• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR?608在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

    2017-09-03 10:01:56陳井陽(yáng)鐘鳴沈文靜劉潔
    關(guān)鍵詞:成釉細(xì)胞定量引物

    陳井陽(yáng),鐘鳴,沈文靜,劉潔

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110122;2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;3.附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽(yáng) 110001;4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110122)

    miR?608在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

    陳井陽(yáng)1,鐘鳴2,沈文靜3,劉潔4

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110122;2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;3.附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽(yáng) 110001;4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110122)

    目的研究miR-608在成釉細(xì)胞瘤(AB)中的表達(dá)及意義。方法利用實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR方法檢測(cè)miR-608在26例人成釉細(xì)胞瘤(AB組)及17例瘤旁組織(對(duì)照組)中的表達(dá)水平,比較miR-608在AB組與對(duì)照組,原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組,以及AB不同臨床病理特征的組間差異。結(jié)果AB中miR-608表達(dá)水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);復(fù)發(fā)組miR-608的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-608表達(dá)水平在不同年齡、性別和病理分型患者中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論人AB組織中miR-608表達(dá)水平顯著下降,可能與該腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)相關(guān)。

    成釉細(xì)胞瘤;微小核糖核酸608;實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR;腫瘤復(fù)發(fā)

    成釉細(xì)胞瘤(ameloblastom,AB)為口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤,是一種具有局部侵襲和易復(fù)發(fā)特征的臨界瘤[1]。由于其病因尚不明確,缺乏有效的治療措施,目前多采用手術(shù)切除,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,給患者身心帶來(lái)極大傷害。因此,闡明該腫瘤發(fā)生演進(jìn)的關(guān)鍵機(jī)制,尋找新的預(yù)防措施和治療途徑具有重要意義。

    微小RNA(microRNA,miRNA)是一類大小約22個(gè)核苷酸進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,隨著對(duì)其研究的深入,它和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,及在腫瘤診斷和治療方面潛在的應(yīng)用價(jià)值引起了廣泛的關(guān)注[2]。微小RNA 608(microRNA 608,miR-608)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用的miRNA。經(jīng)TargetScan生物信息軟件預(yù)測(cè)其下游靶基因有表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、人β-連環(huán)素蛋白互作蛋白1(catenin beta interacting protein 1,CTNNBIP1)、多種整合素分子等。研究[3-6]表明,miR-608可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)遷移能力,過(guò)表達(dá)miR-608可抑制肝癌細(xì)胞的增殖,miR-608可通過(guò)影響含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶凋亡通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞調(diào)亡,并抑制細(xì)胞增殖,miR-608還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力,但其在AB中的作用及機(jī)制尚未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)莖環(huán)法定量PCR檢測(cè)AB及癌旁對(duì)照組織中miR-608的表達(dá),并探討其意義。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源

    收集2014年1月至2016年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除的26例AB標(biāo)本,作為AB組,按照復(fù)發(fā)情況又將其分為原發(fā)組(18例),復(fù)發(fā)組(8例)。AB組中男12例,女14例,年齡19~73歲,平均年齡43.44歲。按照病理分型分為實(shí)性/多囊型20例,其他型6例(包括外周型AB1例,單囊型5例)。17例瘤旁黏膜標(biāo)本為對(duì)照組,其中男性8例,女性9例,年齡19~73歲,平均年齡46.17歲?;颊咝g(shù)前未接受放化療等輔助治療,術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)診斷。標(biāo)本采集均已告知患者及家屬,并簽署知情同意書,且經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。標(biāo)本在液氮下速凍,然后置于-80℃冰箱保存。

    1.2 主要試劑

    Trizol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)購(gòu)自美國(guó)Amersco公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNA-ase)購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司;定量PCR擴(kuò)增試劑盒Real Star Green Fast Mixture購(gòu)自中國(guó)康潤(rùn)生物有限公司;miR-608莖環(huán)及定量PCR引物、U6內(nèi)參引物均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

