藍(lán)舌病病毒4型特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

李佳璇，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，徐義剛，劉敏，喬薪瑗，王麗，周晗，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

藍(lán)舌病病毒4型特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

李佳璇，臧明鑫，謝雙羽，姜艷平，崔文，徐義剛，劉敏，喬薪瑗，王麗，周晗，李一經(jīng)，唐麗杰

東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030

李佳璇, 臧明鑫, 謝雙羽, 等. 藍(lán)舌病病毒 4型特異性競(jìng)爭(zhēng) ELISA檢測(cè)方法的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(8):1284–1291.

Li JX, Zang MX, Xie SY, et al. Establishment of two competitive ELISAs for specific detection of bluetongue virus serotype 4.Chin J Biotech, 2017, 33(8): 1284–1291.

旨在建立藍(lán)舌病病毒4型 (BTV-4) 特異性抗體ELISA檢測(cè)方法，為藍(lán)舌病的免疫學(xué)診斷提供新的技術(shù)。利用制備的兩株抗4型BTV VP2蛋白的單克隆抗體4A-1G7和4B-1B6，建立BTV-4特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)方法。利用該方法同時(shí)對(duì) 50份羊和牛 BTV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，分別確定兩種方法阻斷率臨界值為49%和40%。利用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)的試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性符合OIE通用標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，4A-1G7和4B-1B6兩種競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法聯(lián)合作用，可以檢測(cè)感染4、18和20型BTV的血清。研究結(jié)果為建立以上各型BTV的檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。

藍(lán)舌病病毒，競(jìng)爭(zhēng)ELISA，單克隆抗體，VP2蛋白

藍(lán)舌病 (Bluetongue，BT) 是一種烈性非接觸性傳染病，主要經(jīng)節(jié)肢動(dòng)物 (庫(kù)蠓和伊蚊等)傳播，可感染反芻動(dòng)物如牛、綿羊、山羊、鹿、非洲羚羊、駱駝等[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病[2]。BT廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。藍(lán)舌病病毒 (Bluetongue virus，BTV) 血清型眾多，目前至少有27個(gè)血清型，新發(fā)現(xiàn)的28型和29型還在鑒定中[3-4]。通過(guò)BT流行病學(xué)調(diào)查，中國(guó)共在31個(gè)省、市 (區(qū)) 發(fā)現(xiàn)BTV抗體陽(yáng)性家畜，并從云南、湖北和安徽等地自然感染羊體中分離獲得 BTV[5]。據(jù)報(bào)道，我國(guó)已檢測(cè)出BTV-1、BTV-2、BTV-3、BTV-4、BTV-5、BTV-7、BTV-10、BTV-12、BTV-15、BTV-16、BTV-20和 BTV-24等 12種血清型[6-7]，目前 BTV-1、BTV-4和BTV-20是廣西優(yōu)勢(shì)的血清型，在全區(qū)廣泛分布；而江蘇、內(nèi)蒙古、云南等地區(qū)均檢測(cè)到 BTV-1、BTV-7、BTV-10和 BTV-16型，當(dāng)前國(guó)內(nèi)BT流行的血清型有了新的變化[8-10]。

BTV是由10個(gè)基因片段組成的雙股RNA病毒，分別編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1-VP7) 和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1、NS2、NS3/NS3a和NS4)[11]。VP2蛋白是BTV外殼蛋白的主要成分，同時(shí)是BTV血清型的主要決定因素[12-13]。VP2蛋白為型特異性蛋白，可以用來(lái)區(qū)別BTV各血清型間的不同[14]。

競(jìng)爭(zhēng)ELISA (C-ELISA) 是檢測(cè)BTV抗體的一種常用方法[15]。C-ELISA方法可用于多種動(dòng)物血清抗原檢測(cè)，其特異性和敏感性高、成本低，廣泛用于臨床藍(lán)舌病的診斷檢測(cè)中[16-17]。本實(shí)驗(yàn)采用針對(duì)BTV4型 (BTV-4) VP2蛋白的型特異性單克隆抗體[18]作為競(jìng)爭(zhēng)性抗體與待檢測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)抑制率大小來(lái)判定樣品血清的來(lái)源動(dòng)物是否感染 BTV，建立了一種快速、敏感的BTV型特異性檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 單克隆抗體、動(dòng)物血清與主要試劑

