受體酪氨酸激酶Axl高表達促進鼻咽癌臨床進展*

賈亞楠， 李汝佳， 王可可， 雷 洪， 哈艷平， 王思思， 廖曉敏， 揭 偉， 申志華△

(廣東醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院 1病理生理教研室， 2病理學系， 廣東 湛江 524023； 3廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心， 廣東 湛江 524001)

受體酪氨酸激酶Axl高表達促進鼻咽癌臨床進展*

賈亞楠1， 李汝佳2, 3▲， 王可可2, 3， 雷 洪2,3， 哈艷平2, 3， 王思思2, 3， 廖曉敏2, 3， 揭 偉2, 3， 申志華1△

(廣東醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院1病理生理教研室，2病理學系， 廣東 湛江 524023；3廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理診斷與研究中心， 廣東 湛江 524001)

目的： 探討受體酪氨酸激酶anexelekto (Axl)在鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)中的表達及意義。方法: 采用免疫組化法檢測78例NPC和32例鼻咽黏膜慢性炎中Axl的表達，分析Axl蛋白表達與NPC患者臨床參數(shù)的相關(guān)性。常規(guī)培養(yǎng)NPC細胞，免疫熒光法檢測不同分化NPC細胞系CNE1、CNE2Z及C666-1中Axl的蛋白表達情況。應(yīng)用Axl特異性抑制劑TP-0903處理CNE1和C666-1細胞，CCK-8實驗檢測細胞的活力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期的分布，qPCR檢測Axl和增殖細胞核抗原(PCNA)的mRNA表達，Western blot檢測Axl及p-Axl蛋白的表達。結(jié)果: Axl蛋白定位于胞膜和胞質(zhì)。NPC中Axl高表達陽性率顯著高于鼻咽黏膜慢性炎(P<0.01)。Axl高表達與患者年齡、性別及M分期無關(guān)，與臨床分期、T分期和N分期呈正相關(guān)(P<0.05)。Axl在高分化CNE1細胞中低表達，在低分化CNE2Z細胞和未分化C666-1細胞中表達水平明顯增高。TP-0903呈濃度和時間依賴性抑制NPC細胞的活性，2 nmol/L TP-0903即具有顯著抑制效應(yīng)，能阻滯細胞周期于G0期，在降低Axl活性的同時也顯著抑制PCNA的表達。結(jié)論: Axl高表達可促進NPC的臨床進展；TP-0903顯著抑制NPC細胞的增殖，提示Axl可能在NPC靶向治療中具有一定的價值。

鼻咽癌； Anexelekto； TP-0903； 細胞增殖； 細胞周期

材 料 和 方 法

1 主要抗體及試劑

兔抗人Axl和p-Axl (Tyr698+Tyr702+Tyr703)的 I 抗(北京博奧森)；鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)及GAPDH的I 抗(Cell signaling)；HRP-、FITC-、PE-標記的II抗(武漢三鷹)；免疫組化PV9000試劑盒及DAB試劑盒(北京中杉金橋)；TP-0903(純度>98%；MCE)；RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)；實時熒光定量PCR試劑盒(Roche)；qPCR引物由上海生工公司合成；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自Hyclone；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、RNaseA及DAPI染液(Sigma)；蛋白酶及磷酸酶抑制劑、RIPA緩沖液、BCA及CCK-8試劑盒(碧云天)；ECL發(fā)光劑及PVDF膜(Thermo Scientific)。

2 臨床標本

78例NPC及32例鼻咽黏膜慢性炎(nasopharyngeal chronic inflammation，NPI)患者的石蠟包埋組織來自2014～2015年廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理中心保存的標本。所有NPC患者均為首次就診，未接受任何治療，組織學類型均為非角型未分化性癌，采用pTNM系統(tǒng)(AJCC/UICC 2002)進行分類。78例NPC中，男性42例，女性36例，中位年齡46歲。32例NPI為同期標本，其中男性18例，女性14例，中位年齡44歲。臨床人體標本的使用符合廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院有關(guān)倫理學規(guī)定(批件編號為PJ2014028)。

