CREB-shRNA對氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)和凋亡的影響*

王 來， 楚方旋， 耿慧霞， 董瑞瑞， 祝世功

(河南大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院，2護(hù)理與健康學(xué)院， 河南 開封 475001；3北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理與病理生理學(xué)系， 北京 100191)

CREB-shRNA對氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)和凋亡的影響*

王 來1， 楚方旋1， 耿慧霞2△， 董瑞瑞3， 祝世功3△

(河南大學(xué)1生命科學(xué)學(xué)院，2護(hù)理與健康學(xué)院， 河南 開封 475001；3北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理與病理生理學(xué)系， 北京 100191)

目的： 探討沉默CREB基因?qū)ρ跆莿儕Z/復(fù)氧神經(jīng)元線粒體形態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響。方法: 3條靶向CREB基因的shRNA片段插入慢病毒載體pLentiLox3.7(PLL)，與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒顆粒后感染原代皮層神經(jīng)元，Western blot檢測CREB蛋白的沉默情況；分別用MitoTracker red、TUNEL和Western blot實驗檢測氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)CREB基因沉默后神經(jīng)元的線粒體形態(tài)、細(xì)胞凋亡和Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。結(jié)果: pLL-CREB-shRNA1為最有效的shRNA，其抑制皮層神經(jīng)元CREB基因表達(dá)率高達(dá)80%。CREB基因沉默促進(jìn)氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體向點狀、片段化形態(tài)改變，同時降低Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax的表達(dá)并加重細(xì)胞凋亡(P<0.05)。結(jié)論: CREB-shRNA重組慢病毒載體可特異性抑制神經(jīng)元CREB基因的表達(dá)，CREB基因沉默加重氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

CREB基因; 重組慢病毒載體; 神經(jīng)元; 氧糖剝奪/復(fù)氧; 線粒體

腦卒中患者約占所有心腦血管疾病患者的30%，具有較高的致殘致死率，給家庭和社會帶來巨大的心理和經(jīng)濟壓力。缺血再灌注所致神經(jīng)元損傷或凋亡是腦卒中患者重要的病理過程，目前主要有神經(jīng)元的興奮性毒性、鈣離子超載、活性氧生成和炎癥反應(yīng)等多種機制闡釋該過程的發(fā)生[1]。神經(jīng)元以氧化磷酸化作為細(xì)胞能量的主要來源，因此，線粒體約占神經(jīng)元細(xì)胞體積的1/3[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元內(nèi)線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生成和功能在缺血再灌注后發(fā)生異常，維護(hù)線粒體形態(tài)和功能的穩(wěn)定可以降低神經(jīng)元的凋亡[3-5]。

正常線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)多呈管狀、網(wǎng)狀，而在營養(yǎng)缺乏、病理刺激等情況下，線粒體的形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)辄c狀、片狀，線粒體功能降低，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的功能狀態(tài)相關(guān)，檢測線粒體形態(tài)的變化可以判斷細(xì)胞的功能狀態(tài)[6-7]。cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體的生成[8]。線粒體生成、分裂、融合和線粒體自噬的動力學(xué)過程調(diào)控線粒體的形態(tài)、影響線粒體的功能并決定細(xì)胞的新陳代謝[9-10]。然而，CREB維護(hù)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation，OGD/R)誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)變化的研究尚未見報道，本研究通過構(gòu)建CREB RNA干擾重組慢病毒沉默載體，轉(zhuǎn)染原代皮層神經(jīng)元，觀察CREB基因沉默后氧糖剝奪/復(fù)氧情況下神經(jīng)元內(nèi)線粒體形態(tài)以及細(xì)胞凋亡的變化。

材 料 和 方 法

1 材料

質(zhì)粒和菌株慢病毒載體pLentiLox3.7(pLL)、包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G由北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部惠贈。大腸桿菌E.coliDH5α由本實驗室保存。

293T細(xì)胞由本實驗室凍存。皮層神經(jīng)元為原代培養(yǎng)第8天的C57BL/6小鼠皮層神經(jīng)，細(xì)胞供體為出生后24 h內(nèi)的C57BL/6乳鼠。