    1.3 莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR

    1.3.1 引物序列:利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和qPCR上下游引物,miR-608莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGACGGAGC-3’;上游引物為5’-GGTGGTGTTGGGATAGCTTCGT-3’,下游引物為5’-GGCTGTCGTGGACTGCG-3’;U6莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’;上游引物為5’-TCGCTTCGGCAGCACATA-3’,下游引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’。目的片段長(zhǎng)度約60 bp,退火溫度60°C。

    1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:組織勻漿后按照Trizol說(shuō)明書操作,提取總RNA,分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度,-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前將提取好的RNA從-80℃冰箱中取出,放在冰上溶解,待用。配置100 μmol/L各莖環(huán)原液,分別吸取1 μL至RNase-free水,使終體積為100 μL,則每個(gè)莖環(huán)的終濃度為1 μmol/L,混合莖環(huán)。首先在去除基因組DNA反應(yīng)體系中加入Total RNA 1~2 μg、5×gDNA Buffer 2 μL、RNasefree水補(bǔ)充體積到10 μL,徹底混勻,簡(jiǎn)短離心,并置于42℃孵育3 min,迅速放在冰上放置。加入10× Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、莖環(huán)混合RT引物2 μL、RNase-free水補(bǔ)充總體積到10 μL配制成反轉(zhuǎn)錄體系混合物。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的混合物,加入基因組DNA去除步驟的反應(yīng)液中,充分混勻。PCR反應(yīng)條件為42°C 15 min,95°C 3 min,-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:使用2×Real Star Green Mixture配制反應(yīng)混合物,將上述逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 1 μL、Real Star Green Mixture(2×)10 μL、Primers 0.6 μL用PCR-grade水補(bǔ)充至20 μL,使用Roche LightCycler?96熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)條件為95°C 5 min預(yù)變性,95°C 15 s、60°C 20 s、72°C 15 s,40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào),溶解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。

    1.3.4 結(jié)果分析:計(jì)算miR-608和內(nèi)參U6經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)、每例標(biāo)本3個(gè)平行孔的平均循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct)值,應(yīng)用U6對(duì)各實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行均一化校正(ΔCt),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的?Ct=CtmiR-608-CtU6,miR-608相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔCt計(jì)算;??Ct=?CtAB組-?Ct對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miR-608相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)以2-ΔΔCt法計(jì)算。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 U6表達(dá)情況

    U6溶解曲線為銳利的單峰,出峰位置正確,表明反應(yīng)特異性好,結(jié)果可靠(圖1B)。擴(kuò)增曲線光滑,有明確的基線期、指數(shù)期和平臺(tái)期,AB組U6的Ct值為15.82±0.75,對(duì)照組U6的Ct值為17.15±0.84,二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)(P>0.05)。

    2.2 miR-608表達(dá)情況

    圖1 U6莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.1 The amplification curve and melting curve of U6 by stem?loop real?time PCR

    miR-608溶解曲線沒有雜峰,產(chǎn)物單一(圖2B)。AB組miR-608表達(dá)水平顯著下降,平均Ct值為25.98±1.03,對(duì)照組miR-608的Ct值為20.24± 0.76,二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2A)。

    圖2 miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.2 Amplification and melting curves of miR?608 by stem?loop RT?PCR

    2.3AB組和對(duì)照組miR-608表達(dá)水平比較

    以對(duì)照組miR-608的平均Ct值為1,對(duì)照組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.13±0.12,AB組miR-608表達(dá)相對(duì)值為0.38±0.03,AB組miR-608表達(dá)水平明顯降低,為對(duì)照組的33.73%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

    圖3 AB組和對(duì)照組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量分析Fig.3 Relative quantitative analysis of miR?608 in the amelo?blastoma and control groups by stem?loop RT?PCR