3 主要方法

3.1 免疫組織化學染色 采用免疫組化PV9000試劑盒檢測臨床人體標本中Axl蛋白的表達。4 μm厚石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)熱抗原修復(fù)后滴加0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育20 min，PBS洗3 min、3次；滴加3% BSA-PBS封閉非特異性位點，室溫孵育30 min；滴加抗Axl抗體(1∶50稀釋)，4 °C冰箱孵育過夜，PBS洗2 min、3次；滴加反應(yīng)增強液，室溫孵育20 min，PBS洗2 min、3次；滴加辣根酶標記羊抗兔/鼠IgG，室溫孵育30 min，PBS洗2 min、3次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染胞核；結(jié)果由2名獨立病理學專家判斷。顯微鏡下充分閱讀完整張切片，選擇切片上、中、下(左、右各3)共6個典型視野進行結(jié)果判斷(Axl蛋白定位于胞膜和胞質(zhì))，按陽性細胞數(shù)評分：無陽性細胞為0分，<10%為1分，≥10%但<50%為2分，≥50%為3分；按顯色程度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分?？偡謹?shù) = 染色強度評分×陽性細胞數(shù)評分，總分數(shù)≥4分定義為Axl高表達。

3.2 細胞培養(yǎng) 高分化CNE1細胞、低分化CNE2Z細胞及未分化C666-1細胞由我室保存并參照既往方法進行體外培養(yǎng)[11-14]。簡言之，NPC細胞接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，用含10% FBS、1×105U/L青霉素及0.1 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)，隔日換液，取對數(shù)生長期細胞用于相關(guān)實驗。

小偷又接連刺了她幾刀，刀刀見血。她倒下了，小偷奪門而逃。他傻了一般，站在那兒一動不動。老半天，他才好像突然清醒了。他跑過去抱起她，搖晃著她的身子喊，我不是人，為什么替我擋刀?。?/p>

3.3 免疫熒光染色 將CNE1細胞、CNE2Z細胞及C666-1細胞接種于無菌玻璃蓋片制備細胞爬片。取出細胞爬片，參考既往采用的間接免疫熒光法[15]檢測3種細胞中Axl蛋白的表達。Axl抗原定位以FITC-標記的IgG顯示，DAPI復(fù)染胞核，激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5 II；Leica)下觀察并拍照。

3.4 CCK-8檢測細胞活力 分別將Axl低表達CNE1細胞和Axl高表達的C666-1細胞接種于96孔板(每孔3 000個)，貼壁過夜后通過CCK-8實驗檢測TP-0903處理前后細胞的活力。細胞分為正常對照(control)組(正常細胞加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、TP-0903組[完全培養(yǎng)液中加TP-0903(DMSO溶解，終濃度為1、2、5 nmol/L)]和DMSO組[完全培養(yǎng)液中加DMSO(體積分數(shù)<0.3%)]。于培養(yǎng)時點0 h、24 h、48 h用酶標儀讀取450 nm處吸光度(A)值，分析細胞活力。每組做6個復(fù)孔。

3.5 qPCR檢測細胞Axl及PCNA的mRNA表達 CNE1細胞和C666-1細胞接種于6孔板，分為TP-0903(2 nmol/L)及DMSO組，48 h后收獲細胞并提取總RNA，取500 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應(yīng)引物序列如下：Axl(NM_021913.4)正義鏈為5’-GCT GCC TGT GTC CTC ATC TT-3’，反義鏈為5’-CAG CTC TTC ACT GAT GCC CA-3’；PCNA(NM_002592.2)正義鏈為5’-CTG ACA AAT GCT TGC TGA CC-3’，反義鏈為5’-CTA GCT GGT TTC GGC TTC AG-3’；β-actin正義鏈為5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，反義鏈為5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。采用LightCycler480 PCR儀(Roche)進行PCR循環(huán)，總反應(yīng)體系20 μL，包括10 μL SYBR Green I PCR Master Mix, 0.4 μL 正義鏈引物 (10 μmol/L), 0.4 μL 反義鏈引物 (10 μmol/L), 2 μL cDNA 和 7.2 μL dH2O。PCR 擴增條件為95 °C 5 min；95 °C 15 s、60 °C 60 s，50個循環(huán)。目標基因的表達量用2-ΔΔCt表示。

3.6 Western blot檢測Axl及p-Axl的水平 CNE1細胞和C666-1細胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，分組同3.4，48 h后用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的冷PBS洗滌細胞，RIPA緩沖液裂解收獲總蛋白，BCA法定量后取50 μg蛋白用于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，目標蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉后分別加入Ⅰ抗(Axl，1∶200; p-Axl，1∶200；GAPDH，1∶500)4 °C過夜孵育，TBST洗滌，羊抗兔HRP-標記的IgG II抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光后獲得目的蛋白的條帶，膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。以GAPDH為內(nèi)參照，分析Axl及p-Axl的水平變化，以p-Axl/Axl代表Axl蛋白活性。實驗重復(fù)3次。