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、高糖和無糖DMEM培養(yǎng)基、neurobasaL培養(yǎng)基、B27、opti-MEM培養(yǎng)基和MitoTracker red等試劑購自Life Technologies；多聚賴氨酸和polybrene購自Sigma；限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、HpaⅠ以及T4 DNA 連接酶購自NEB；鼠抗CREB抗體、鼠抗Bcl-2抗體和兔抗Bax抗體購自CST；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠純化試劑盒購自全式金公司；RIPA裂解液購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1CREB基因shRNA靶序列的設(shè)計 針對NCBI上提供的鼠CREB基因序列(NM_009952.2)，設(shè)計3條特異性針對該基因的構(gòu)建發(fā)夾結(jié)構(gòu)的表達(dá)序列：shRNA1：5’-CAATGGTACCGATGGGGTA-3’；shRNA2：5’-GAAGCAGCACGAAAG-AGAG-3’；shRNA3：5’-CAGGGAAGCAGCAAGAGAA -3’。同時設(shè)計一條無關(guān)序列作為陰性對照：5’- TTCGACGTAGCATCTAGCA -3’。BLast驗證所設(shè)計序列的特異性，所有序列不對其它任何基因產(chǎn)生干擾效果。根據(jù)載體的特性及使用說明，在5’端添加HpaⅠ酶切位點(T)，中間添加形成發(fā)夾的頸環(huán)序列及與設(shè)計序列反向互補的序列，3’端添加XhoⅠ酶切位點(GAGCT)。所有的CREB-shRNA序列由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

2.2 CREB-shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建及篩選 將2.1中設(shè)計合成的CREB-shRNA序列退火，形成雙鏈DNA片段。限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切慢病毒表達(dá)載體pLentiLox3.7，形成線性化載體，與形成互補的DNA片段連接。連接條件如下：線性化載體1 μL、互補DNA片段2 μL、10×Ligase buffer 1 μL、T4 DNA連接酶1 μL，補足ddH2O至10 μL，4 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，氨芐青霉素篩選陽性克隆，提取單克隆質(zhì)粒，通過PCR及測序鑒定。

2.3 慢病毒包裝及滴度檢測 將293T細(xì)胞, 按照1.0×106/L的密度接種到60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為不含抗生素和血清的DMEM培養(yǎng)基。構(gòu)建成功的慢病毒載體CREB-shRNA與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G按照2∶1∶1的質(zhì)量比與opti-MEM混勻，并與5 μL Lipofectamine 2000共添加到更換培養(yǎng)基后的293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后36 h和60 h收集病毒上清，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，并用0.45 μm濾膜過濾，濾液再次4 ℃、22 000×g離心2 h，棄上清，用PBS將病毒顆粒倍比稀釋(1∶10、1∶100、1∶1 000)。分別用100 μL稀釋后的病毒液感染96孔板中的293T細(xì)胞(每孔1×104細(xì)胞)。通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)來測定病毒滴度，公式如下：病毒滴度(Tu/mL)=熒光細(xì)胞數(shù)×接種細(xì)胞總數(shù)/病毒稀釋液體積×稀釋倍數(shù)[11-12]。

2.4 原代神經(jīng)元培養(yǎng)及病毒感染 原代神經(jīng)元培養(yǎng)前1 d，采用0.5%多聚賴氨酸37 ℃過夜處理培養(yǎng)皿。次日取出以超純水沖洗3次，超凈臺內(nèi)晾干備用。乳鼠(出生小于24 h)乙醚麻醉，快速取腦，解剖顯微鏡仔細(xì)分出兩側(cè)皮層并剝除腦膜和血管等，用眼科剪剪切至約1 mm×1 mm×1 mm的小塊；加入0.25%的胰蛋白酶(1∶250)溶液，37 ℃水浴消化15 min，期間每隔3 min輕旋混勻；用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。加入脫氧核糖核酸酶(DNase， 1×105U/L)，反復(fù)吹打至單細(xì)胞懸液；200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后，濾液以1 000 r/min離心5 min，棄去上清；以神經(jīng)元培養(yǎng)種植液重懸細(xì)胞后計數(shù)，以1×106/L的密度接種于培養(yǎng)皿中。細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種4 h后更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)液，此后每3 d以半量換液。在病毒感染前，更換新鮮神經(jīng)元培養(yǎng)基，添加100 μL病毒液和終濃度為8 mg/L的polybrene感染增強劑，完成轉(zhuǎn)染。

