邢佳鑫，孫溢華，2，宣金鋒，姚軍，丁梅，龐灝，李春梅，夏皙，王保捷

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清教研室，沈陽(yáng) 110122；2.蘇州市公安局吳中分局法醫(yī)DNA室，江蘇 蘇州 215104）

熒光標(biāo)記LDR?PCR復(fù)合擴(kuò)增方法對(duì)高度降解DNA檢材的SNPs分型研究

邢佳鑫1，孫溢華1，2，宣金鋒1，姚軍1，丁梅1，龐灝1，李春梅1，夏皙1，王保捷1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)血清教研室，沈陽(yáng) 110122；2.蘇州市公安局吳中分局法醫(yī)DNA室，江蘇 蘇州 215104）

目的構(gòu)建一套基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)（LDR）的熒光標(biāo)記PCR復(fù)合擴(kuò)增體系，為解決高度降解DNA法醫(yī)學(xué)分析提供新的策略。方法選擇8個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)（rs10802248、rs10516197、rs10488372、rs2278945、rs4757318、rs4887255、rs4889002和rs9304473），設(shè)計(jì)合成各SNPs位點(diǎn)的LDR探針和連接產(chǎn)物PCR引物，通過(guò)LDR將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管凝膠電泳，構(gòu)建復(fù)合擴(kuò)增SNPs分型體系。結(jié)果使用熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法，對(duì)不同個(gè)體的8個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分型，分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致；對(duì)于甲醛固定石蠟包埋組織（FFPET）檢材高度降解的DNA樣品，熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增體系能夠?qū)崿F(xiàn)8個(gè)SNPs位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型。結(jié)論熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法能夠?qū)?個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行一次性分型，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，是一種簡(jiǎn)單、高效并且較為實(shí)用的SNPs分型新方法，適用于高度降解檢材的檢測(cè)。

法醫(yī)物證學(xué)；連接酶檢測(cè)反應(yīng)；復(fù)合擴(kuò)增；降解DNA；單核苷酸多態(tài)性

在實(shí)際檢驗(yàn)過(guò)程中，法醫(yī)鑒定人員要面對(duì)高度降解的生物學(xué)檢材。為了解決高度降解DNA檢材的個(gè)人識(shí)別難題，許多實(shí)驗(yàn)室采用縮短靶DNA片段的擴(kuò)增子長(zhǎng)度這一基本策略，其中最具代表性的就是miniSTR技術(shù)。近年來(lái)，一種基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR）的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型技術(shù)迅速發(fā)展，為解決降解DNA法醫(yī)學(xué)分析難題提供了新的方法。本研究擬構(gòu)建一套含有8個(gè)SNPs位點(diǎn)的基于LDR熒光標(biāo)記的PCR復(fù)合擴(kuò)增體系，并應(yīng)用于對(duì)甲醛固定石蠟包埋組織（formalin fixed and paraffinembeddedtissues，F(xiàn)FPET）中降解DNA的分型檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集6例中國(guó)北方漢族的無(wú)關(guān)個(gè)體抗凝血樣品（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)物證教研室提供）。選取同一具尸體的心臟、肝臟、腦、腎臟和肺臟組織樣品，體積約為2 cm×2 cm×2 cm，10%中性甲醛溶液固定3 d、7 d和15 d后，進(jìn)行石蠟包埋；抽取心腔血作為陽(yáng)性對(duì)照，以上樣品由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)病理學(xué)教研室提供。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：Ampligase Thermostable DNA連接酶（美國(guó)Epicentre Technologies公司）；GeneScan 120 LIZ分子量?jī)?nèi)標(biāo)、GeneScan 600 LIZ分子量?jī)?nèi)標(biāo)、AmpF?STR Identifiler試劑盒和Hi-Di甲酰胺（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.2.2 儀器：PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，AB9700）；遺傳分析儀（美國(guó)Applied Biosystems公司，AB3500）；高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，HC-2062）；恒溫水浴槽（美國(guó)Crystal Technology Industries公司，SY-1220）；超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司，Nano-Drop2000）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Pall Corporation，Cascada LS）。

