人參皂苷Rh4誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡及分子機制*

王 梓， 呂曉艷， 胡俊男， 趙 巖， 蔡恩博， 劉雙利， 李 偉△， 張連學(xué)△

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院， 吉林 長春 130118； 2吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院檢驗科， 吉林 長春 130041)

人參皂苷Rh4誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡及分子機制*

王 梓1， 呂曉艷2， 胡俊男1， 趙 巖1， 蔡恩博1， 劉雙利1， 李 偉1△， 張連學(xué)1△

(1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院， 吉林 長春 130118；2吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院檢驗科， 吉林 長春 130041)

目的： 探討人參皂苷Rh4對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用及機制。方法: 采用MTT比色法測定不同濃度(10、20和40 μmol/L)人參皂苷Rh4對人肝癌HepG2細(xì)胞活力的抑制作用；用流式細(xì)胞術(shù)檢測定細(xì)胞凋亡率；通過Hoechst 33258和TUNEL染色觀察人參皂苷Rh4誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9的表達(dá)情況。結(jié)果: 人參皂苷Rh4能夠明顯促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性；TUNEL和Hoechst 33258染色實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rh4作用24 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯皺縮、腫脹、破裂等凋亡形態(tài);Western blot分析結(jié)果表明，隨著人參皂苷Rh4給藥濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)量逐漸下降，而促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和caspase-9的表達(dá)逐漸升高。結(jié)論: 人參皂苷Rh4可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)Bcl-2以及上調(diào)Bax、cleaved caspase-3 和caspase-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

人參皂苷Rh4； 肝細(xì)胞癌； HepG2 細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，易于在肝內(nèi)及向身體其它部位轉(zhuǎn)移[1]。中國有十分之一的人攜帶肝炎病毒，肝炎病毒是致癌的高危因素，而肝癌的發(fā)病率正在逐年增加[2-3]。盡管對肝癌的診斷和治療已經(jīng)取得很大進(jìn)步，但肝癌仍是癌癥相關(guān)死亡的全球第三大原因。當(dāng)前，化療雖然是腫瘤治療的主要方法，但嚴(yán)重的副作用限制了其的廣泛使用[4]。由于中藥在治療腫瘤上具有安全性和有效性[5]，因此也越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

人參作為一種傳統(tǒng)中藥，具有抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、增強免疫力等多種生物學(xué)活性[6]。人參皂苷是人參中的主要活性成分并具有多種藥理功效，尤其在預(yù)防和抑制腫瘤等方面起著重要的作用。研究結(jié)果表明人參皂苷能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡和分化, 并能提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性以及提高機體抗腫瘤的免疫力[7]。人參皂苷Rh4(ginse-noside Rh4,Rh4)作為人參三醇型皂苷的高溫?zé)崃呀猱a(chǎn)物，在免疫調(diào)節(jié)[8]、抗腫瘤[9]、抑制血小板聚集[10]等方面表現(xiàn)出多種生物活性，現(xiàn)已廣泛受到國內(nèi)外專家的關(guān)注和重視。

本文利用人參總皂苷及各單體化合物能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機制，將人參皂苷Rh4作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，并進(jìn)一步探討了其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制，為臨床肝癌的治療提供了實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞 人肝癌HepG2細(xì)胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 樣品與試劑 人參皂苷Rh4由本實驗室分離制備，經(jīng)HPLC檢測，純度>98.0%。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gbico)；小牛血清白蛋白(北京鼎國生物有限公司)；MTT(Sigma Aldrich)；二甲基亞砜(北京化學(xué)試劑廠)； TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(三箭生物工程有限公司)；Bradford蛋白定量試劑盒(碧云天公司)；ECL試劑盒(寶泰克生物有限公司)；兔抗鼠Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、β-actin抗體和羊抗兔HRP抗體購自Cell Signaling Technology；甘氨酸、Tris堿、SDS、丙烯酰氨、甲基丙烯酰氨、過硫酸氨、TEMED和脫脂奶粉購自鼎國生物有限公司；甲醇、氯仿為北京化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.3 儀器 FACSVerse流式細(xì)胞儀(BD)；組織勻漿機(麒麟貝爾公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能有限技術(shù)公司)；低溫超高速離心機(Thermo)；蛋白印跡電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；水平式離心機(上海醫(yī)療器械廠)；倒置顯微鏡(Olympus)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞在37 °C、5% CO2條件下，培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。以0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸消化，每隔3 d傳代1次。

