)性的機(jī)制[16-17]，即在不含 β-巰基乙醇的上樣緩沖液中，高密度聚集的包涵體于 SDS作用下溶解形成中間體，同時(shí)在整個(gè)SDS-PAGE過(guò)程中也處于一個(gè)變性環(huán)境足以有效防止聚集，膠內(nèi)的 SDS可以很容易地利用含有Triton X-100或奶粉的復(fù)性液除去[14,18]，從而促使中間體重新折疊成蛋白的天然構(gòu)象，起到蛋白復(fù)性的作用[19-20]。

據(jù)報(bào)道，旋毛蟲(chóng)排泄/分泌產(chǎn)物中存在活性核酸內(nèi)切酶[21-22]。有學(xué)者認(rèn)為，旋毛蟲(chóng) p43、SS1和AAK85403三個(gè)蛋白的氨基酸與人類(lèi)DNase Ⅱ表現(xiàn)出一定的相似性，但3個(gè)蛋白的氨基酸序列在N端和C端均不存在DNaseⅡ經(jīng)典的活性區(qū)域HKD基序[23]，并且未對(duì)p43、SS1和AAK85403三個(gè)蛋白進(jìn)行核酸酶活性分析。氨基酸序列N端和 C端的兩個(gè) HKD基序 (H-x-K-x(4)-D) 是DNaseⅡ經(jīng)典的活性位點(diǎn)區(qū)域，DNaseⅡ?qū)儆趩误w核酸酶，其催化作用的活性中心由兩個(gè) HKD基序形式假二聚體構(gòu)成[24]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Ts-Pt在N端和C端保守區(qū)域具有2個(gè)HKD基序，且原核表達(dá)的重組Ts-Pt蛋白在核酸酶酶譜中表現(xiàn)出一定的核酸酶活性[2]。因此，本研究通過(guò)重疊PCR方法對(duì)Ts-Pt的活性位點(diǎn)N端和C端的H、HCK和DHSK進(jìn)行突變，利用核酸酶酶譜分析各種重組突變體蛋白的核酸酶活性。令人驚奇的是，各種重組突變體蛋白均表現(xiàn)出降解DNA的能力。因此，可以提出一個(gè)科學(xué)命題：DNaseⅡ是否是依賴于HKD基序發(fā)揮活性？雖然本研究未能解釋這種現(xiàn)象的原因，但值得深入探究。雖然吳秀萍等對(duì)旋毛蟲(chóng)新生幼蟲(chóng)期脫氧核糖核酸酶T31D4的核酸酶活性及活性位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定[25]，但該研究并未證實(shí)組氨酸位點(diǎn)是 DNaseⅡ的真正活性氨基酸位點(diǎn)。

REFERENCES:

[1] Sch?fer P, Cymerman IA, Bujnicki JM, et al.Human lysosomal DNase IIα contains two requisite PLD-signature (HxK) motifs: evidence for a pseudodimeric structure of the active enzyme species. Protein Sci, 2007, 16(1): 82–91.

[2] Liao CS, Liu MY, Bai X, et al. Characterisation of a plancitoxin-1-like DNase Ⅱ gene in Trichinella spiralis. PLoS Negl Trop Dis, 2014,8(8): e3097.

[3] Zhang SH, Jia WZ, Luo XN, et al. Renaturation,purification and antigenicity identification of recombinant protein of Cysticercus cellulosae expressed in Escherichia coli. Chin J Biotech,2008, 24(8): 1490–1495 (in Chinese).張少華, 賈萬(wàn)忠, 駱學(xué)農(nóng), 等. 豬囊尾蚴 CE18重組蛋白的復(fù)性純化及抗原性鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(8): 1490–1495.

[4] Yasuda T, Takeshita H, Iida R, et al. Molecular cloning of the cDNA encoding human deoxyribonuclease Ⅱ. J Biol Chem, 1998, 273(5):2610–2616.

[5] Evans CJ, Aguilera RJ. DNase II: genes, enzymes and function. Gene, 2003, 322: 1–15.

[6] Lai HJ, Lo SJ, Kage-Nakadai E, et al. The roles and acting mechanism of Caenorhabditis elegans DNase Ⅱ genes in apoptotic DNA degradation and development. PLoS ONE, 2009, 4(10): e7348.

[7] Gottstein B, Pozio E, N?ckler K. Epidemiology,diagnosis, treatment, and control of trichinellosis.Clin Microbiol Rev, 2009, 22(1): 127–145.

[8] Mitreva M, Jasmer DP, Zarlenga DS, et al. The draft genome of the parasitic nematode Trichinella spiralis. Nat Genet, 2011, 43(3): 228–235.

[9] Vandooren J, Geurts N, Martens E, et al.Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nat Methods, 2013, 10(3): 211–220.

[10] Napirei M, Ricken A, Eulitz D, et al. Expression pattern of the deoxyribonuclease 1 gene: lessons from the Dnase1 knockout mouse. Biochem J,2004, 380(3): 929–937.

[11] Fischer H, Scherz J, Szabo S, et al. DNase 2 is the main DNA-degrading enzyme of the stratum corneum. PLoS ONE, 2011, 6(3): e17581.