    2.4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平比較

    以復(fù)發(fā)組miR-608的平均Ct值為1,復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.03±0.05,原發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為2.07±0.14,復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平顯著降低,為原發(fā)組的48.89%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

    圖4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)PCR定量結(jié)果分析Fig.4 Analysis of miR?608 in the primary and recurrent amelo?blastoma groups by stem?loop RT?PCR

    2.5 miR-608表達(dá)與AB臨床病理特征

    不同年齡、性別和病理分型患者miR-608表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表1。

    3 討論

    Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵信號(hào)通路,它受靶細(xì)胞膜上2種受體 Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)控制[7]。近年來(lái)研究[8-9]發(fā)現(xiàn),該信號(hào)通路在牙齒早期發(fā)育和牙源性腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。自分泌刺激增殖和SHH信號(hào)通路抗凋亡作用在AB發(fā)生中起關(guān)鍵作用[10]。SHH通路上的多種信號(hào)分子,如PTCH1、SMO、Gli 1、Gli 2、Gli 3均在AB中高表達(dá),并和腫瘤上皮增殖相關(guān)[11]。miR-608位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的第2區(qū)3號(hào)帶第3號(hào)亞帶,在軟骨細(xì)胞中,SHH表達(dá)水平和miR-608呈負(fù)相關(guān),過(guò)表達(dá)miR-608或miR-602可抑制SHHmRNA和蛋白表達(dá)水平[12]。在AB中,SMO基因與AB等牙源性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),但具體突變位點(diǎn)和意義需要更多的研究證實(shí)。由此可見,miR-608可調(diào)控SHH,SMO等基因參與成牙組織異常和牙源性腫瘤[13]。

    表1 不同臨床病理特征AB中miR?608的表達(dá)Tab.1 miR?608 expression levels and clinicopathological fea?tures of ameloblastoma

    miR-608自身作為抑癌性miRNA,通過(guò)抑制其下游靶基因參與腫瘤診斷和治療,在肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮作用[3-5]。位于成熟miR-608序列上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs4919510 C>G可降低miR-608與上述癌基因的結(jié)合能力,可能是一個(gè)功能性SNP[14-16],研究[17-21]表明其和乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎癌、脊索瘤等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過(guò)莖環(huán)定量PCR的方法檢測(cè)了AB組和對(duì)照組中miR-608的表達(dá),并比較miR-608在AB組與對(duì)照組,原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組,以及AB不同臨床病理特征的組間差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-608在AB中表達(dá)明顯降低,原發(fā)AB組高于復(fù)發(fā)AB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-608可以抑制細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá),在AB中其表達(dá)下降,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和AB發(fā)生。本研究結(jié)果可能為成釉細(xì)胞瘤早期診斷、治療和預(yù)防提供生物標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)。由于本研究的臨床樣本數(shù)量有限,從現(xiàn)有標(biāo)本的數(shù)據(jù)分析中得出的結(jié)果,尚不能支持miR-608表達(dá)水平的高低與AB的病理學(xué)分型存在顯著的相關(guān)性,有待擴(kuò)大樣本,進(jìn)行更深入的探討。下一步還將針對(duì)miR-608SNP位點(diǎn)和AB發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及下游的靶基因功能進(jìn)行研究。

    [1]BILODEAU EA,COLLINS BM.Odontogenic cysts and neoplasms[J].Surg Pathol Clin,2017,10(1):177-222.DOI:10.1016/j. path.2016.10.006.

    [2]VAN BEIJNUM JR,GIOVANNETTI E,POEL D,et al.miRNAs:micro-managers of anticancer combination therapies[J].Angiogenesis,2017,20(2):269-285.DOI:10.1007/s10456-017-9545-x.

    [3]YANG H,LI Q,NIU J,et al.microRNA-342-5p and miR-608 inhibit colon cancer tumorigenesis by targeting NAA10[J].Oncotarget,2016,7(3):2709-2720.DOI:10.18632/oncotarget.6458.

