西洋參對大鼠腦缺血后的心肌Cx43表達(dá)的影響

謝海龍，劉源,于丹,王雪婷,呂晨,王冬雪,韓雪燕,張淑香*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

西洋參對大鼠腦缺血后的心肌Cx43表達(dá)的影響

謝海龍1,2，劉源2,于丹2,王雪婷2,呂晨2,王冬雪1,韓雪燕3,張淑香2*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察西洋參水煎液預(yù)處理對大鼠腦缺血后心律失常的發(fā)生和心臟Cx43表達(dá)的影響。方法：采用線栓法栓塞大腦中動(dòng)脈建立大鼠腦缺血模型，術(shù)前給西洋參水煎液預(yù)處理，監(jiān)測術(shù)后2 h心電圖，采用免疫印跡法和組織免疫熒光法檢測心室肌Cx43蛋白表達(dá)和分布改變。結(jié)果：與模型對照組比較，西洋參水煎液預(yù)處理組心律失常的出現(xiàn)時(shí)間延長,且持續(xù)時(shí)長明顯降低，電鏡超微結(jié)構(gòu)可見心肌潤盤和縫隙連接損傷減輕，能明顯上調(diào)心室肌Cx43蛋白表達(dá)。結(jié)論：西洋參水煎液預(yù)處理對大鼠腦缺血后心臟損傷具有明顯保護(hù)作用。

間隙連接蛋白43；腦缺血；心律失常；西洋參

腦血管病是威脅中老年人健康的常見病，多發(fā)病。腦血管病后可引起一系列心電圖改變，心肌酶譜異常甚至發(fā)生心肌梗死，稱為腦心綜合癥，尤其急性腦血管病發(fā)病時(shí)心電圖變化可高達(dá)65%～75%,其中經(jīng)動(dòng)態(tài)心電圖檢測的心電圖變化陽性率更高，嚴(yán)重影響患者預(yù)后，增加死亡率[1-2]，因此有效的預(yù)防腦血管病后心肌損害具有重要意義。Cx43是心室最主要表達(dá)的縫隙連接蛋白，Cx43含量和分布的異常與心律失常有密切關(guān)系。因中藥成分的多樣性往往具有心腦兼治，且副作用小可長期用藥的的優(yōu)勢，中藥在改善、治療心腦血管疾病方面一直都有較好的效果。多項(xiàng)報(bào)道表明西洋參能有效預(yù)防心腦血管事件的發(fā)生，西洋參水煎液實(shí)驗(yàn)性預(yù)處理對心腦綜合癥后的心律失常的影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討西洋參水煎液對模型大鼠腦缺血后心律失常的影響以及是否和間隙連接蛋白Cx43有關(guān)聯(lián)，為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量為250～300 g的Wistar健康雄性大鼠，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，合格證號：20167165。

1.1.2 試劑及主要藥材

10%水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)；氯化三苯基四氮(Sigma公司)；Mouse-anti-Cx43單抗(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；紅外熒光標(biāo)記的二抗(Jackson公司)；BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit,北京博凌科為公司)；抗原修復(fù)液：0.04% citric acid和0.3% trisodium citrate溶于PBS中，室溫保存(哈爾濱市化工試劑廠)；穿透液：0.4% TritonX-100和1% BSA溶于PBS中 (上海華舜生物工程有限公司)；封閉液:2% goat serum(中杉公司)；西洋參(哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)/生物信號采集與分析系統(tǒng)/多道生理記錄儀(成都泰盟軟件有限公司,BL-420S)；低溫高速離心機(jī)(Bekman公司)；超速離心機(jī)(Hitachi公司,CS120GXL型)；蛋白電泳系統(tǒng)Mini-PROTEAN Tetra(美國BIO-RAD公司)；濕轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(德國耶拿分析儀器股份公司生命科學(xué)Tankblot Eco-Maxi型)；冰凍切片機(jī)(德國,Leica CM1850 UV型)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica TCS SPE)；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LICOR公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心電圖檢測

