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    miR?608在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

    2017-09-03 10:01:56陳井陽(yáng)鐘鳴沈文靜劉潔
    關(guān)鍵詞:成釉細(xì)胞定量引物

    陳井陽(yáng),鐘鳴,沈文靜,劉潔

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110122;2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;3.附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽(yáng) 110001;4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110122)

    miR?608在成釉細(xì)胞瘤中的表達(dá)及意義

    陳井陽(yáng)1,鐘鳴2,沈文靜3,劉潔4

    (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110122;2.口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110002;3.附屬第一醫(yī)院婦科,沈陽(yáng) 110001;4.科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,沈陽(yáng) 110122)

    目的研究miR-608在成釉細(xì)胞瘤(AB)中的表達(dá)及意義。方法利用實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR方法檢測(cè)miR-608在26例人成釉細(xì)胞瘤(AB組)及17例瘤旁組織(對(duì)照組)中的表達(dá)水平,比較miR-608在AB組與對(duì)照組,原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組,以及AB不同臨床病理特征的組間差異。結(jié)果AB中miR-608表達(dá)水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);復(fù)發(fā)組miR-608的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-608表達(dá)水平在不同年齡、性別和病理分型患者中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論人AB組織中miR-608表達(dá)水平顯著下降,可能與該腫瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)相關(guān)。

    成釉細(xì)胞瘤;微小核糖核酸608;實(shí)時(shí)莖環(huán)定量PCR;腫瘤復(fù)發(fā)

    成釉細(xì)胞瘤(ameloblastom,AB)為口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤,是一種具有局部侵襲和易復(fù)發(fā)特征的臨界瘤[1]。由于其病因尚不明確,缺乏有效的治療措施,目前多采用手術(shù)切除,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,給患者身心帶來(lái)極大傷害。因此,闡明該腫瘤發(fā)生演進(jìn)的關(guān)鍵機(jī)制,尋找新的預(yù)防措施和治療途徑具有重要意義。

    微小RNA(microRNA,miRNA)是一類大小約22個(gè)核苷酸進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,隨著對(duì)其研究的深入,它和腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,及在腫瘤診斷和治療方面潛在的應(yīng)用價(jià)值引起了廣泛的關(guān)注[2]。微小RNA 608(microRNA 608,miR-608)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用的miRNA。經(jīng)TargetScan生物信息軟件預(yù)測(cè)其下游靶基因有表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、人β-連環(huán)素蛋白互作蛋白1(catenin beta interacting protein 1,CTNNBIP1)、多種整合素分子等。研究[3-6]表明,miR-608可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程和下調(diào)遷移能力,過(guò)表達(dá)miR-608可抑制肝癌細(xì)胞的增殖,miR-608可通過(guò)影響含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶凋亡通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞調(diào)亡,并抑制細(xì)胞增殖,miR-608還可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力,但其在AB中的作用及機(jī)制尚未有明確報(bào)道。本研究通過(guò)莖環(huán)法定量PCR檢測(cè)AB及癌旁對(duì)照組織中miR-608的表達(dá),并探討其意義。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源

    收集2014年1月至2016年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科手術(shù)切除的26例AB標(biāo)本,作為AB組,按照復(fù)發(fā)情況又將其分為原發(fā)組(18例),復(fù)發(fā)組(8例)。AB組中男12例,女14例,年齡19~73歲,平均年齡43.44歲。按照病理分型分為實(shí)性/多囊型20例,其他型6例(包括外周型AB1例,單囊型5例)。17例瘤旁黏膜標(biāo)本為對(duì)照組,其中男性8例,女性9例,年齡19~73歲,平均年齡46.17歲?;颊咝g(shù)前未接受放化療等輔助治療,術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)診斷。標(biāo)本采集均已告知患者及家屬,并簽署知情同意書,且經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。標(biāo)本在液氮下速凍,然后置于-80℃冰箱保存。

    1.2 主要試劑

    Trizol購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)購(gòu)自美國(guó)Amersco公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNA-ase)購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司;定量PCR擴(kuò)增試劑盒Real Star Green Fast Mixture購(gòu)自中國(guó)康潤(rùn)生物有限公司;miR-608莖環(huán)及定量PCR引物、U6內(nèi)參引物均由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。

    1.3 莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR

    1.3.1 引物序列:利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物和qPCR上下游引物,miR-608莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGCGCGCTGCCGCTGAGACGGAGC-3’;上游引物為5’-GGTGGTGTTGGGATAGCTTCGT-3’,下游引物為5’-GGCTGTCGTGGACTGCG-3’;U6莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’;上游引物為5’-TCGCTTCGGCAGCACATA-3’,下游引物為5’-GGGCCATGCTAATCTTCTCTG-3’。目的片段長(zhǎng)度約60 bp,退火溫度60°C。