    [4]WANG K,LIANG Q,WEI L,et al.microRNA-608 acts as a prog-nostic marker and inhibits the cell proliferation in hepatocellular carcinoma by macrophage migration inhibitory factor[J].Tumour Biol,2016,37(3):3823-3830.DOI:10.1007/s13277-015-4213-5.[5]OTHMAN N,IN LL,HARIKRISHNA JA,et al.Bcl-xL silencing induces alterations in hsa-miR-608 expression and subsequent cell death in A549 and SK-LU1 human lung adenocarcinoma cells[J]. PLoS One,2013,8(12):e81735.DOI:10.1371/journal. pone.0081735.

    [6]WANG Z,XUE Y,WANG P,et al.miR-608 inhibits the migration and invasion of glioma stem cells by targeting macrophage migration inhibitory factor[J].Oncol Rep,2016,35(5):2733-2742.DOI:10.3892/or.2016.4652.

    [7]D’AMICO D,CANETTIERI G.Translating hedgehog in cancer:controlling protein synthesis[J].Trends Mol Med,2016,22(10):851-862.DOI:10.1016/j.molmed.2016.08.003

    [8]GURGEL CA,BUIM ME,CARVALHO KC,et al.Transcriptional profiles SHH pathway genes in keratocystic odontogenic tumor andameloblastoma[J].J Oral Pathol Med,2014,43(8):619-626. DOI:10.1111/jop.12180.

    [9]KANDA S,MITSUYASU T,NAKAO Y,et al.Anti-apoptotic role of the sonic hedgehog signaling pathway in the proliferation of ameloblastoma[J].Int J Oncol,2013,43(3):695-702.DOI:10.3892/ ijo.2013.2010.

    [10]MISHRA P,PANDA A,BANDYOPADHYAY A,et al.Sonic hedgehog signalling pathway and ameloblastoma-a review[J].J Clin Diagn Res,2015,9(11):ZE10-3.DOI:10.7860/JCDR/2015/ 15443.6750.

    [11]張旭東,王潔.成釉細(xì)胞瘤分子病理機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2017,2(31):97-100.

    [12]AKHTAR N,MAKKI MS,HAQQI TM.microRNA-602 and microRNA-608 regulate sonic hedgehog expression via target sites inthe coding region in human chondrocytes[J].Arthritis Rheumatol,2015,67(2):423-434.DOI:10.1002/art.38952.

    [13]DAVANIAN H,BALASIDDAIAH A,HEYMANN R,et al.Ameloblastoma RNA profiling uncovers a distinct non-coding RNA signature[J].Oncotarget,2017,8(3):4530-4542.DOI:10.18632/ oncotarget.13889.

    [14]WEI WJ,WANG YL,LI DS,et al.Association study of single nucleotide polymorphisms in mature microRNAs and the risk ofthyroid tumor in a Chinese population.[J].Endocrine,2015,49(2):436-444.DOI:10.1007/s12020-014-0467-8.

    [15]ZHANG Y,SCHIFF D,PARK D,et al.microRNA-608 and microRNA-34a regulate chordoma malignancy by targeting EGFR,Bcl-xL and MET[J].PLoS One,2014,9(3):e91546.DOI:10.1371/journal.pone.0091546.

    [16]YING HQ,PENG HX,HE BS,et al.MiR-608,pre-miR-124-1 and pre-miR26a-1 polymorphisms modify susceptibility and recurrencefree survival in surgically resected CRC individuals[J].Oncotarget,2016,7(46):75865-75873.DOI:10.18632/oncotarget.12422.

    [17]MORALES S,GULPPI F,GONZALEZ-HORMAZABAL P,et al. Association of single nucleotide polymorphisms in Pre-miR-27a,Pre-miR-196a2,Pre-miR-423,miR-608 and Pre-miR-618 with breast cancer susceptibility in a South American population[J]. BMC Genet,2016,17(1):109.DOI:10.1186/s12863-016-0415-0.