將心電圖正常的Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組(normal)、腦缺血對照組(ischemia)、西洋參水煎液組(American ginseng)。西洋參水煎液組預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)灌胃7天，分兩個(gè)劑量組3 g/(kg·d)和6 g/(kg·d),電鏡結(jié)果3 g/(kg·d)無心臟保護(hù)作用，故選6 g/(kg·d)給藥，灌胃7天，并且術(shù)前0.5 h灌胃。腦缺血對照組和西洋參水煎液組選取腦組織TTC染色有明顯梗死者。

1.2.2 大鼠模型的制備

采用線栓法復(fù)制大鼠右腦中動(dòng)脈缺血模型，具體操作參見潘國聘[3]實(shí)驗(yàn)，包括麻醉、固定、檢測心電圖、分離動(dòng)脈、結(jié)扎、栓線等操作過程，同時(shí)用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)檢測模型鼠心律失常的出現(xiàn)時(shí)間及其持續(xù)時(shí)間。

1.2.3 電鏡觀察組織病理變化

冰上操作，迅速取出約1 mm3的左心室組織， 4%戊二醛溶液固定心肌組織，放入4℃冰箱保存，在電鏡下觀察心肌組織病理及超微結(jié)構(gòu)改變。

1.2.4 組織切片確定造模情況

將對照組(腦TTC染色)、模型組和西洋參水煎液組大鼠斷頭取腦，-80℃保存，冰凍切片，切片厚度約2 mm，配置2% TTC溶液，將切好的腦片放入2% TTC溶液，37℃孵育15 min，觀察梗死面積，確定是否造模成功。

1.2.5 蛋白的提取及Western blot定量檢測

將置于-80℃冰箱冷凍保存的大鼠左室肌組織取出，與1 mL bufferA溶液混合后用勻漿器進(jìn)行組織勻漿，勻漿液用低溫高速離心機(jī)4℃ 3 000×g離心15 min，取上清，4℃ 35 000×g超速離心30 min，棄去上清液， RIPA溶液溶解蛋白。用BCA法對重懸的蛋白溶液進(jìn)行定量。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膜蛋白，電泳膠板上樣每孔200 μg；轉(zhuǎn)膜：電泳完畢后轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)；封閉：將PVDF膜在含5%脫脂奶粉的封閉液中37℃封閉1 h；一抗孵育：棄去封閉液，用Mouse-anti-Cx43單克隆抗體(1∶200)孵育2 h，用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次，每次15 min；二抗孵育：棄去一抗，用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次，每次15 min。再用PBS洗膜一次。將紅外熒光標(biāo)記二抗(Alexa Fluor 700) 用孵育液1∶4000稀釋后避光孵育1 h，棄去二抗，用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次，每次5 min，再用PBS洗膜3次，每次5 min。應(yīng)用Odyssey掃描成像系統(tǒng)觀察目的蛋白條帶的改變。

1.2.6 免疫組織化學(xué)

取大鼠心臟，4%多聚甲醛溶液固定心臟，固定時(shí)間為16 h；脫水：取出大鼠心臟置于15%的蔗糖溶液中脫水，心臟沉至容器底部后， 取出置于30%蔗糖溶液中繼續(xù)脫水至心臟再次沉底；冰凍切片，將腦片放入抗原修復(fù)液中，加熱，當(dāng)溫度達(dá)到95℃時(shí)，修復(fù)約15 min。100 μL穿透液穿透組織，反應(yīng)時(shí)間為1 h，PBS輕輕洗滌3次，每次5 min。加100 μL封閉液，濕盒反應(yīng)5 h，PBS輕輕洗滌3次，每次5 min。加入100 μL 1∶50稀釋的一抗(鼠抗總Cx 43)，37℃濕盒反應(yīng)16 h，PBS輕輕洗滌3次，每次5 min。1∶200稀釋二抗(羊抗鼠594)，最高轉(zhuǎn)速瞬時(shí)離心，加入二抗100 μL，37℃濕盒反應(yīng)2 h。封片，顯微鏡下觀察下觀察目的蛋白的變化。