    1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:組織勻漿后按照Trizol說(shuō)明書操作,提取總RNA,分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度,-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前將提取好的RNA從-80℃冰箱中取出,放在冰上溶解,待用。配置100 μmol/L各莖環(huán)原液,分別吸取1 μL至RNase-free水,使終體積為100 μL,則每個(gè)莖環(huán)的終濃度為1 μmol/L,混合莖環(huán)。首先在去除基因組DNA反應(yīng)體系中加入Total RNA 1~2 μg、5×gDNA Buffer 2 μL、RNasefree水補(bǔ)充體積到10 μL,徹底混勻,簡(jiǎn)短離心,并置于42℃孵育3 min,迅速放在冰上放置。加入10× Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL、莖環(huán)混合RT引物2 μL、RNase-free水補(bǔ)充總體積到10 μL配制成反轉(zhuǎn)錄體系混合物。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的混合物,加入基因組DNA去除步驟的反應(yīng)液中,充分混勻。PCR反應(yīng)條件為42°C 15 min,95°C 3 min,-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR:使用2×Real Star Green Mixture配制反應(yīng)混合物,將上述逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA 1 μL、Real Star Green Mixture(2×)10 μL、Primers 0.6 μL用PCR-grade水補(bǔ)充至20 μL,使用Roche LightCycler?96熒光定量PCR儀進(jìn)行定量PCR。反應(yīng)條件為95°C 5 min預(yù)變性,95°C 15 s、60°C 20 s、72°C 15 s,40個(gè)循環(huán)后采集熒光信號(hào),溶解曲線由儀器自動(dòng)設(shè)置。

    1.3.4 結(jié)果分析:計(jì)算miR-608和內(nèi)參U6經(jīng)過(guò)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)、每例標(biāo)本3個(gè)平行孔的平均循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct)值,應(yīng)用U6對(duì)各實(shí)驗(yàn)組樣品進(jìn)行均一化校正(ΔCt),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的?Ct=CtmiR-608-CtU6,miR-608相對(duì)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔCt計(jì)算;??Ct=?CtAB組-?Ct對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組miR-608相對(duì)表達(dá)量差異倍數(shù)以2-ΔΔCt法計(jì)算。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 U6表達(dá)情況

    U6溶解曲線為銳利的單峰,出峰位置正確,表明反應(yīng)特異性好,結(jié)果可靠(圖1B)。擴(kuò)增曲線光滑,有明確的基線期、指數(shù)期和平臺(tái)期,AB組U6的Ct值為15.82±0.75,對(duì)照組U6的Ct值為17.15±0.84,二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)(P>0.05)。

    2.2 miR-608表達(dá)情況

    圖1 U6莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.1 The amplification curve and melting curve of U6 by stem?loop real?time PCR

    miR-608溶解曲線沒有雜峰,產(chǎn)物單一(圖2B)。AB組miR-608表達(dá)水平顯著下降,平均Ct值為25.98±1.03,對(duì)照組miR-608的Ct值為20.24± 0.76,二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2A)。

    圖2 miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖Fig.2 Amplification and melting curves of miR?608 by stem?loop RT?PCR

    2.3AB組和對(duì)照組miR-608表達(dá)水平比較

    以對(duì)照組miR-608的平均Ct值為1,對(duì)照組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.13±0.12,AB組miR-608表達(dá)相對(duì)值為0.38±0.03,AB組miR-608表達(dá)水平明顯降低,為對(duì)照組的33.73%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

    圖3 AB組和對(duì)照組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)定量分析Fig.3 Relative quantitative analysis of miR?608 in the amelo?blastoma and control groups by stem?loop RT?PCR

    2.4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平比較

    以復(fù)發(fā)組miR-608的平均Ct值為1,復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為1.03±0.05,原發(fā)組miR-608表達(dá)相對(duì)值為2.07±0.14,復(fù)發(fā)組miR-608表達(dá)水平顯著降低,為原發(fā)組的48.89%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

    圖4 原發(fā)組和復(fù)發(fā)組miR?608莖環(huán)實(shí)時(shí)PCR定量結(jié)果分析Fig.4 Analysis of miR?608 in the primary and recurrent amelo?blastoma groups by stem?loop RT?PCR