    [18]SCLAFANI F,CHAU I,CUNNINGHAM D,et al.Sequence variation in mature microRNA-608 and benefit from neo-adjuvant treatment in locally advanced rectal cancer patients[J].Carcinogenesis,2016,37(9):852-857.DOI:10.1093/carcin/bgw073.

    [19]LI D,ZHU G,DI H,et al.Associations between genetic variants located in mature microRNAs and risk of lung cancer[J].Oncotarget,2016,7(27):41715-41724.DOI:10.18632/oncotarget.9566.

    [20]HASHEMI M,SANAEI S,REZAEI M,et al.miR-608 rs4919510 C>G polymorphism decreased the risk of breast cancer in an Iranian subpopulation[J].Exp Oncol,2016,38(1):57-59.

    [21]MA XP,YU G,CHEN X,et al.MiR-608 rs4919510 is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Tumour Biol,2016,37(7):9931-9942.DOI:10.1007/s13277-016-4897-1.

    (編輯 北 辰)

    The Expression and Significance of miR?608 in Ameloblastoma

    CHEN Jingyang1,ZHONG Ming2,SHEN Wenjing3,LIU Jie4

    (1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,College of Basic Medical Science,China Medical University,Shenyang 110122,China;2.Department of Oral Pathology,College of Stomatology,China Medical University,Shenyang 110002,China;3.Department of Gynecologic,The First Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China;4.The Science Experiment Center,China Medical University,Shenyang 110122,China)

    ObjectiveTo study the expression and significance ofmiR-608in ameloblastoma(AB).MethodsQuantitative stem-loop RTPCR was used to detect the expression ofmiR-608in 26 cases of human AB(AB group)and 17 cases of peritumoural tissues(control group).The differences inmiR-608levels between the control group and the AB groups,namely,primary AB and recurrent AB,were evaluated.In addition,miR-608levels in AB cases with different clinical and pathological characteristics were compared.ResultsThe expression level ofmiR-608in the AB group was significantly lower than that in the control group(P<0.05).Additionally,the relative expression level ofmiR-608in the primary AB group was significantly lower than that in the recurrent AB group(P<0.05).There were no significant differences between themiR-608expression levels with respet to age,gender,or pathological type(P>0.05).ConclusionsThe expression ofmiR-608in human AB tissue is significantly decreased,which may be related to the recurrence of the tumor.

    ameloblastoma;miR-608;quantitative stem-loop RT-PCR;tumor recurrence

    R780.2

    A

    0258-4646(2017)08-0724-05

    10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.012

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81470758);遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(LK201626);遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610159025)

    陳井陽(yáng)(1980-),男,技師,本科.

    劉潔,E-mail:lj6152003@163.com

    2017-05-24

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:

    猜你喜歡
    成釉細(xì)胞定量引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    從分子生物學(xué)角度對(duì)成釉細(xì)胞瘤診斷及治療的考量
    骨橋蛋白在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    2017 年WHO 成釉細(xì)胞瘤新分類的邏輯性與臨床指導(dǎo)意義
    當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測(cè)定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    成釉細(xì)胞瘤的病理分型與治療方式
    国产免费视频播放在线视频 | 最近中文字幕2019免费版| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品国产自在天天线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品女同一区二区软件| 精品一区二区三区视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 特级一级黄色大片| 国产精品综合久久久久久久免费| 黑人高潮一二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 免费黄色在线免费观看| 成人一区二区视频在线观看| av在线蜜桃| 精品国产三级普通话版| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品久久久久久久久免| 伦精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| 少妇的逼好多水| 禁无遮挡网站| 国产色爽女视频免费观看| 黄色一级大片看看| 国产一区二区三区av在线| 丰满乱子伦码专区| 最近的中文字幕免费完整| av在线老鸭窝| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 能在线免费观看的黄片| 久久这里有精品视频免费| 国产午夜福利久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品久久久久久久久av| 成人性生交大片免费视频hd| 国产一区有黄有色的免费视频 | 永久网站在线| 亚洲av免费在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品久久久久久成人av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜日本视频在线| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美成人午夜免费资源| 伦理电影大哥的女人| 午夜福利在线在线| 九色成人免费人妻av| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产在线一区二区三区精 | 一级毛片电影观看 | 久久鲁丝午夜福利片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 日本黄大片高清| 国产成人91sexporn| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久久久性生活片| 亚洲欧美成人精品一区二区| av播播在线观看一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美成人a在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人二区视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲经典国产精华液单| eeuss影院久久| 偷拍熟女少妇极品色| 午夜激情欧美在线| 尾随美女入室| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久6这里有精品| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久久久久成人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久久久久久久大av| 一个人免费在线观看电影| 桃色一区二区三区在线观看| 99热精品在线国产| 日韩欧美 国产精品| 久久精品综合一区二区三区| 最近的中文字幕免费完整| 中文字幕av在线有码专区| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲av成人av| 久久精品夜色国产| 搞女人的毛片| 久久精品国产自在天天线| 美女内射精品一级片tv| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲精品色激情综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 99视频精品全部免费 在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美成人a在线观看| av线在线观看网站| 欧美精品一区二区大全| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人aa在线观看| 99久国产av精品| 亚洲人成网站在线播| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产一级毛片七仙女欲春2| av免费在线看不卡| 精品一区二区三区视频在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲av日韩在线播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国内精品宾馆在线| 秋霞伦理黄片| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费搜索国产男女视频| 国产在视频线在精品| 伦精品一区二区三区| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美日本亚洲视频在线播放| 免费搜索国产男女视频| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲精品亚洲一区二区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产成人aa在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 看免费成人av毛片| 国产成人精品婷婷| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 看片在线看免费视频| 日日啪夜夜撸| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | av播播在线观看一区| 久久6这里有精品| 午夜精品国产一区二区电影 | 又爽又黄a免费视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲av成人av| 婷婷色av中文字幕| 大香蕉久久网| 我的女老师完整版在线观看| 少妇熟女欧美另类| 黄色日韩在线| 高清av免费在线| 午夜激情福利司机影院| 久久久欧美国产精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 一级毛片我不卡| 精品久久久久久久久久久久久| 全区人妻精品视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜免费激情av| 直男gayav资源| 精品不卡国产一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 中文字幕亚洲精品专区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91久久精品国产一区二区成人| 观看免费一级毛片| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产黄色小视频在线观看| videos熟女内射| 亚洲av中文av极速乱| 色播亚洲综合网| 一级爰片在线观看| 欧美日韩在线观看h| 亚洲精品影视一区二区三区av| 成人美女网站在线观看视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 日韩高清综合在线| 