2.5 OGD/R模型的建立 實驗前對厭氧罐進(jìn)行紫外照射消毒處理，并將厭氧罐置于37 ℃預(yù)熱。實驗時，OGD/R組用無氧、無糖平衡鹽溶液(D-Hanks液)沖洗2次后，加入無糖DMEM培養(yǎng)基，以95% N2和5% CO2混合氣置換厭氧罐內(nèi)氧氣，并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)2 h進(jìn)行氧糖剝奪處理。對照組更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2 h。2 h后將對照和氧糖剝奪的細(xì)胞同時取出，細(xì)胞培養(yǎng)液更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，即為復(fù)氧。

2.6 Western blot實驗 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，凍存于-80 ℃保存。12% SDS-PAGE分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，添加相應(yīng)Ⅰ抗抗體，4 ℃緩慢振蕩過夜，TBST沖洗3遍，添加辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗孵育，TBST沖洗3遍，ECL試劑顯影。Quntity One 4.62圖像分析軟件進(jìn)行條帶分析，以β-tubulin為內(nèi)參照。

2.7 線粒體形態(tài)的觀察 分組處理完畢的神經(jīng)元用預(yù)溫的無菌PBS沖洗3遍。添加含30 nmol/L的MitoTracker red的神經(jīng)元培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)25 min。預(yù)溫?zé)o菌PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗3遍，65%磷酸甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。

2.8 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 分組處理的細(xì)胞接種于蓋玻片上制作細(xì)胞爬片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組結(jié)果比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較時采用LSD-t檢驗。以P<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 pLL-CREB-shRNA的構(gòu)建

抗生素篩選轉(zhuǎn)化有pLL-CREB-shRNA重組慢病毒質(zhì)粒的陽性細(xì)菌，提取質(zhì)粒，PCR初步鑒定后，進(jìn)一步對所獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序驗證。測序結(jié)果顯示，重組pLL-CREB-shRNA質(zhì)粒內(nèi)部均含有一段與實驗設(shè)計一致的序列，表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別將重組質(zhì)粒命名為pLL-CREB-shRNA1、pLL-CREB-shRNA2和pLL-CREB-shRNA3，見圖1。

Figure 1.The partial sequences of pLL-CREB-shRNA recombinant plasmids. A: pLL-CREB-shRNA1; B: pLL-CREB-shRNA2; C: pLL-CREB-shRNA3.

圖1 pLL-CREB-shRNA重組質(zhì)粒的部分序列

2 慢病毒包裝及滴度測定

構(gòu)建成功的重組pLL-CREB-shRNA1/2/3慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，在熒光顯微鏡(×200)下可觀察到大量表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，表明重組質(zhì)粒包裝成功，分別于36 h和60 h收集病毒上清。用倍比稀釋的病毒顆粒感染96孔板中的293T細(xì)胞，觀察各孔內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞個數(shù)以測定病毒滴度，結(jié)果顯示稀釋1 000倍的pLL-CREB-shRNA1/2/3病毒顆粒均可觀察到50個左右發(fā)射熒光的細(xì)胞，說明至少有50個病毒顆粒感染的細(xì)胞, 其病毒滴度為5×109TU/L，見圖2。

Figure 2.The images of pLL-CREB-shRNA-transfected 293T cells (×200). A: pLL-CREB-shRNA1; B: pLL-CREB-shRNA2; C: pLL-CREB-shRNA3.

圖2 pLL-CREB-shRNA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞圖片

3 有效pLL-CREB-shRNA的篩選

pLL-CREB-shRNA1/2/3慢病毒顆粒感染體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元，流式細(xì)胞術(shù)檢測其感染效率分別達(dá)83.79%、82.61%和79.23%。72 h后，提取總蛋白，通過Western blot實驗檢測基因沉默效果，結(jié)果顯示pLL-CREB-shRNA1/2都具有沉默CREB基因表達(dá)的效果，其中pLL-CREB-shRNA1效果最好，沉默效果高達(dá)80%，因此隨后的實驗選擇pLL-CREB-shRNA1進(jìn)行，而pLL-CREB-shRNA3和陰性對照序列幾乎沒有干擾效果，見圖3。

Figure 3.The CREB was protein expression in cortical neurons transfected with pLL-CREB-shRNA1/2/3. A： transfection efficiency of pLL-CREB-shRNA was detected by flow cytometry; B： the CREB protein expression was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsnagative control group.