抗BTV-4 VP2的單克隆抗體4A-1G7 (抗體亞類為 IgG1，抗原表位為160NH161)、4B-1B6 (抗體亞類 IgG1，抗原表位為501SRS503)和 BTV-4 VP2-A/B蛋白由本實(shí)驗(yàn)室保存[12]；1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 (抗體滴度為 1∶640-1∶1 280)及陰性血清購(gòu)自The Pirbright Institute藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)自中杉金橋有限公司；BTV抗體 ELISA試劑盒 (TSI公司) 購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；70份血清樣品中5份綿羊、5份山羊和10份牛血清樣品來(lái)自于黑龍江的某養(yǎng)殖場(chǎng)，25份綿羊、25份山羊血清樣品來(lái)自于內(nèi)蒙古；TMB顯色液購(gòu)自北京奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 單抗的大量制備及純化

用腹水法大量制備單抗4A-1G7和4B-1B6。將制備的腹水采用 Protein G蛋白純化柱純化(GE公司)。

1.3 優(yōu)化C-ELISA反應(yīng)條件

將 BTV-4 VP2-A/B蛋白分別以 1 μg/孔、2 μg/孔、5 μg/孔、10 μg/孔包被，分別包被 1 h、2 h、3 h；再將純化的單抗 (4A-1G7和4B-1B6的蛋白濃度分別為 4.2 mg/mL和 5.3 mg/mL)用稀釋液稀釋至1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000倍；BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清用PBS稀釋液進(jìn)行 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320倍稀釋選擇最佳待檢樣品加入量，進(jìn)行矩陣交叉BTV C-ELISA方法檢測(cè)，確定最佳稀釋倍數(shù)，將腹水稀釋液和血清樣品混合加入ELISA反應(yīng)板中；同時(shí)，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為1 h、2 h、3 h，確定各步驟最佳反應(yīng)時(shí)間。TMB顯色反應(yīng)時(shí)間分別為10 min、15 min、20 min，確定最佳顯色時(shí)間。根據(jù)優(yōu)化反應(yīng)劑量和時(shí)間的結(jié)果，確定該檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

1.4 血清樣品的鑒定

按照BTV抗體ELISA試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)70份血清樣品，確定樣品血清的來(lái)源動(dòng)物是否感染BTV。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

利用1.3建立的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)50份陰性綿羊、山羊和牛陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得血清OD450，計(jì)算阻斷率，計(jì)算公式為 PI (阻斷率)={1-(ODx-ODmin)/(ODmax-ODmin)}×100% (ODmax為不加樣品時(shí)的吸光值，ODx為樣品的吸光值，ODmin為空白對(duì)照孔的吸光值)。計(jì)算50份血清樣本 PI值的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)方差(s)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，將+2s設(shè)定為樣本的陰、陽(yáng)性血清的臨界值。樣本的PI值＞+2s時(shí)，可以在99.9%的水平上判為陽(yáng)性。

1.6 特異性試驗(yàn)

利用兩種C-ELISA分別檢測(cè)1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及陰性樣品各10份，按照1∶200稀釋倍數(shù)，每孔 100 μL加樣。分別評(píng)價(jià)基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將 BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清做 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160 和 1∶320 7 個(gè)稀釋度，分別用基于4A-1G7和4B-1B6單抗建立的 C-ELISA檢測(cè)不同稀釋度血清，分析該C-ELISA可以檢測(cè)到的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的最小稀釋度，判斷該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取10份血清，用3次包被的酶標(biāo)板，各進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)，評(píng)價(jià)重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)

以1.3方法確定的最佳反應(yīng)條件，以1.5方法確定的阻斷率臨界值為標(biāo)準(zhǔn)，共檢測(cè)了20份BTV陽(yáng)性血清，并與群特異性BTV抗體ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品的鑒定

經(jīng)BTV群特異性抗體ELISA試劑盒檢測(cè)，70份血清樣品中，50份血清樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性，20份血清為陽(yáng)性。

2.2 優(yōu)化反應(yīng)條件

反應(yīng)體系及反應(yīng)條件經(jīng)優(yōu)化后試劑的最佳稀釋度和反應(yīng)條件見(jiàn)表 1、2。該批次檢測(cè)用抗原PBS稀釋，待檢樣品每孔加入100 μL。

表1 基于4A-1G7的C-ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions for the 4A-1G7-based C-ELISA