欧美日本视频| 热99在线观看视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲欧美日韩高清专用| 少妇熟女aⅴ在线视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 能在线免费观看的黄片| 欧美区成人在线视频| 丰满乱子伦码专区| 最近最新中文字幕大全电影3| 午夜福利在线在线| 最后的刺客免费高清国语| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产不卡一卡二| 久久久久九九精品影院| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产不卡一卡二| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久国产成人免费| 国产乱人偷精品视频| 少妇高潮的动态图| 国产精品人妻久久久影院| 免费搜索国产男女视频| 国产久久久一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| av在线播放精品| 一级爰片在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 在现免费观看毛片| 色综合色国产| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av不卡在线观看| 国内精品美女久久久久久| 天堂√8在线中文| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品自拍成人| 免费搜索国产男女视频| 麻豆成人av视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 三级毛片av免费| av天堂中文字幕网| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产色婷婷99| 亚洲av成人精品一二三区| 精品人妻熟女av久视频| 在线a可以看的网站| 91久久精品国产一区二区三区| 国产91av在线免费观看| 亚洲真实伦在线观看| 免费观看的影片在线观看| 麻豆成人av视频| 欧美精品国产亚洲| 久久草成人影院| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲av熟女| 精品人妻一区二区三区麻豆| 2022亚洲国产成人精品| 美女内射精品一级片tv| 麻豆一二三区av精品| 久久99热这里只有精品18| 麻豆乱淫一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 大香蕉97超碰在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚州av有码| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲人与动物交配视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久6这里有精品| 人人妻人人看人人澡| 国产成人91sexporn| 国产69精品久久久久777片| 在线天堂最新版资源| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 老女人水多毛片| 美女大奶头视频| 国产人妻一区二区三区在| 免费无遮挡裸体视频| 中国国产av一级| 99热这里只有是精品50| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲国产精品成人久久小说| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日本av手机在线免费观看| 久久人妻av系列| 国产 一区精品| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产单亲对白刺激| 三级国产精品欧美在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 床上黄色一级片| 高清在线视频一区二区三区 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线天堂最新版资源| 欧美激情在线99| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产亚洲91精品色在线| 久久久a久久爽久久v久久| av免费观看日本| 午夜激情福利司机影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产淫片久久久久久久久| .国产精品久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久欧美国产精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日本一本二区三区精品| 国产精品,欧美在线| 免费黄网站久久成人精品| 午夜福利在线在线| 热99re8久久精品国产| 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产视频首页在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲av成人av| 欧美97在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲自拍偷在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品久久视频播放| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久久久久久久久成人| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 看黄色毛片网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕 | 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久久九九精品二区国产| 日本欧美国产在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久午夜福利片| 日本熟妇午夜| 欧美zozozo另类| 国产探花极品一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品国产高清国产av| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产伦精品一区二区三区四那| 97超视频在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲三级黄色毛片| 长腿黑丝高跟| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 99久久成人亚洲精品观看| eeuss影院久久| 国产精品久久久久久久久免| eeuss影院久久| 极品教师在线视频| av免费观看日本| 婷婷色av中文字幕| 黄片wwwwww| 18禁动态无遮挡网站| 91av网一区二区| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产高潮美女av| 99在线视频只有这里精品首页| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜老司机福利剧场| 白带黄色成豆腐渣| 成人无遮挡网站| 在线a可以看的网站| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲av二区三区四区| 69av精品久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久99热这里只频精品6学生 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲丝袜综合中文字幕| 成年女人永久免费观看视频| 日韩一区二区视频免费看| 天堂√8在线中文| 国产探花在线观看一区二区| 成人特级av手机在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩视频在线欧美| 久久久精品94久久精品| 亚洲成av人片在线播放无| 男女国产视频网站| 久久亚洲国产成人精品v| 深爱激情五月婷婷| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 一级黄色大片毛片| 国产一区二区在线观看日韩| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲一区高清亚洲精品| 日韩欧美精品v在线| 久久久国产成人精品二区| 美女大奶头视频| 老司机福利观看| eeuss影院久久| 国产精品蜜桃在线观看| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品一区蜜桃| 国产精品一区二区三区四区久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| av在线天堂中文字幕| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品.