1.2.7 心電圖

監(jiān)測模型鼠及給藥組大鼠的心電圖，計(jì)算心律失常起始時(shí)間、心律失常持續(xù)時(shí)間。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Odyssey軟件分析蛋白條帶，組間用配對t檢驗(yàn)，雙尾概率以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果

2.1 心電圖分析

將經(jīng)過西洋參水煎液處理過的大鼠與普通對照組的大鼠進(jìn)行對比，分析心電圖數(shù)據(jù)可以看出，腦缺血組大鼠心律失常的出現(xiàn)時(shí)間為(19.78±3.74)min, 心律失常持續(xù)時(shí)間為(46.80±4.62)min；西洋參水煎液組心律失常出現(xiàn)時(shí)間與腦缺血組相比顯著延遲，平均出現(xiàn)時(shí)間為(102.34±13.98)min, 心律失常持續(xù)時(shí)間與腦缺血組相比明顯縮短，平均持續(xù)時(shí)間約為(6.62±1.61)min。心律失常發(fā)生率腦缺血組71%，西洋參水煎液組50%。見圖1。

圖1 西洋參對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后心律失常的影響注:與腦缺血組比較,*P<0.05

2.2 心肌細(xì)胞縫隙連接電鏡下觀察結(jié)果

由圖2可觀察到, 正常組大鼠心肌細(xì)胞之間連接較致密，肌絲排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)正常。腦缺血后心肌肌絲排列紊亂，縫隙連接異常斷裂(圖2B箭頭所示)。西洋參水煎液組心肌縫隙連接結(jié)構(gòu)比缺血組改善，結(jié)構(gòu)清晰(圖2C箭頭所示)。

圖2 西洋參對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后心肌組織縫隙鏈接的影響注：A：假手術(shù)組(×15 000);B：腦缺血2 h(×12 000);C:西洋參(×15 000)

2.3 心肌組織中Cx43表達(dá)的變化

腦缺血后心肌Cx43表達(dá)減少，西洋參水煎液組有顯著提高。見圖3。

圖3 西洋參對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后心肌組織縫隙鏈接蛋白-43的影響注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05,與腦缺血組比較,#P<0.05

圖3A表示的是western blot 代表圖，圖3B是統(tǒng)計(jì)圖(n=4)。

2.4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

腦缺血后2 h模型組心肌中Cx43的表達(dá)比對照組顯著降低，西洋參水煎液組比對照組表達(dá)明顯提高。見圖4。

圖4 西洋參對大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞后心肌組織縫隙鏈接蛋白-43免疫熒光染色的影響注：A：假手術(shù)組(×200);B：腦缺血組2 h(×200);C：西洋參組(×200)

3 討論

心電圖分析顯示腦缺血后71%出現(xiàn)心律失常，給西洋參水煎液后心律失常發(fā)生率減少，心律失常出現(xiàn)時(shí)間明顯延長，持續(xù)時(shí)間明顯縮短。為探索心律失常的減少是否與Cx43有關(guān)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證西洋參水煎液能否改善腦缺血后心肌Cx43的表達(dá)。免疫印跡顯示西洋參水煎液預(yù)處理后心肌Cx43的表達(dá)量增加，同時(shí)免疫熒光也顯示閏盤處Cx43表達(dá)得到了恢復(fù)。

腦血管病引起心律失常發(fā)生率較高，藥物治療效果不確切，尤其是此類疾病死亡率高。據(jù)報(bào)道心律失常是腦梗死急性期導(dǎo)致患者死亡的重要因素，同時(shí)還是腦血管病階段預(yù)后不良的重要警示[4-5]，可見尋找有效的治療藥物進(jìn)行針對性早期干預(yù)是降低致死率，改善中遠(yuǎn)期預(yù)后的首要工作。