1.3 DNA提取及DNA質(zhì)量控制

采用有機(jī)酚/氯仿法［1］提取全血檢材DNA。FFPET檢材經(jīng)二甲苯脫蠟后［2-3］，采用Chelex-100法提取DNA［4］。使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA的OD260和OD280。FFPET檢材DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其降解程度，并設(shè)計(jì)了3對(duì)降解程度評(píng)價(jià)引物，對(duì)FFPET檢材DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用以檢測(cè)其DNA的降解程度。見表1。

表1 降解程度評(píng)價(jià)引物Tab.1 Primers for evaluating the degradation degree

PCR擴(kuò)增其他反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，復(fù)性時(shí)間為30 s，72℃延伸，延伸時(shí)間為20 s，終末72℃延伸10 min，循環(huán)34次。PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR緩沖液（含Mg2+）2 μL，dNTP混合物2 μL，上下游引物（5 μmol/L）各2 μL，rTaq酶1 U，模板0.1 μg，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。

1.4 SNPs位點(diǎn)的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/SNP，http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgGateway）中SNPs信息，初步篩選出20個(gè)SNPs位點(diǎn)，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件和序列比對(duì)工具（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)所有SNPs位點(diǎn)上下游30個(gè)核苷酸序列進(jìn)行自身和相互間結(jié)構(gòu)檢查，并進(jìn)行各SNPs單位點(diǎn)的連接酶檢測(cè)反應(yīng)條件的控制與優(yōu)化，最終確定LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增體系中 的 8個(gè) SNPs位點(diǎn)：rs10802248、rs10516197、rs10488372、 rs2278945、 rs4757318、rs4887255、 rs4889002和rs9304473。

1.5 DNA樣品的8個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型確認(rèn)

將中國(guó)北方地區(qū)漢族的個(gè)體DNA樣品送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得8個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型。

1.6 熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)的構(gòu)建

針對(duì)各待測(cè)SNPs位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)1條公共探針（Ⅰ）和2條等位基因特異性探針（Ⅱ和Ⅲ）。LDR的反應(yīng)體系為40 μL，其中含10×緩沖液4 μL，LDR探針混合物6 μL，DNA模板0.1 μg，DNA連接酶2 U；反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性40 s，63℃退火并連接10 min，循環(huán)30次；最后63℃連接20 min；4℃保存。

將連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，其中含10×PCR緩沖液2 μL，dNTP混合物2 μL，Po（5’-GCAAGATAAGGAATCGTAGACT-3’，5 μmol/L）3 μL，Pa（5’-6-FAM-AGGTAACTCCATAAGGT-GTCTT-3’，5 μmol/L）1.25 μL，Pb（5’-6-JOE-AGTGGAATGCTACCAGTTAGAT-3’，5 μmol/L）0.85 μL，Pc（5’-ROX-TCGTGTGATCGTATTGGTTCT-3’，5 μmol/L）0.9 μL，LDR連接產(chǎn)物5 μL，Taq酶1 U；反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，64℃復(fù)性30 s，72℃延伸20 s，循環(huán)31次；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)AB3500遺傳分析儀電泳檢測(cè)并進(jìn)行結(jié)果分析。根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度和熒光顏色，將SNP位點(diǎn)分為A組、B組和C組。見表2。

2 結(jié)果

2.1 DNA降解程度檢測(cè)結(jié)果

心腔血液DNA樣品的電泳譜帶顯示未發(fā)生明顯降解。經(jīng)10%中性甲醛溶液固定的各臟器FF-PET DNA譜帶均呈現(xiàn)涂抹狀彌散，說(shuō)明DNA發(fā)生了降解。固定時(shí)間越長(zhǎng)，DNA降解程度越高；不同臟器FFPET的DNA降解速率也存在較大差異，見圖1。

表2 SNPs位點(diǎn)LDR寡核苷酸探針及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab.2 LDR oligonucleotide probes of SNPs and the lengths of PCR products