久久久| 免费搜索国产男女视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最后的刺客免费高清国语| 欧美区成人在线视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 啦啦啦啦在线视频资源| 日韩中字成人| 国产大屁股一区二区在线视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 好男人视频免费观看在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 小说图片视频综合网站| 亚洲欧美清纯卡通| 1000部很黄的大片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人三级黄色视频| 99热这里只有精品一区| 国产成人91sexporn| 一级爰片在线观看| 九九热线精品视视频播放| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美一区二区亚洲| 黄色日韩在线| 久久久久网色| 久久精品人妻少妇| 女人被狂操c到高潮| 久久精品国产自在天天线| av黄色大香蕉| 少妇的逼好多水| 人人妻人人看人人澡| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产真实乱freesex| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久久久网色| 久久99蜜桃精品久久| 18禁动态无遮挡网站| 成人国产麻豆网| 国产大屁股一区二区在线视频| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美日本视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 日韩三级伦理在线观看| 久久久欧美国产精品| 嫩草影院新地址| 国产高清不卡午夜福利| 午夜免费激情av| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 男人狂女人下面高潮的视频| 精品一区二区免费观看| 亚洲在线观看片| 色哟哟·www| 中国美白少妇内射xxxbb| 色播亚洲综合网| 日本黄色视频三级网站网址| 99热全是精品| 色噜噜av男人的天堂激情| av黄色大香蕉| 国产精品日韩av在线免费观看| 特级一级黄色大片| 亚洲va在线va天堂va国产| 男的添女的下面高潮视频| 啦啦啦啦在线视频资源| www.色视频.com| 成人综合一区亚洲| 我要搜黄色片| 黄色日韩在线| 精品人妻熟女av久视频| 精华霜和精华液先用哪个| 中文在线观看免费www的网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 97超碰精品成人国产| 日韩av在线大香蕉| 国产精品一区二区性色av| 久久精品夜色国产| 在线观看一区二区三区| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 伦理电影大哥的女人| 国产精品熟女久久久久浪| 又粗又爽又猛毛片免费看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 看黄色毛片网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 日本黄大片高清| 久久精品久久久久久久性| 男女下面进入的视频免费午夜| 天堂网av新在线| 国产高清国产精品国产三级 | 国产真实乱freesex| 亚洲成人精品中文字幕电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜精品国产一区二区电影 | 日韩一本色道免费dvd| 超碰97精品在线观看| 日日撸夜夜添| 少妇的逼水好多| 欧美激情在线99| 身体一侧抽搐| 久久99热6这里只有精品| 少妇丰满av| av在线老鸭窝| 观看美女的网站| 一级黄色大片毛片| 免费在线观看成人毛片| 99热网站在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一个人观看的视频www高清免费观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久99热6这里只有精品| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲人成网站在线观看播放| 色播亚洲综合网| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产男人的电影天堂91| 日本熟妇午夜| 亚洲国产精品成人久久小说| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 99久久无色码亚洲精品果冻| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 精品一区二区三区视频在线| 26uuu在线亚洲综合色| 啦啦啦韩国在线观看视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 欧美97在线视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 午夜福利网站1000一区二区三区| 老司机福利观看| 精品久久国产蜜桃| 网址你懂的国产日韩在线| 久99久视频精品免费| 热99在线观看视频| 久久久久久久久中文| 亚洲精品影视一区二区三区av| 日韩精品青青久久久久久| 国产在线一区二区三区精 | 成人一区二区视频在线观看| 欧美激情在线99| 中文字幕av成人在线电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| or卡值多少钱| 老司机影院毛片| 99热这里只有是精品在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 日韩一区二区三区影片| 国产精品,欧美在线| 伦精品一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久久久久久亚洲| 久久这里有精品视频免费| 好男人视频免费观看在线| 2022亚洲国产成人精品| 男女那种视频在线观看| av在线播放精品| 午夜福利高清视频| 在线播放国产精品三级| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产在线男女| 一级毛片我不卡| 男人舔奶头视频| 级片在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 我的老师免费观看完整版| 蜜桃久久精品国产亚洲av| or卡值多少钱| 免费观看在线日韩| 午夜精品国产一区二区电影 | 永久网站在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 精品久久国产蜜桃| 精品不卡国产一区二区三区| 成人二区视频| 成年女人永久免费观看视频| 欧美日韩综合久久久久久| 免费黄色在线免费观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 看免费成人av毛片| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 大香蕉久久网| 国产视频内射| 久久久久久久久久黄片| 国产精品.久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 在现免费观看毛片| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 一本一本综合久久| 婷婷六月久久综合丁香| 特级一级黄色大片| 水蜜桃什么品种好| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲无线观看免费| 久久久国产成人免费| 免费av毛片视频| 欧美日本视频| 久久久国产成人免费|