圖3 pLL-CREB-shRNA轉(zhuǎn)染對皮層神經(jīng)元CREB蛋白表達(dá)的影響

4 pLL-CREB-shRNA1感染對氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響

MitoTracker red標(biāo)記線粒體形態(tài)顯示，對照組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)線粒體為呈管狀、網(wǎng)狀的正常結(jié)構(gòu)。OGD/R處理組神經(jīng)元中管狀和網(wǎng)狀線粒體數(shù)量減少，點狀線粒體的數(shù)量增多，pLL-CREB-shRNA1感染進(jìn)一步增加點狀線粒體的數(shù)量。對各實驗組含不同形態(tài)線粒體的神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計顯示，對照組有83.67%的神經(jīng)元含有管狀和網(wǎng)狀的線粒體結(jié)構(gòu)，16.33%的神經(jīng)元含有點狀的線粒體結(jié)構(gòu)；OGD/R組含有管狀、網(wǎng)狀的線粒體結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元減少到31.33%，而含有點狀的線粒體的神經(jīng)元增加到68.67%；pLL-CREB-shRNA1感染組中，具有點狀線粒體的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加(占89.33%)，而具有管狀、網(wǎng)狀的線粒體結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(10.67%)。線粒體質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)測量結(jié)果顯示，OGD/R處理能降低神經(jīng)元的線粒體體積分?jǐn)?shù)，pLL-CREB-shRNA1感染使體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步降低。PGC-1α的表達(dá)水平檢測顯示，OGD/R處理降低神經(jīng)元內(nèi)PGC-1α的表達(dá)，而pLL-CREB-shRNA1感染進(jìn)一步加重這個過程，見圖4。

5 pLL-CREB-shRNA1感染對氧糖剝奪/復(fù)氧皮層神經(jīng)元凋亡的影響

原代皮層神經(jīng)元感染pLL-CREB-shRNA1病毒顆粒后，經(jīng)OGD/R處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，而CREB基因沉默進(jìn)一步加劇OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，見圖5。檢測抑制細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白Bcl-2和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax蛋白結(jié)果表明，OGD/R處理可以降低Bcl-2的表達(dá)而增加Bax的表達(dá)，而pLL-CREB-shRNA1感染進(jìn)一步增強了OGD/R的作用，見圖6。

Figure 4.The change of the mitochondrial morphology was observed with MitoTracker red staining in OGD/R induced cortical neurons transfected with pLL-CREB-shRNA1. A: mitochondrials were stained by MitoTracker red; B: the neuron numbers with various mitochondrial morphology; C: the quantative analysis of mitochondrial mass；D： the PGC-1α protein expression was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOGD/R group.

圖4 pLL-CREB-shRNA1轉(zhuǎn)染對OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響

Figure 5.The apoptosis of cortical neurons transfected with pLL-CREB-shRNA1. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsOGD/R group.

圖5 pLL-CREB-shRNA1轉(zhuǎn)染對OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡的影響

討 論

缺血再灌注損傷神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)和功能致使神經(jīng)元能量枯竭而凋亡、壞死， 這是缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的重要病理過程。因此，維持線粒體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定成為防治該病的一個策略[13-14]。線粒體約占神經(jīng)元體積的30%，通過氧化磷酸化過程生成的ATP維持神經(jīng)元的正常功能。線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能和細(xì)胞狀態(tài)相適應(yīng)，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的線粒體呈管狀、線性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、有規(guī)則地分布在胞質(zhì)內(nèi)，確保氧化磷酸化過程順利進(jìn)行，從而生成細(xì)胞所需的能量分子ATP；而在環(huán)境脅迫及凋亡的狀態(tài)下，線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)即改變?yōu)辄c狀，且在胞質(zhì)內(nèi)不規(guī)則分布，從而降低ATP的生成。本研究表明，氧糖剝奪/復(fù)氧處理原代皮層神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體由管狀、網(wǎng)狀的形態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)辄c狀、片狀形態(tài)，與缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的改變一致。

Figure 6.The expression of Bcl-2 and Bax in cortical neurons transfected with pLL-CREB-shRNA1. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsOGD/R group.