2.2 MTT比色法檢測Rh4對HepG2細(xì)胞活力的抑制作用 取對數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，按每孔5×104個細(xì)胞接種于96孔板中，于37 °C、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后加入含人參皂苷Rh4的培養(yǎng)液使其終濃度分別為10、20和40 μmol/L，并設(shè)置對照孔，每個濃度各時點設(shè)置3重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL 二甲基亞砜，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定每孔吸光度(A)值。計算細(xì)胞抑制率(%)= (對照組A值-給藥組A值)/對照組A值×100%。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法定量檢測細(xì)胞凋亡 為檢測人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞凋亡率的影響，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用不同劑量人參皂苷Rh4(0、10、20和40 μmol/L)處理24 h后，收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

將HepG2細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸的0.25%胰酶進(jìn)行消化，并收集1×105個細(xì)胞于1.5 mL離心管中，4 ℃、2 000 r/min 離心5 min，取沉淀用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加入500 μL的binding buffer使細(xì)胞懸浮，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，4 ℃避光反應(yīng)30 min后，加入5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)5 min。上樣時，細(xì)胞懸液用300目銅網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。

2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞種6孔板中，不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)的Rh4處理24 h后消化收集細(xì)胞。PBS洗滌1次，加入l.0 mL免疫染色固定液室溫(15～25 ℃)水平搖床上緩慢搖動固定40 min。PBS洗滌后，加入l.0 mL含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2 min，PBS洗滌2次后，每個樣品上加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min，將收集到的樣品過300目銅網(wǎng)，上機檢測，488 nm激發(fā)波長，以未處理細(xì)胞設(shè)定檢測閾值。

2.5 熒光顯微鏡觀察 將對數(shù)生長期的細(xì)胞傳代于放有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h，不同濃度(0、10、20和40 μmol/L)的人參皂苷Rh4培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h。將各處理孔中的培養(yǎng)基更換為1 mL新鮮配制的染色液，置37 ℃避光孵育20 min。PBS洗2次后，取出蓋玻片置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核有明亮的藍(lán)色熒光，染色致密，無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)新月形或分節(jié)等凋亡核形態(tài)；相同區(qū)域用藍(lán)光激發(fā)，觀察并拍攝細(xì)胞紅色圖像，壞死細(xì)胞因被PI著色而呈紅色熒光，極晚期凋亡細(xì)胞也會呈紅色，而正常細(xì)胞的紅色熒光很淺。

2.6 蛋白提取及定量 收集藥物處理后的細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刀收集，收集后的混懸液置于4 ℃冰箱放置，于漩渦振蕩器上每隔30 min混勻1次，裂解2 h。然后3 000×g離心15 min，收集上清。繼續(xù)12 000×g離心15 min收集上清即為全細(xì)胞蛋白裂解液。蛋白濃度通過Bradford方法檢測，組織樣本稀釋至1 600 μL，用不同濃度 BSA(2.5、5、7.5、10 mg/L)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入顯色劑400 μL，室溫放置15 min，可見光分光光度計595 nm處讀取吸光度值，計算樣本中的蛋白濃度。

2.7 Western blot分析凋亡蛋白 配置5%的濃縮膠和15% SDS-聚丙烯酰胺凝膠后，每孔加入30 μg蛋白樣品并在Marker加樣孔中加入10 μL的預(yù)染Marker液進(jìn)行電泳。電泳完成后于4 ℃、100 V轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉振蕩，室溫封閉1 h，封閉后，加入用抗體稀釋液1∶1 000稀釋的 I 抗，搖床混勻后4 ℃過夜。次日，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的第 II 抗體進(jìn)行孵育1 h后，按ECL試劑盒說明書進(jìn)行操作顯色，凝膠成像儀上成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異比較用單因素方差分析方法進(jìn)行檢驗，結(jié)果數(shù)據(jù)圖表用GraphPad Prism 6.0制作。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用

MTT實驗結(jié)果表明，人參皂苷Rh4作用HepG2細(xì)胞12 h、24 h和48 h后，隨著藥物劑量的增加和作用時間的延長，人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞生長的抑制程度不斷增加，呈明顯的劑量和時間依賴性。人參皂苷Rh4濃度從10 μmol/L增加到40 μmol/L，24 h的生長抑制率由22.1%增加到32.3%，見圖1。