圖1 不同固定時(shí)間FFPET檢材DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis of FFPET fixed for different periods

使用3對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為50 bp、103 bp和 198 bp的引物對(duì)固定15 d的FFPET檢材DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯示腦組織和心肌組織3種片段長(zhǎng)度均能擴(kuò)出；肺臟和腎臟組織200 bp片段無(wú)法擴(kuò)出；肝臟組織只能擴(kuò)出50 bp片段，見圖2。

2.2 FFPET檢材試劑盒直接檢測(cè)結(jié)果

圖2 固定15 d的FFPET檢材DNA的降解評(píng)價(jià)引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰氨凝膠電泳圖譜Fig.2 PAGE of PCR products obtained from 15?day fixed FFPET DNA by using the evaluated primers

應(yīng)用國(guó)際通用的Identifiler試劑盒，對(duì)心腔血液和經(jīng)10%中性甲醛固定15 d的各臟器FFPET檢材的DNA樣品進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)分型。

血液樣品所有位點(diǎn)均能成功分型（圖3A）；肺臟組織樣品4個(gè)位點(diǎn)檢出結(jié)果（圖3B）；腎臟組織樣品3個(gè)位點(diǎn)檢出結(jié)果（圖3C）；肝臟組織樣品只有性別位點(diǎn)檢出結(jié)果（圖3D）。

2.3 北方漢族無(wú)關(guān)個(gè)體LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法，對(duì)6份中國(guó)北方地區(qū)漢族個(gè)體樣品進(jìn)行檢測(cè)（圖4、5），分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。

2.4 FFPET樣品LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增體系對(duì)10%中性甲醛固定15 d的FFPET檢材進(jìn)行檢測(cè)，均獲得了準(zhǔn)確分型結(jié)果，見圖6。

圖3 血液及甲醛固定15 d的FFPET檢材經(jīng)Identifiler試劑盒擴(kuò)增產(chǎn)物分型圖譜Fig.3 Profiles of blood DNA and 15?day fixed FFPET DNA using the Identifiler Kit

圖4 LDR?PCR等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物電泳圖譜Fig.4 Profile of the LDR?PCR ladder

圖5 應(yīng)用LDR?PCR復(fù)合擴(kuò)增方法檢測(cè)6份中國(guó)北方地區(qū)漢族無(wú)關(guān)個(gè)體電泳圖譜Fig.5 LDR?PCR profiles of six Han individuals in Northern China

圖6 固定15 d的肺、腎及肝組織FFPET檢材LDR?PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)分型圖譜Fig.6 LDR?PCR profiles of 15?day fixed lung，kidney，and liver FFPET DNA

3 討論

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）作為第2代遺傳標(biāo)記，因其基因片段短、擴(kuò)增效率高、判型準(zhǔn)確等特點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)的個(gè)人識(shí)別和親緣關(guān)系鑒定中。但是在檢測(cè)降解檢材時(shí)，常出現(xiàn)等位基因丟失和擴(kuò)增不均衡等現(xiàn)象。根據(jù)降解DNA的特點(diǎn)，可以通過(guò)改變引物的結(jié)合位置、縮短擴(kuò)增片段長(zhǎng)度等方法來(lái)提高基因座的檢出率。Applied Biosystems公司推出了miniSTR試劑盒——MiniFiler，其中包含了8個(gè)STR基因座和1個(gè)性別基因座，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分布在70～283 bp。