表2 基于4B-1B6的C-ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 2 The optimized conditions for the 4B-1B6-based C-ELISA

2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

采用優(yōu)化后的基于4A-1G7的C-ELISA檢測(cè)方法對(duì)50份羊和牛BTV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，抑制率和血清份數(shù)分布見(jiàn)圖1。測(cè)定OD450值，本次檢測(cè)阻斷率平均值為21%，標(biāo)準(zhǔn)差為13%，根據(jù)公式+2s計(jì)算，陽(yáng)性和陰性結(jié)果判定的臨界值為 49%。最終確定陰陽(yáng)性判定阻斷率臨界值為抗原對(duì)照平均 OD450的 49%，即阻斷率大于或等于49%的判為BTV陽(yáng)性血清。

用優(yōu)化后的基于 4B-1B6的 C-ELISA檢測(cè)方法對(duì)50份羊和牛BTV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，抑制率和血清份數(shù)分布見(jiàn)圖2。該方法檢測(cè)阻斷率平均值為23%，標(biāo)準(zhǔn)差為5%，根據(jù)公式計(jì)算，陽(yáng)性和陰性結(jié)果判定的臨界值為 33%，考慮到個(gè)別樣品接近 40%的抑制率，最終確定阻斷率大于或等于40%的判為BTV陽(yáng)性血清。

2.4 敏感性分析

分別采用優(yōu)化后的檢測(cè)方法檢測(cè)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)BTV-4陽(yáng)性血清，其中基于4A-1G7的C-ELISA檢測(cè)結(jié)果為稀釋度1∶80時(shí)，PI＞49%；基于4B-1B6的C-ELISA檢測(cè)結(jié)果為稀釋度1∶40時(shí)，PI＞40%。

圖1 基于4A-1G7的C-ELISA檢測(cè)方法對(duì)陰性血清抑制率及對(duì)應(yīng)血清份數(shù)分布圖Fig. 1 The assay of negative serum samples of the 4A-1G7-based C-ELISA.

圖2 基于 4B-1B6的 C-ELISA檢測(cè)方法對(duì)陰性血清抑制率及對(duì)應(yīng)血清份數(shù)分布圖Fig. 2 The assay of negative serum samples of the 4B-1B6-based C-ELISA.

2.5 特異性分析

采用建立地方法檢測(cè)1-24型BTV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品及標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品，結(jié)果如表 3所示。結(jié)果表明兩種檢測(cè)方法可以檢測(cè)到BTV-4標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，但是對(duì)其他血清型的BTV病毒抗血清有一定的交叉反應(yīng)。然而，兩種檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，當(dāng)兩種方法檢測(cè)結(jié)果共同為陽(yáng)性時(shí)，該樣品為BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動(dòng)物血清，即可以區(qū)分出BTV-4、BTV-18和BTV-20與其他血清型的BTV感染后的動(dòng)物血清。

表3 BTV-4特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA的特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Table 3 The specificity test of BTV-4-specific competitive ELISAs

2.6 重復(fù)性分析

利用3批次試劑對(duì)10份綿羊血清分別用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，所有試劑均為不同批次，檢測(cè)結(jié)果表明同一份血清檢測(cè)試劑批次間的變異系數(shù)在4%-10%，無(wú)顯著差異。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

將經(jīng)BTV群特異性ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的20份BTV血清樣品，經(jīng)基于4A-1G7和4B-1B6的C-ELISA方法檢測(cè)均為陽(yáng)性的樣品含有3個(gè)，該檢測(cè)樣品為BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動(dòng)物血清，排除其他血清型的感染，可以初步區(qū)分檢測(cè)樣品來(lái)源動(dòng)物感染 BTV的血清型。

3 討論

近些年，隨著全球氣候變暖，藍(lán)舌病在世界各地不斷暴發(fā)，BTV血清型眾多[19]，且各型之間交叉免疫性差[20-21]，因此建立一種可以檢測(cè)BTV各血清型的快速、敏感性的檢測(cè)方法尤為重要[22]。BT血清抗體效價(jià)檢測(cè)是了解BT感染情況、檢測(cè)疫苗免疫效果的必要手段，目前BT血清抗體檢測(cè)的主要方法之一是競(jìng)爭(zhēng)ELISA[23]。目前，國(guó)內(nèi)主要研究了BTV群特異性的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，未見(jiàn)有對(duì)BTV的型特異性競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法建立。本研究中，分別采用4型BTV VP2-A/B蛋白為包被抗原，分別用抗BTV-4 VP2單克隆抗體4A-1G7、4B-1B6為競(jìng)爭(zhēng)抗體，建立了兩種競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