Figure 1.The effect of ginsenoside Rh4 on the viability of HepG2 cells with different times. HepG2 cells were treated with ginsenoside Rh4 for 12, 24, and 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞存活力的影響

2 人參皂苷Rh4對HepG2肝癌細(xì)胞的促凋亡作用

結(jié)果如圖2所示，不同濃度的人參皂苷Rh4作用HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度的增加而增加。10、20和40 μmol/L的人參皂苷Rh4處理24 h，細(xì)胞凋亡率分別為11.47%、15.29%和21.33%，說明Rh4所致HepG2細(xì)胞凋亡率的變化呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，高濃度的人參皂苷Rh4可以引起細(xì)胞壞死。

Figure 2.Quantification of apoptotic percentage in the HepG2 cells treated with ginsenoside Rh4 after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 不同劑量的人參皂苷Rh4所致HepG2細(xì)胞凋亡率的變化

3 Hoechst 33258染色

不同濃度的人參皂苷Rh4(10～40 μmol/L)作用HepG2細(xì)胞24 h后，利用Hoechst 33258染色在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果如圖3所示。Rh4處理24 h后，對照組細(xì)胞核彌散，呈網(wǎng)織狀，染色較淡，幾乎觀察不到致密濃染，表明細(xì)胞狀態(tài)良好，無凋亡發(fā)生；常規(guī)鏡下觀察，可以看到隨著人參皂苷Rh4給藥濃度的增加，細(xì)胞體積變小，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、碎裂和凋亡小體形成等凋亡狀態(tài)。在40 μmol/L濃度的人參皂苷Rh4作用24 h后，可以明顯觀察到HepG2細(xì)胞核皺縮明顯，呈致密濃染，表現(xiàn)出典型的細(xì)胞凋亡特點。利用光密度軟件分析，隨著人參皂苷Rh4給藥劑量的增加，細(xì)胞核發(fā)生濃縮，變小，凋亡的細(xì)胞比例逐漸增加，呈劑量依賴性。由此可見人參皂苷Rh4可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，其結(jié)果佐證了MTT實驗結(jié)果.

4 TUNEL染色

對照組HepG2細(xì)胞幾乎無可見凋亡細(xì)胞特征，細(xì)胞完整，邊緣清晰；隨著人參皂苷Rh4給藥濃度的增加，細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的皺縮，邊緣化，核膜裂解，細(xì)胞核呈現(xiàn)致密深染，表明人參皂苷Rh4可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，見圖4。

Figure 3.The morphological observation of the HepG2 cells exposed to ginsenoside Rh4 with Hoechst 33258 staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 Hoechst 33258檢測人參皂苷Rh4所致HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化

5 人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組相比，3個劑量濃度的人參皂苷Rh4均能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)(P<0.05)，其中20和40 μmol/L劑量組能有效抑制Bcl-2蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；隨著人參皂苷Rh4給藥濃度的增加，Bax/Bcl-2比值上調(diào)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性(P<0.05)，見圖5。

6 人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞caspase-3和caspase-9凋亡蛋白表達(dá)水平的影響

將0～40 μmol/L的人參皂苷Rh4作用HepG2細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測。與對照組相比，3個劑量濃度的人參皂苷Rh4均能夠增高HepG2細(xì)胞中cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)，其中20和40 μmol/L劑量組能夠有效上調(diào)caspase-9蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；隨著人參皂苷Rh4給藥濃度的增加，其對cleaved caspase-3和caspase-9的上調(diào)呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性(P<0.05)，見圖5。

Figure 4.The microscopic observation of TUNEL assay for determining the effects of ginsenoside Rh4 on apoptosis of HepG2 cells. HepG2 cells were treated with ginsenoside Rh4 for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 人參皂苷Rh4作用HepG2細(xì)胞24 h后的TUNEL染色結(jié)果

Figure 5.The protein levels of apoptosis-related proteins in the HepG2 cells treated with ginsenoside Rh4 for 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5 人參皂苷Rh4對HepG2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