    2.5 miR-608表達(dá)與AB臨床病理特征

    不同年齡、性別和病理分型患者miR-608表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表1。

    3 討論

    Sonic Hedgehog(SHH)信號(hào)通路是調(diào)控胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵信號(hào)通路,它受靶細(xì)胞膜上2種受體 Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)控制[7]。近年來(lái)研究[8-9]發(fā)現(xiàn),該信號(hào)通路在牙齒早期發(fā)育和牙源性腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。自分泌刺激增殖和SHH信號(hào)通路抗凋亡作用在AB發(fā)生中起關(guān)鍵作用[10]。SHH通路上的多種信號(hào)分子,如PTCH1、SMO、Gli 1、Gli 2、Gli 3均在AB中高表達(dá),并和腫瘤上皮增殖相關(guān)[11]。miR-608位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的第2區(qū)3號(hào)帶第3號(hào)亞帶,在軟骨細(xì)胞中,SHH表達(dá)水平和miR-608呈負(fù)相關(guān),過(guò)表達(dá)miR-608或miR-602可抑制SHHmRNA和蛋白表達(dá)水平[12]。在AB中,SMO基因與AB等牙源性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),但具體突變位點(diǎn)和意義需要更多的研究證實(shí)。由此可見,miR-608可調(diào)控SHH,SMO等基因參與成牙組織異常和牙源性腫瘤[13]。

    表1 不同臨床病理特征AB中miR?608的表達(dá)Tab.1 miR?608 expression levels and clinicopathological fea?tures of ameloblastoma

    miR-608自身作為抑癌性miRNA,通過(guò)抑制其下游靶基因參與腫瘤診斷和治療,在肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中發(fā)揮作用[3-5]。位于成熟miR-608序列上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)rs4919510 C>G可降低miR-608與上述癌基因的結(jié)合能力,可能是一個(gè)功能性SNP[14-16],研究[17-21]表明其和乳腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、肝癌、腎癌、脊索瘤等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過(guò)莖環(huán)定量PCR的方法檢測(cè)了AB組和對(duì)照組中miR-608的表達(dá),并比較miR-608在AB組與對(duì)照組,原發(fā)AB組與復(fù)發(fā)AB組,以及AB不同臨床病理特征的組間差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-608在AB中表達(dá)明顯降低,原發(fā)AB組高于復(fù)發(fā)AB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-608可以抑制細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá),在AB中其表達(dá)下降,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和AB發(fā)生。本研究結(jié)果可能為成釉細(xì)胞瘤早期診斷、治療和預(yù)防提供生物標(biāo)志物和作用靶點(diǎn)。由于本研究的臨床樣本數(shù)量有限,從現(xiàn)有標(biāo)本的數(shù)據(jù)分析中得出的結(jié)果,尚不能支持miR-608表達(dá)水平的高低與AB的病理學(xué)分型存在顯著的相關(guān)性,有待擴(kuò)大樣本,進(jìn)行更深入的探討。下一步還將針對(duì)miR-608SNP位點(diǎn)和AB發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及下游的靶基因功能進(jìn)行研究。

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    (編輯 北 辰)

    The Expression and Significance of miR?608 in Ameloblastoma

    CHEN Jingyang1,ZHONG Ming2,SHEN Wenjing3,LIU Jie4

    (1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,College of Basic Medical Science,China Medical University,Shenyang 110122,China;2.Department of Oral Pathology,College of Stomatology,China Medical University,Shenyang 110002,China;3.Department of Gynecologic,The First Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China;4.The Science Experiment Center,China Medical University,Shenyang 110122,China)

    ObjectiveTo study the expression and significance ofmiR-608in ameloblastoma(AB).MethodsQuantitative stem-loop RTPCR was used to detect the expression ofmiR-608in 26 cases of human AB(AB group)and 17 cases of peritumoural tissues(control group).The differences inmiR-608levels between the control group and the AB groups,namely,primary AB and recurrent AB,were evaluated.In addition,miR-608levels in AB cases with different clinical and pathological characteristics were compared.ResultsThe expression level ofmiR-608in the AB group was significantly lower than that in the control group(P<0.05).Additionally,the relative expression level ofmiR-608in the primary AB group was significantly lower than that in the recurrent AB group(P<0.05).There were no significant differences between themiR-608expression levels with respet to age,gender,or pathological type(P>0.05).ConclusionsThe expression ofmiR-608in human AB tissue is significantly decreased,which may be related to the recurrence of the tumor.

    ameloblastoma;miR-608;quantitative stem-loop RT-PCR;tumor recurrence

    R780.2

    A

    0258-4646(2017)08-0724-05

    10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.012

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81470758);遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(LK201626);遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610159025)

    陳井陽(yáng)(1980-),男,技師,本科.

    劉潔,E-mail:lj6152003@163.com

    2017-05-24

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:

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