特異性強(qiáng)和敏感性高是ELISA檢測(cè)方法的最大優(yōu)點(diǎn)，微量的樣品就能引起高效的抗原抗體反應(yīng)[24]，因此，準(zhǔn)確選擇抗原的包被濃度和血清樣品的稀釋度是ELISA實(shí)驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)之一。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品、陰性樣品和臨床樣品的檢測(cè)，分析表明這兩種方法具有良好的特異性和敏感性[25-26]。用兩種C-ELISA方法的靈敏度進(jìn)行了檢測(cè)，確定該C-ELISA的檢測(cè)靈敏度分別為1∶80、1∶40。國(guó)外有報(bào)道的類似產(chǎn)品可檢測(cè)的血清稀釋度范圍為 1∶15–1∶220[25]，可見(jiàn)，兩種方法的靈敏度符合C-ELISA的鑒定范圍。本研究建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的敏感性、特異性和重復(fù)性符合OIE《哺乳動(dòng)物、禽類和蜜蜂A和B類疾病診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)[27]。

同時(shí)，利用基于 4A-1G7和 4B-1B6的C-ELISA方法聯(lián)合應(yīng)用可以區(qū)分出 BTV-4、BTV-18或 BTV-20感染的血清型。用基于4A-1G7的C-ELISA方法檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品，為BTV-3、BTV-4、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-18、BTV-19、BTV-20、BTV-22或 BTV-24感染的動(dòng)物血清；用基于4B-1B6的C-ELISA方法檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品，為BTV-4、BTV-5、BTV-9、BTV-12、BTV-14、BTV-17、BTV-18、BTV-20 或BTV-21感染的動(dòng)物血清。當(dāng)同一個(gè)樣品用兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，該樣品為 BTV-4、BTV-18或BTV-20感染的動(dòng)物血清，即可以區(qū)分出BTV-4、BTV-18和BTV-20與其他血清型的BTV感染后的動(dòng)物血清。如果兩種方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性，待檢樣品可能為BTV-1、BTV-2、BTV-6、BTV-7、BTV-8、BTV-10、BTV-15 或BTV-23型感染的動(dòng)物血清；如果 4A-1G7的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性而 4B-1B6的結(jié)果為陰性，待檢樣品可能為BTV-3、BTV-11、BTV-13、BTV-16、BTV-19、BTV-22或 BTV-24型感染的動(dòng)物血清；如果4A-1G7的檢測(cè)結(jié)果為陰性而4B-1B6的結(jié)果為陽(yáng)性，待檢樣品可能為 BTV-5、-9、-12、-14、-17或-21型感染的動(dòng)物血清。BTV-4 VP2 (GenBank Accession No. AM132566356) 與BTV-18 VP2 (No. KX442585.1) 和BTV-22 VP2(No. AJ585141.1) 的氨基酸序列同源性分別為52%和70%。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析4A-1G7 (160NH161)、4B-1B6 (501SRS503) 抗原表位與 BTV-18、BTV-20 VP2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)BTV-18 VP2的第 163–164位為 NH 片段，395–397位為 SRS片段；發(fā)現(xiàn)BTV-20 VP2 161–162位為NH片段，502–503位為 SRS片段。Maan等推測(cè)[12,28]，BTV-18 VP2的 163–164位、395–397位，能夠識(shí)別 BTV-18；BTV-20 VP2的 502–503位能夠識(shí)別 BTV-20，與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果相符合，即4A-1G7 C-ELISA和4B-1B6 C-ELISA兩種方法檢測(cè)BTV-4、BTV-18、BTV-20結(jié)果均應(yīng)為陽(yáng)性。

本研究采用針對(duì)BTV VP2型特異性單克隆抗體4A-1G7和4B-1B6建立C-ELISA，該檢測(cè)方法短時(shí)間內(nèi) (3-4 h)，可以用于初步區(qū)分不同型BTV感染的動(dòng)物血清，并且實(shí)驗(yàn)條件要求低，具有型特異性，可用于大規(guī)模的血清抗體普查，并且本研究為下一步建立BTV型特異性檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

REFERENCES:

[1] Maan S, Maan NS, Nomikou K, et al. Complete Genome characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait. PLoS ONE, 2011,6(10): e26147.