3.7 細胞周期分析 CNE1細胞和C666-1細胞接種于6孔板，分組同3.4，48 h后上述各組細胞經(jīng)0.25%胰酶消化、PBS洗滌、75%冷乙醇過夜固定，離心棄去固定液，PBS 洗滌1 次后收集細胞于流式管，每管細胞樣品中加入1 mL PI染色液(含有100 mg/L RNase A 和5 mg/L PI)，緩慢并充分重懸細胞，避光室溫孵育30 min，隨后用流式細胞儀(BD FACS Canto II)在488 nm激發(fā)波長下檢測紅色熒光和光散射情況，并用Flowjo 軟件分析細胞周期分布。每組設(shè)3個復(fù)孔。

4 統(tǒng)計學處理

臨床計數(shù)資料采用χ2檢驗，體外實驗計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 6軟件行單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 NPC臨床標本中Axl蛋白的免疫組化檢測結(jié)果

典型的Axl高表達為腫瘤細胞胞質(zhì)及胞膜呈現(xiàn)棕黃色陽性信號。78例NPC中Axl高表達46例(59.0%)，顯著高于NPI組(12.5%)(P<0.01)。進一步分層研究顯示，NPC中Axl高表達與患者年齡及性別無關(guān)，但與臨床分期、T分期和N分期均呈正相關(guān)(P<0.05)。本組NPC樣本M1期中Axl高表達為12例(70.6%)，但與M0期(55.7%)相比較，差異無統(tǒng)計學意義，見圖1、表1。

Figure 1.The expression of Axl protein in clinical samples. The method of mmunohistochemistry was used to detect Axl protein expression in the patients with NPC and NPI, Axl protein antigens were colorized by DAB(×200). A: the Axl protein in the NPI was negative expression; B: low level of Axl protein in NPC； C: high level of Axl protein in NPC； D: blank control.

圖1 免疫組化檢測臨床標本中Axl蛋白的表達

表1 臨床標本中Axl蛋白的表達及與患者臨床參數(shù)的相關(guān)性

NPC: nasopharyngeal carcinoma; NPI: nasopharyngeal chronic inflammation.

2 Axl表達與NPC細胞分化呈負相關(guān)

采用免疫熒光法檢測不同分化狀態(tài)NPC細胞中Axl的蛋白表達。結(jié)果顯示，高分化CNE1細胞中Axl呈低水平表達，低分化CNE2Z細胞及未分化C666-1細胞中Axl表達水平較高，以C666-1細胞染色強度最強(圖2)。后續(xù)實驗選擇CNE1和C666-1為TP-0903干預(yù)對象。

3 TP-0903抑制NPC細胞的增殖活性

CCK-8實驗結(jié)果顯示，TP-0903呈濃度和時間依賴性抑制NPC細胞的活力，2 nmol/L TP-0903即具有顯著的細胞活力抑制作用(P<0.01)。qPCR結(jié)果顯示，2 nmol/L TP-0903能顯著抑制CNE1細胞和C666-1細胞中Axl和PCNA的mRNA水平(P<0.05)。進一步的Western blot結(jié)果顯示，TP0903顯著降低了NPC細胞中Axl蛋白的活性，即p-Axl/Axl比值顯著降低，見圖3。

4 TP-0903對NPC細胞形態(tài)的影響

DMSO處理NPC細胞48 h，其形態(tài)學未見明顯異常改變。CNE1細胞以多角形為主，C666-1細胞以多角形及短梭形為主。而TP-0903處理48 h后，CNE1和C666-1細胞密度均明顯下降。CNE1和C666-1細胞中大部分殘存細胞形態(tài)變?yōu)樗笮?，偽足增多，類似上皮間葉樣轉(zhuǎn)化形態(tài)，部分細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，見圖4。

Figure 2.The method of immunofluorescent staining was used to observe Axl protein expression in well differentiated CNE1, poorly-differentiated CNE2Z and undifferentiated C666-1 cells. Axl protein antigens were colorized by FITC-coupled IgGs, and nuclei were stained by DAPI.

圖2 免疫熒光法檢測不同分化狀態(tài)NPC細胞中Axl蛋白的表達

5 TP-0903阻滯NPC細胞周期進展

用Flowjo 軟件分析細胞周期變化，與DMSO組相比，無論是CNE1細胞還是C666-1細胞均表現(xiàn)為G1期比例升高，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05)，G2/M期與S 期細胞比例都明顯下降，差異具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05 )，見圖5。

Figure 3.TP-0903 suppressed Axl activity and inhibited the proliferation of NPC cells. A: well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were treated with TP-0903 (1, 2, 5 nmol/L) and DMSO for 0 h, 24 h and 48 h, and then CCK-8 assay was performed; B: PCR methods was used to examine the mRNA expression of Axl and PCNA in the CNE1 cells and C666-1 cells that treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO； C: Western blot was used to examine the total Axl and p-Axl expression in the CNE1 cells and C666-1 cells that treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vsDMSO group.