SNPs作為第3代遺傳標(biāo)記，被認(rèn)為是分析降解檢材DNA的理想標(biāo)記，主要是因?yàn)槠涠鄳B(tài)性存在于單個(gè)核苷酸的堿基類型上。因此與STR相比，能夠大大縮短PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。英國(guó)法庭科學(xué)服務(wù)部根據(jù)等位基因特異性PCR方法研制出SNPs復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒——Foren-SNPs，用于降解DNA檢材的分析［5-6］，其中包含20個(gè)SNPs位點(diǎn)和1個(gè)性別基因座，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分布在57～146 bp。SANCHEZ等［7］篩選出52個(gè)SNPs位點(diǎn)用于法醫(yī)學(xué)應(yīng)用，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在59～115 bp。國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)及歐洲D(zhuǎn)NA分型學(xué)會(huì)建立了含有29個(gè)SNPs位點(diǎn)的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)［8］。Applied Biosystems也推出了SNPs分型試劑盒——GenPlex HID System［9-10］，其中包含48個(gè)位于常染色體的SNPs位點(diǎn)和1個(gè)性別檢測(cè)位點(diǎn)。FREIRE-ARADAS等［11］選擇了18個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度位于56～118 bp。

為了提高SNPs檢測(cè)反應(yīng)的特異性和靈敏度，需要對(duì)DNA進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，大部分?jǐn)U增產(chǎn)物的長(zhǎng)度＞70 bp。如果應(yīng)用LDR技術(shù)則不需要進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，根據(jù)緊鄰SNPs位點(diǎn)上下游一段核苷酸設(shè)計(jì)序列特異的寡核苷酸探針，將模板DNA片段長(zhǎng)度控制在50 bp以下。ZHANG等［12］設(shè)計(jì)了21～37 bp長(zhǎng)短不等的序列特異性靶序列結(jié)合探針，對(duì)經(jīng)DNaseⅠ處理的DNA樣品（＜100 bp）進(jìn)行了檢測(cè)，成功獲得了4個(gè)SNPs位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型。

本研究篩選出了8個(gè)SNPs位點(diǎn)，成功構(gòu)建了LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系，對(duì)＜50 bp的DNA模板檢測(cè)獲得了準(zhǔn)確的分型結(jié)果。

綜上所述，熒光標(biāo)記LDR-PCR復(fù)合擴(kuò)增方法適用于高度降解檢材的檢測(cè)，對(duì)于＜50 bp的DNA片段也可以獲得準(zhǔn)確的SNPs分型，進(jìn)而進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

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（編輯 于 溪）

Study on SNP Genotyping of Degraded DNA by Fluorescence?labeled Multiplex LDR?PCR Amplification

XING Jiaxin1，SUN Yihua1，2，XUAN Jinfeng1，YAO Jun1，DING Mei1，PANG Hao1，LI Chunmei1，XIA Xi1，WANG Baojie1

（1.Department of Forensic Genetics，School of Forensic Medicine，China Medical University，Shenyang 110122，China；2.Forensic DNA Section，Wuzhong District Bureau of Suzhou Public Security Bureau，Suzhou 215104，China）

ObjectiveIn this study，a multiplex PCR amplification system was constructed based on fluorescent labeling PCR and LDR，to provide a new strategy for analyzing severely degraded DNA.MethodsEight SNP loci（rs10802248，rs10516197，rs10488372，rs2278945，rs4757318，rs4887255，rs4889002，and rs9304473）were selected.Their LDR probes and PCR primers of linked products were designed and synthesized.Ligase detection reaction，PCR amplification，and capillary gel electrophoresis（CEG）were performed to establish the multiplex LDRPCR amplification system.ResultsThe genotypes of these 8 loci were obtained simultaneously by the fluorescence-labeled multiplex LDR-PCR amplification method.The loci profiles obtained by fluorescence-labeled multiplex LDR-PCR amplification were in accordance with those obtained by direct sequencing of the polymorphic regions in samples from all individuals.By fluorescence-labeled multiplex LDR-PCR amplification，the 8 SNP loci were efficiently amplified from the severely degraded FFPET DNA.ConclusionEight SNP loci results could be obtained simultaneously by using the multiplex LDR-PCR amplification system，which is a simple，efficient，and practical SNP genotyping method with accurate and reliable results for highly degraded samples.

forensics biological evidence；ligase detection reaction；compound amplification；degraded DNA；SNPs

R89

A

0258-4646（2017）08-0703-07

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.008

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013319）

邢佳鑫（1980-），男，講師，博士.

王保捷，E-mail：bjwang@cmu.edu.cn

2016-12-22

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：