[2] Song HM, Yang T, Ma JN, et al. Prokaryotic expression of bluetongue virus VP7 gene. Chin J Prev Vet Med, 2009, 31(12): 925–928 (in Chinese).宋紅梅, 楊濤, 馬健男, 等. 藍(lán)舌病病毒VP7基因的原核表達(dá). 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009,31(12): 925–928.

[3] Maan S, Maan NS, Belaganahalli MN, et al.Full-genome sequencing as a basis for molecular epidemiology studies of bluetongue virus in India.PLoS ONE, 2015, 10(6): e0131257.

[4] Maan S, Maan NS, Batra K, et al. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays for rapid identification of eastern and western strains of bluetongue virus in India. J Virol Methods, 2016, 234: 65–74.

[5] Franco Mahecha OL, Ogas Castells ML,Combessies G, et al. Single dilution avidityblocking ELISA as an alternative to the bovine viral diarrhea virus neutralization test. J Virol Methods, 2011, 175(2): 228–235.

[6] Li N, Zhu JB, Xiao L, et al. Sequence analysis of bluetongue virus 1 M6 gene in Yunnan Province.China Anim Husb Vet Med, 2016, 43(2): 340–347(in Chinese).李楠, 朱建波, 肖雷, 等. 云南藍(lán)舌病病毒 1型毒株 M6基因序列分析. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2016,43(2): 340–347.

[7] Yang H, Lü MN, Sun MF, et al. Complete genome sequence of the first bluetongue virus serotype 7 isolate from China: evidence for entry of Africanlineage strains and reassortment between the introduced and native strains. Arch Virol, 2016,161(1): 223–227.

[8] Zhang YX. Virus neutralization test, insect vector investigation, isolation, identification and preliminary study on pathogenicity of bluetongue virus in Guangxi[D]. Nanning: Guangxi University, 2016(in Chinese).張怡軒. 廣西 BTV感染及傳播媒介調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究[D]. 南寧: 廣西大學(xué), 2016.

[9] Zhang SN, Li HC, Zhu JB, et al. The epidemiological survey and serotype identification of bluetongue disease and the epizootic hemorrhage disease in Inner Mongolia in 2015. Chin J Prev Vet Med, 2016, 38(12): 939–943 (in Chinese).張勝男, 李華春, 朱建波, 等. 2015年內(nèi)蒙古地區(qū)藍(lán)舌病及流行性出血熱流行病學(xué)調(diào)查及血清型鑒定. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2016, 38(12): 939–943.

[10] Xiao L, Meng JX, Li N, et al. Isolation and identification of bluetongue virus in 2012 in Shizong county of Yunnan Province. Chin J Vet Parasitol, 2014, 22(4): 1–6 (in Chinese).肖雷, 孟錦昕, 李楠, 等. 云南省師宗縣藍(lán)舌病病毒的分離及鑒定. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2014,22(4): 1–6.

[11] Verwoerd DW, Louw H, Oellermann RA.Characterization of bluetongue virus ribonucleic acid. J Virol, 1970, 5(1): 1–7.

[12] Maan S, Maan NS, Samuel AR, et al. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes. J Gen Virol, 2007, 88(2): 621–630.

[13] Balam D, Daggupati S, Maddireddy H. Studies ofthe antigenic relationships between bluetongue virus serotypes 2, 9 & 15 isolated in Andhra Pradesh, India. Vet World, 2011, 4(10): 444–448.

[14] Wang WS, Sun EC, Xu QY, et al. Identification of two novel BTV16-specific B cell epitopes using monoclonal antibodies against the VP2 protein. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(13): 5933–5942.

[15] Naresh A, Prasad G. Relative superiority of c-ELISA for detection of bluetongue virus antibodies.Indian J Exp Biol, 1995, 33(11): 880–882.

[16] Fehrsen J, Van Wyngaardt W, Mashau C, et al.Serogroup-reactive and type-specific detection of bluetongue virus antibodies using chicken scFvs in inhibition ELISAs. J Virol Methods, 2005,129(1): 31–39.

[17] Xu QY, Sun EC, Yang T, et al. Isolation of a Bluetongue virus group-specific monoclonal antibody and application to a diagnostic competitive ELISA.Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(2): 729–739.