圖3 TP-0903抑制NPC細胞中的Axl活性及細胞增殖

Figure 4.The representative morphological images of the NPC cells exposed to TP-0903. Well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were planted onto 6-well plates at 5×104per well. After 1 night recovery, the media was changed into completed medium with TP-0903 (2 nmol/L) or DMSO (0.2%) for 48 h, then the cells were photographed under light field.

圖4 TP-0903處理NPC細胞后的形態(tài)變化

討 論

Axl為受體酪氨酸激酶TAM亞家族一員，已有的研究提示Axl高表達與多種人類腫瘤的臨床進展正相關(guān)，這在食管鱗癌[5]、結(jié)腸癌[16]、肺癌[6]、惡性胸膜間皮瘤[17]、腎癌[18]，乳腺癌[4]及骨肉瘤[2]等惡性腫瘤中均得到證實。Axl可能是腫瘤治療的一個潛在有價值的靶點，為此，針對Axl激酶抑制劑及單克隆抗體的研究正受到研究人員的重視[19-21]。

NPC是一種具有地域分布特征的鼻咽黏膜上皮源性惡性腫瘤，在我國廣東省多發(fā)，其病因及發(fā)病機制復(fù)雜[22]。為分析Axl在NPC中的表達情況，本研究首先對78例臨床NPC及32例NPI對照組織樣本中進行Axl蛋白的免疫組化檢測，結(jié)果顯示，NPC中Axl高表達陽性率為59.0%，顯著高于對照組的12.5%。進一步分層研究顯示，NPC中Axl高表達與患者年齡及性別無明顯相關(guān)，但與臨床分期、T分期和N分期均呈正相關(guān)關(guān)系。盡管本組NPC樣本M1分期中Axl高表達陽性率為70.6%，但與M0組相比較，差異卻無顯著性意義，這可能與NPC總體樣本數(shù)不大有關(guān)。總體上，本組NPC中Axl高表達與腫瘤的臨床進展存在正相關(guān)性。陳廣理等[9]通過RT-PCR技術(shù)檢測了一組小樣本NPC及對照組織中Axl mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)NPC中Axl mRNA豐度大于對照組，提示Axl表達升高與NPC具有關(guān)聯(lián)性。Jiang等[10]亦檢測了一組NPC及對照組織中Axl mRNA及蛋白表達，發(fā)現(xiàn)Axl高表達與NPC臨床進展及轉(zhuǎn)移等生物學行為有關(guān)。本研究結(jié)論與上述兩組的報道相似，預(yù)示了靶向干預(yù)Axl在NPC治療中可能具有一定的價值。

Figure 5.The cell cycle distribution of the NPC cells after TP-0903 treatment. Well differentiated CNE1 cells and undifferentiated C666-1 cells were treated with TP-0903 (2 nmol/L) and DMSO (0.2%) for 48 h, and then the cells were harvested and subjected to cell cycle analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO.

圖5 TP-0903處理NPC細胞后細胞周期的變化

為探討靶向干預(yù)Axl對NPC細胞的影響，本研究進一步體外對不同分化狀態(tài)NPC細胞系進行Axl蛋白表達的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Axl蛋白表達與NPC分化狀態(tài)呈負相關(guān)，即高分化CNE1細胞中低水平表達，而低分化CNE2Z細胞及未分化C666-1細胞中表達明顯升高。隨后，采用Axl特異性抑制劑TP-0903分別處理CNE1細胞和C666-1細胞，CCK-8實驗結(jié)果證實TP-0903以濃度和時間依賴方式顯著抑制NPC細胞的活力，提示基于TP-0903靶向抑制Axl對NPC增殖具有明顯的效果。當前，針對Axl小分子抑制劑的研究正受到重視[7,19, 21]，一些抑制劑如4SC-203、S49072已進入I期臨床實驗，而一些抑制劑如R428、MGCD-265、gilteritinib等進入II期臨床實驗。TP-0903是一種新的嘧啶衍生物，目前僅在白血病治療中有1例臨床前研究的報道[8]，但其效果值得肯定。本研究首次將TP-0903應(yīng)用在NPC上。本研究發(fā)現(xiàn)，2 nmol/L TP-0903處理NPC細胞48 h，殘留的細胞即出現(xiàn)上皮間葉轉(zhuǎn)化樣形態(tài)改變，部分細胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡甚至出現(xiàn)細胞溶解，當濃度大于10 nmol/L時NPC細胞全部溶解而死亡，初步顯示NPC中的IC50將顯著小于其推薦值(27 nmol/L)。至于TP-0903處理誘導NPC細胞出現(xiàn)上皮間葉樣轉(zhuǎn)化的機制及意義如何，有待于后續(xù)研究。我們注意到在2 nmol/L時，TP-0903不僅影響NPC中Axl mRNA豐度，也影響其蛋白的表達和活性，同時也顯著降低了PCNA的表達，這與CCK-8的結(jié)果是一致的。進一步的細胞周期分布提示經(jīng)TP-0903處理后，表現(xiàn)為G2/M和S期比例下降，G1期比例升高，細胞生長受抑制。本研究發(fā)現(xiàn)TP-0903不僅影響Axl的表達，也可抑制其蛋白活性(p-Axl的表達)，這一點與既往的報道不一致[23]，其確切機制有待于進一步探討。