圖6 pLL-CREB-shRNA1對OGD/R誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

原代皮層神經(jīng)元由于其自身的生長特點、能量需求與產(chǎn)生的特殊性以及對營養(yǎng)元素的獨特要求決定其在體外培養(yǎng)的情況下對轉(zhuǎn)染的不敏感性，常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率極低且影響神經(jīng)元的活性。慢病毒載體具有可轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞、目的基因表達(dá)時間長以及無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點而使其成為轉(zhuǎn)染神經(jīng)元最有效的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)[15]。本研究構(gòu)建的CREB RNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后CREB基因表達(dá)被抑制效率可達(dá)到80%以上，充分說明慢病毒載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元方面的優(yōu)勢。

CREB作為細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在維護(hù)神經(jīng)元功能方面發(fā)揮重要的作用，如參與記憶形成與維持、神經(jīng)再生和突觸的形成等[16-17]。本研究顯示，CREB RNA干擾重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染加重氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元線粒體的形態(tài)向點狀變化，并降低線粒體的質(zhì)量體積和PGC-1α的表達(dá)，說明CREB基因表達(dá)的抑制影響氧糖剝奪/復(fù)氧情況下線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu), 且降低線粒體的生成，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。正常情況下，Bax定位于胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時Bax激活并大量表達(dá)后移位到線粒體外膜并寡聚化形成線粒體細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)通道(mitochondrial apoptosis-induced channel，MAC)，允許線粒體內(nèi)的凋亡誘導(dǎo)因子如細(xì)胞色素C、Smac等釋放到胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2可以抑制Bax激活和MAC的形成，從而抑制細(xì)胞凋亡[18-19]。本實驗研究表明，氧糖剝奪/復(fù)氧處理皮層神經(jīng)元，除誘導(dǎo)線粒體形態(tài)改變外，還促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，降低Bcl-2和Bax表達(dá)的比值，與在體復(fù)制的腦中動脈阻塞再灌注損傷研究結(jié)果一致[20]。本研究結(jié)果還揭示，CREB基因的沉默進(jìn)一步加重神經(jīng)元的凋亡，推測可能與降低Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。bcl-2基因的啟動子區(qū)含有CREB的結(jié)合位點[21-22]，慢病毒介導(dǎo)的CREB基因沉默降低OGD/R后神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步加重神經(jīng)元的凋亡?？傊?，在OGD/R所致神經(jīng)元損傷的過程中，CREB不僅維護(hù)線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還調(diào)控抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，因此，其將可能作為防治缺血再灌注神經(jīng)元損傷的分子靶標(biāo)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

Effect of CREB-shRNA on mitochondrial morphology and cell apoptosis in OGD/R-induced cortical neurons

WANG Lai1, CHU Fang-xuan1, GENG Hui-xia2, DONG Rui-rui3, ZHU Shi-gong3

(1SchoolofLifeScience，2SchoolofNursingandHealthSciences,HenanUniversity,Kaifeng475001,China;3DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,PekingUniversityHealthScienceCenter,Beijing100191,China.E-mail:genghuixia@163.com；sgzhu@bjmu.edu.cn)

AIM: To construct recombinant lentiviral vector with short hairpin RNA (shRNA) ofCREBgene, and to investigate the effect ofCREBgene silencing on mitochondrial morphology and cell apoptosis in oxygen-glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R)-induced cortical neurons. METHODS: Three lentiviral vectors pLentiLox3.7 (PLL) inserted shRNA fragments targetingCREBgene were co-transfected with the packaging plasmids psPAX2 and pMD2.G to the 293T cells, and the virus particles, which was infected with the primary cortical neurons, was encapsulated. The protein expression of CREB was detected by Western blot. The mitochondrial morphology, cell apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax were evaluated by the methods of MitoTracker red, TUNEL and Western blot in OGD/R induced cortical neurons afterCREBgene silencing. RESULTS: The pLL-CREB-shRNA1 was the most effective shRNA, which inhibited 80%CREBgene expression in the cortical neurons. The mitochondrial was appeared dot and fragment morphology in OGD/R induced cortical neurons with transfected pLL-CREB-shRNA1 plasmid. In addition, the expression of Bcl-2 was decreased, the expression of Bax, and the apoptosis of the neurons were increased by tranfected with pLL-CREB-shRNA1. CONCLUSION: CREB shRNA recombinant lentiviral vector specifically inhibits the expression ofCREBgene.CREBgene silencing promotes the cell apoptosis and mitochondrial morphological changes in the cortical neurons induced by OGD/R.

CREBgene; Recombinant lentiviral vector; Cortical neurons; Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation; Mitochondria

1000- 4718(2017)08- 1487- 07

2016- 11- 18

2017- 04- 10

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81471254； No. 81171081)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(No. 162300410102)；河南省博士后科研資助(No. 2015051)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(No. 15A180031；No. 16A330001)

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.023

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△通訊作者 耿慧霞 Tel: 0371-23880366; E-mail:genghuixia@163.com; 祝世功Tel: 010-82801477; E-mail: sgzhu@bjmu.edu.cn