近年來，在抗癌領(lǐng)域的研究中，天然產(chǎn)物取得了顯著的成就，臨床使用的抗癌藥物中60%以上來源于天然產(chǎn)物，天然產(chǎn)物已成為抗癌新藥開發(fā)的重要途徑之一[11-12]。本文以熱裂解人參皂苷Rh4為研究對象，重點闡釋其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機制，結(jié)果表明人參皂苷Rh4能夠呈劑量依賴性地顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖。利用TUNEL和Hoechst 33258染色觀察，高劑量人參皂苷Rh4處理24 h后，HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮，破裂，具有典型的凋亡等特征。由此可見，人參皂苷Rh4可明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長，其抑制作用主要通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)的。

為進(jìn)一步探討人參皂苷Rh4誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機制，本實驗還利用了Western blot技術(shù)對以上實驗結(jié)果加以佐證。細(xì)胞凋亡是受基因控制的一種程序性死亡，即細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在生理或病理狀態(tài)下自主發(fā)生的一種死亡形式[13-14]。凋亡發(fā)生時細(xì)胞首先接收和識別生理性或病理性凋亡刺激信號，然后啟動凋亡相關(guān)基因并合成一系列具有致死效應(yīng)的蛋白質(zhì)，從而引起細(xì)胞的解體和死亡[15]。腫瘤細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，Bcl-2家族成員的構(gòu)成比例是凋亡調(diào)控的關(guān)鍵因素，發(fā)揮著重要的作用，研究者認(rèn)為Bax/Bcl-2比值是啟動腫瘤細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[16-17]。本實驗結(jié)果表明：人參皂苷Rh4能夠激活Bax促凋亡蛋白的表達(dá)水平，同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，人參皂苷Rh4作用HepG2細(xì)胞24 h后，Bax/Bcl-2二者比值增加。此外，人參皂苷Rh4能夠顯著激活caspase-3和caspase-9的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，人參皂苷Rh4 能劑量依賴性地誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，且這一作用是部分通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2，并增加促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和caspase-9的表達(dá)來發(fā)揮的，其具體分子作用機制尚待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Ginsenoside Rh4 induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

WANG Zi1, Lü Xiao-yan2, HU Jun-nan1, ZHAO Yan1, CAI En-bo1, LIU Shuang-li1, LI Wei1, ZHANG Lian-xue1

(1CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2ClinicalLaboratory，TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China.E-mail:liwei7727@126.com;zlxbooksea@163.com)

AIM: To investigate the apoptosis and molecular mechanism of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells induced by ginsenoside Rh4. METHODS: Human hepatocellular carcinoma HepG2 cells were treated with ginsenoside Rh4 at doses of 10, 20 and 40 μmol/L, and the inhibitory effect of ginsenoside Rh4 on HepG2 cell viability was measured by MTT assay. The apoptotic rate of HepG2 cells was analyzed by flow cytometry. The morphological changes of the HepG2 cells were observed by Hoechst 33258 and TUNEL staining. The expression of apoptosis-related proteins Bax, Bcl-2, caspase-3 and caspase-9 was determined by Western blot. RESULTS: Ginsenoside Rh4 promoted apoptosis of HepG2 cells in a dose-dependent manner. TUNEL and Hoechst 33258 staining showed that the cells appeared obvious shrinking, swelling and rupture after treated with ginsenoside Rh4 for 24 h. The results of Western blot showed that with the increasing concentrations of ginsenoside Rh4, the expression of pro-apoptotic proteins Bax, cleaved caspase-3 and caspase-9 increased， while anti-apoptotic protein Bcl-2 decreased gradually. CONCLUSION: Ginsenoside Rh4 induces apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells， and the main mechanism may be related to down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of Bax, cleaved caspase-3, and caspase-9.

Ginsenoside Rh4; Hepatocellular carcinoma; HepG2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)08- 1399- 06

2016- 12- 05

2017- 04- 27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 31201331)；人參產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(No. 201303111)；吉林省留學(xué)回國人員科研啟動基金；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)首批青年拔尖創(chuàng)新人才支持計劃(2016)；吉林大學(xué)白求恩計劃項目(No. 2015401)

R965; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.009

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 李 偉 Tel: 0431-84533304； E-mail: liwei7727@126.com； 張連學(xué) Tel: 0431-84533304； E-mail: zlxbooksea@163.com