關(guān)于Axl在腫瘤組織中激活的機制非常復(fù)雜，吳彥君等[24]總結(jié)為5種機制，其中通過配體結(jié)合如GAS6介導受體同源二聚化是其經(jīng)典活化機制。Axl 受體二聚體進行自磷酸化，使其受體細胞內(nèi)激酶域酪氨酸殘基Y779、Y821 和Y866 磷酸化，繼而激活下游信號。NPC細胞中Axl如何激活尚不清楚。本研究納入3個NPC細胞系，C666-1細胞中Axl表達最高，考慮到C666-1細胞中EB病毒感染呈陽性，后續(xù)將可能探討EB病毒的感染與Axl的激活存在關(guān)聯(lián)性。

總之，本研究結(jié)果提示Axl高表達促進NPC的臨床進展；TP-0903抑制Axl并明顯拮抗NPC細胞增殖，提示基于Axl靶點治療NPC具有潛在的臨床價值。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

High expression of Axl promotes clinical progression of nasopharyngeal carcinoma

JIA Ya-nan1, LI Ru-jia2, 3, WANG Ke-ke2, 3, LEI Hong2, 3, HA Yan-ping2, 3,Wang Si-si2, 3, LIAO Xiao-min2, 3, JIE Wei2, 3， SHEN Zhi-hua1

(1DepartmentofPathophysiology，2DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,GuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524023,China;3PathologicalDiagnosisandResearchCentre,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China.E-mail:szh75@126.com)

AIM: To explore the expression and significance of receptor tyrosine kinase anexelekto (Axl) in nasopharyngeal carcinoma (NPC). METHODS: Immunohistochemistry was used to detect the Axl protein expression of 78 patients with NPC and 32 patients with nasopharyngeal chronic inflammation (NPI). The correlations between the Axl protein levels and the clinical parameters of NPC patients were analyzed. NPC cells were culturedinvitro, and the expression of Axl in well differentiated CNE1 cells, poorly-differentiated CNE2Z cells and undifferentiated C666-1 cells was detected by immunofluorescence staining. After treatment of the CNE1and C666-1 cells with Axl specific inhibitor TP-0903, CCK-8 assay was used to detect cell viability, flow cytometry was adopted to analyze the cell cycle distribution, qPCR was used to examine the mRNA levels of Axl and proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and Western blot was used to examine the protein expression of Axl and p-Axl. RESULTS: Axl protein was localized in the cell membrane and cytoplasm. The rate of high expression of Axl in NPC was significantly higher than that in NPI (P<0.01). High Axl expression showed no correlations with NPC patients’ age, gender and M stage, while positively correlated with the clinical stage, T stage and N stage (P<0.05). Axl protein showed a low level in the CNE1 cells, but showed a high level in CNE2Z and C666-1 cells. TP-0903 inhibited cell viability in concentration and time dependent manners. TP-0903 at 2 nmol/L showed significant inhibitory effects, as evidenced by arresting the cell cycle at G0phase and reducing Axl activity and PCNA expression. CONCLUSION: High expression of Axl promotes the clinical progress of NPC.TP-0903 significantly inhibits the viability of NPC cells, suggesting that Axl may be a valuable target in the NPC treatment.

Nasopharyngeal carcinoma; Anexelekto; TP-0903; Cell proliferation; Cell cycle

1000- 4718(2017)08- 1386- 07

2016- 12- 01

2017- 04- 19

國家自然科學基金資助項目(No. 81402415)；廣東醫(yī)科大學科研基金(No. Z2013004； No. M2013032)；湛江市科技計劃項目(No. 2013B01077)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.08.007

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