[12] Rosenthal AL, Lacks SA. Nuclease detection in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem, 1977, 80(1): 76–90.

[13] Budi? M, Kidri? M, Megli? V, et al. A quantitative technique for determining proteases and their substrate specificities and pH optima in crude enzyme extracts. Anal Biochem, 2009, 388(1):56–62.

[14] Wilkesman J, Kurz L. Protease analysis by zymography: a review on techniques and patents.Recent Pat Biotechnol, 2009, 3(3): 175–184.

[15] Fang M, Huang HL. Advances in in vitro refolding of inclusion body proteins. Chin J Biotech, 2001,17(6): 608–612 (in Chinese).方敏, 黃華樑. 包涵體蛋白體外復(fù)性的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2001, 17(6): 608–612.

[16] De Bernardez Clark E. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol, 1998, 9(2):157–163.

[17] Eiberle MK, Jungbauer A. Technical refolding of proteins: do we have freedom to operate?Biotechnol J, 2010, 5(6): 547–559.

[18] Ludwig S, Mannherz HG, Schmitt S, et al. Murine serum deoxyribonuclease 1 (Dnase1) activity partly originates from the liver. Int J Biochem Cell Biol, 2009, 41(5): 1079–1093.

[19] Boone DL, Tsang BK. Non-isotopic technique for the identification of endonucleases involved in apoptosis. Biotechniques, 1997, 22(4): 648–649.

[20] Thimon V, Belghazi M, Labas V, et al. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates providesidentification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Anal Biochem, 2008,375(2): 382–384.

[21] Mak CH, Ko RC. Characterization of endonuclease activity from excretory/secretory products of a parasitic nematode, Trichinella spiralis. Eur J Biochem, 1999, 260(2): 477–481.

[22] Liu RD, Qi X, Sun GG, et al. Proteomic analysis of Trichinella spiralis adult worm excretorysecretory proteins recognized by early infection sera. Vet Parasitol, 2016, 231: 43–46.

[23] MacLea KS, Krieser RJ, Eastman A. A family history of deoxyribonuclease Ⅱ: surprises from Trichinella spiralis and Burkholderia pseudomallei.Gene, 2003, 305(1): 1–12.

[24] Cheng YC, Hsueh CC, Lu SC, et al. Identification of three crucial histidine residues (His115, His132and His297) in porcine deoxyribonuclease Ⅱ.Biochem J, 2006, 398(2): 177–185.

[25] Wu XP, Yu L, Wang XL, et al. Identification of enzymatic activity and activity sites of DNase Ⅱprotein from Trichinella spiralis. J Jilin Agric Univ, 2010, 32(2): 209–213 (in Chinese).吳秀萍, 于錄, 王學(xué)林, 等. 旋毛蟲(chóng)脫氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位點(diǎn)的鑒定. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(2): 209–213.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Nuclease activity of the recombinant plancitoxin-1-like proteins with mutations in the active site from Trichinella spiralis

Chengshui Liao1, Xiaoli Wang2, Wenjing Tian1, Mengke Zhang1, Chunjie Zhang1,Yinju Li1, Tingcai Wu1, and Xiangchao Cheng1,3

1 Luoyang Key Laboratory of Live Carrier Biomaterial and Animal Disease Prevention and Control, College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China 2 Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, Henan, China 3 Luoyang Vocational and Technical College, Luoyang 471099, Henan, China

Although there are 125 predicted DNase Ⅱ-like family genes in the Trichinella spiralis genome,plancitoxin-1-like (Ts-Pt) contains the HKD motif, a typical conserved region of DNase Ⅱ, in N- and C-terminal. It is generally believed that histidine is the active site in DNase Ⅱ. To study the nuclease activity of recombinant Ts-Pt with mutations in the active site from T. spiralis, different fragments of the mutated Ts-Pt genes were cloned using overlap PCR technique and inserted into the expressing vector pET-28a(+), and transformed into Escherichia coli Rosseta (DE3). The fusion proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography and SDS-PAGE. Nuclease activity of the recombinant proteins was detected by agarose gel electrophoresis and nuclease-zymography. The recombinant plasmids harboring the mutated Ts-Pt genes were constructed and expressed as inclusive body in a prokaryotic expression system. After renaturation in vitro, the recombinant proteins had no nuclease activity according to agarose gel electrophoresis. However,the expressed proteins as inclusive body displayed the ability to degrade DNA after renaturation in gel. And the nuclease activity was not affected after subjected to mutation of active site in N- and C-termini of Ts-Pt. These results provide the basis to study the relationship between DNase Ⅱ-like protein family and infection of T. spiralis.

Trichinella spiralis, plancitoxin-1-like, active site, mutation, nuclease

January 10, 2017; Accepted: May 8, 2017

s：Chengshui Liao. E-mail: liaochengshui33@163.com Xiangchao Cheng. E-mail: chengxch@126.com

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31572489), Henan Science and Technology Key Project (No.152102110078), Key Project of Henan Province for Scientific Research Higher Education of China Colleges and Universities (No.17A230009), PhD Start-up Fund of Henan University of Science and Technology (No. 13480071).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31572489)，河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目 (No. 152102110078)，河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃 (No.17A230009)，河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目 (No. 13480071) 資助。