[18] Liu Q. Prokaryotic expression of VP7 and VP2 of Bluetongue virus and preparation of monoclonal antibodies[D]. Harbin: Northeast Agricultural University, 2015 (in Chinese).劉琦. 藍(lán)舌病病毒VP7和VP2蛋白的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[19] Oryan A, Amrabadi O, Mohagheghzadeh M.Seroprevalence of bluetongue in sheep and goats in southern Iran with an overview of four decades of its epidemiological status in Iran. Comp Clin Pathol, 2014, 23(5): 1515–1523.

[20] Savini G, Hamers C, Conte A, et al. Assessment of efficacy of a bivalent BTV-2 and BTV-4 inactivated vaccine by vaccination and challenge in cattle. Vet Microbiol, 2009, 133(1/2): 1–8.

[21] Mellor PS, Carpenter S, Harrup L, et al.Bluetongue in Europe and the Mediterranean Basin: history of occurrence prior to 2006. Prev Vet Med, 2008, 87(1/2): 4–20.

[22] Patel A, Roy P. The molecular biology of Bluetongue virus replication. Virus Res, 2014, 182: 5–20.

[23] Feenstra F, Pap JS, van Rijn PA. Application of bluetongue Disabled Infectious Single Animal(DISA) vaccine for different serotypes by VP2 exchange or incorporation of chimeric VP2.Vaccine, 2015, 33(6): 812–818.

[24] Afshar A, Thomas FC, Wright PF, et al.Comparison of competitive ELISA, indirect ELISA and standard AGID tests for detecting blue-tongue virus antibodies in cattle and sheep.Vet Rec, 1989, 124(6): 136–141.

[25] Crafford JE, Guthrie AJ, Van Vuuren M, et al. A competitive ELISA for the detection of group-specific antibody to equine encephalosis virus. J Virol Methods, 2011, 174(1/2): 60–64.

[26] Miao HS, Li L, Zhu JB, et al. Establishment of the blocking ELISA method for detection of the antibody titer against bluetongue virus. Chin J Prev Vet Med, 2014, 36(2): 111–115 (in Chinese).苗海生, 李樂(lè), 朱建波, 等. 藍(lán)舌病病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)方法的建立. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 36(2): 111–115.

[27] Kouba V. Book review: terrestrial animal health code 2005. Office International of Epizootics, 634 pages. Acta Veterinaria Brno, 2006, 75(3): 465–476.

[28] Maan NS, Maan S, Belaganahalli MN, et al.Identification and differentiation of the twenty six bluetongue virus serotypes by RT–PCR amplification of the serotype-specific genome segment 2. PLoS ONE, 2012, 7(2): e32601.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Establishment of two competitive ELISAs for specific detection of bluetongue virus serotype 4

Jiaxuan Li, Mingxin Zang, Shuangyu Xie, Yanping Jiang, Wen Cui, Yigang Xu,Min Liu, Xinyuan Qiao, Li Wang, Han Zhou, Yijing Li, and Lijie Tang

College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, Heilongjiang, China

To develop a clinical diagnosis technique for bluetongue virus infection, we established serotype-specific methods to detect serotype 4 of bluetongue virus (BTV-4). Two monoclonal antibodies (mAbs) against VP2 protein ofBTV-4, named 4A-1G7 and 4B-1B6, were used as competitive antibodies in the competitive enzyme-linked immunosorbent assays (C-ELISA). We detected 50 negative serum samples from sheep, goats and cattle by C-ELISA. The cut-off values of 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs were 49% and 40%, respectively. The results of the sensitivity, specificity and repeatability by detecting standard positive serum, were consistent with the general standard of Office International Des Epizooties.Furthermore, serum samples of BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infection could be screened out through the combined C-ELISAs by 4A-1G7 and 4B-1B6 mAbs. Thus, this technique may diagnose BTV-4, BTV-18 and BTV-20 infections.

bluetongue virus serotype 4, competitive ELISA, monoclonal antibody, VP2 protein

March 25, 2017; Accepted: June 5, 2017

s：Lijie Tang. Tel: +86-451-55190824; E-mail: tanglijie@163.com Yijing Li. Tel: +86-451-55190363; E-mail: yijingli@163.com

Supported by: National Key Technology R&D Program of China (No. 2013BAD12B01).

國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (No. 2013BAD12B01) 資助。