腦血管病患者伴隨心電圖異常變化的發(fā)病機(jī)制并不很清楚，與腎上腺素分泌增加和島葉損傷有關(guān)。腦血管病時(shí)交感神經(jīng)亢進(jìn)和兒茶酚胺分泌的增多[6]，高濃度的兒茶酚胺可引起早期、晚期后除極，降低室顫閉，升高自律性，觸發(fā)室性心律失常[7-8]，大腦中動(dòng)脈栓塞可累及島葉，島葉是調(diào)節(jié)心血管功能的重要區(qū)域，刺激該區(qū)可致心律失常[9]。

文獻(xiàn)報(bào)道采用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型及乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型模擬在體損傷，結(jié)果顯示：西洋參總皂苷能夠有效減輕心肌缺血再灌注造成的損傷，其機(jī)理是藥物可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激[10]。西洋參總皂苷抗心律失常主要機(jī)制是阻滯鈣離子通道的作用。同時(shí)，總皂苷能夠縮短大鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程、減小動(dòng)作電位最大除極速度，延長心肌細(xì)胞有效不應(yīng)期，總皂苷還具有降低心肌收縮能力[11]。綜上推測西洋參水煎液可能對腦缺血后心律失常有預(yù)防作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示西洋參水煎液能減少心律失常發(fā)生率。

近年來縫隙連接在心律失常中的作用備受關(guān)注，心肌細(xì)胞的閏盤結(jié)構(gòu)含有緊密連接、橋粒連接以及縫隙連接，其中縫隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞與細(xì)胞之間電信號及化學(xué)信號傳遞，對于維持心肌細(xì)胞的正常節(jié)律起到關(guān)鍵的作用[12]，Cx43是心室主要表達(dá)的縫隙連接蛋白，Cx43表達(dá)水平的降低和分布異常，能夠?qū)е滦募≌w傳導(dǎo)的速度減慢,傳導(dǎo)的各向異性改變，從而誘發(fā)心律失常。實(shí)驗(yàn)研究顯示，在Cx43基因缺陷小鼠其室內(nèi)傳導(dǎo)速度比正常小鼠減低，更易發(fā)生致死性心律失常[13]。本研究表明西洋參水煎液能改善心肌Cx43的表達(dá)，與心律失常的好轉(zhuǎn)相一致，也再次說明心律失常與Cx43有密切聯(lián)系,西洋參水煎液調(diào)節(jié)Cx43的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of American Ginseng on Expression of Cx43 in Cerebral Ischemia Rats

XIE Hai-long1,2, LIU Yuan2, YU Dan2, WANG Xue-ting2, LV Chen2,WANG Dong-xue1, HAN Xue-yan3, ZHANG Shu-xiang2

(1.HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China; 2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To examine the effects of American ginseng on the expression of myocardium connexin43 (Cx43) and its influence for arrhythmia in cerebral ischemia rats. Methods: The cerebral ischemia models were established by occluding right middle cerebral artery. American ginseng decoction was given as preconditioning to rats before modeling. ECG was monitored after two hours of modeling, and the expression and distribution of Cx43 were detected with Western blot method and immunohistochemistry technique. Results: Preconditioning of American ginseng enhanced the expression of Cx43 in the ventricle after cerebral ischemia. The injury of bridge corpuscle in intercalated disc and gap junction in myocardial tissue were reduced under the electron microscope, and the start time of arrhythmias was delayed and the duration was much shorter in American ginseng group compared to those in the model group. Conclusion: Preconditioning of American ginseng have protective effect for myocardium after acute cerebral ischemia.

Cx43; Cerebral ischemia; Arrhythmia; American ginseng

2016-10-21

2016-11-28

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室《北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室》開放課題

謝海龍(1980-)，男，博士研究生,副研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

*通訊作者：張淑香(1973-)，女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理與毒理學(xué)研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0029-04