2014—2017年豬偽狂犬病病原與野毒gE抗體監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與預(yù)防對(duì)策

牟 迪，夏 偉，唐志芬，張宇輝，朱慶虎，袁 遠(yuǎn)，熊永忠

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬病防制與保健

2014—2017年豬偽狂犬病病原與野毒gE抗體監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析與預(yù)防對(duì)策

牟 迪，夏 偉，唐志芬，張宇輝，朱慶虎，袁 遠(yuǎn)，熊永忠

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一種高度接觸性傳染病。作為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的豬傳染病之一，感染豬偽狂犬病引起的主要癥狀有種豬繁殖障礙，仔豬呼吸道病綜合征、神經(jīng)癥狀、腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育受阻等。20周齡以下的仔豬感染率和死亡率可達(dá)100%，成年豬常呈隱性潛伏感染或長(zhǎng)期帶毒的狀態(tài)，當(dāng)環(huán)境激變或者被其它應(yīng)激因素激發(fā)，往往可與其它病原體協(xié)同作用引起多種疾病的發(fā)生，從而引起疫病的暴發(fā)。目前，我國(guó)應(yīng)用偽狂犬病基因工程缺失疫苗對(duì)PR進(jìn)行免疫，使得該病的流行趨勢(shì)有所緩和，但該病的潛伏感染情況還是相當(dāng)普遍，其臨床癥狀已經(jīng)從典型轉(zhuǎn)為非典型，雖死亡率大幅降低，但是卻嚴(yán)重影響豬群的生長(zhǎng)速度和繁殖性能，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，做好豬場(chǎng)偽狂犬病的病原檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)，及時(shí)清除隱性帶毒豬，對(duì)凈化豬群至關(guān)重要。為掌握現(xiàn)有的防疫控制體系下我國(guó)豬場(chǎng)偽狂犬病感染的狀況，及為有效控制和消滅豬偽狂犬病提供科學(xué)依據(jù)，哈獸維科技術(shù)服務(wù)部檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室于2014—2017年期間共收到全國(guó)28個(gè)省市443個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的1 636份病料（淋巴結(jié)和腦組織），30個(gè)省市874個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的33 517份血清樣品。通過PCR及ELISA方法對(duì)偽狂犬病病原與野毒gE抗體進(jìn)行檢測(cè)與監(jiān)測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及分布

1.1.1 病原檢測(cè)樣品 樣品來源于全國(guó)28個(gè)省市443個(gè)豬場(chǎng)，樣品包括淋巴結(jié)和腦等組織共1 636份，通過調(diào)查了解豬場(chǎng)免疫背景和臨床發(fā)病情況以及剖檢典型發(fā)病豬取組織樣品，-20℃冷凍送檢。

1.1.2 血清樣品 樣品來自全國(guó)30個(gè)省（直轄市）874個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，共33 517份。通過豬前腔靜脈或耳緣靜脈現(xiàn)場(chǎng)采集后送檢實(shí)驗(yàn)室的方式來收集檢測(cè)樣品。

1.2 主要試劑和儀器

TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒[購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司]、MEM營(yíng)養(yǎng)液、DNA提取試劑盒（購(gòu)自天根生物科技有限公司）、TaqDNA聚合酶、dNTPs、EB、DEP水、瓊脂糖、DL 2 000 Marker。生物安全柜、分析天平、研磨器、高速離心機(jī)、迷你掌上離心機(jī)、渦旋振蕩器、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀、冰箱、微波爐、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標(biāo)儀等。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登陸的PRV的基因序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.4 樣品處理

1.4.1 核酸提取 按檢測(cè)需求分別對(duì)腦和淋巴結(jié)樣品混合，用研磨器充分研磨，利用MEM營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行10倍稀釋，然后利用DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸抽提。

1.4.2 待檢血清的制備 血清樣品室溫靜置2～6 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清置于滅菌EP管或小瓶?jī)?nèi)，編號(hào)。對(duì)于沒有條件分離血清的豬場(chǎng)，室溫靜置，讓其自然析出血清，盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。處理好的血清均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒核酸檢測(cè)

用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養(yǎng)液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94℃ 2 min；（94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min）× 35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 ELISA檢測(cè)

按照豬偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的操作說明進(jìn)行。

1.7 結(jié)果判定

1.7.1 PCR病原檢測(cè)結(jié)果判定 PRV陽性對(duì)照出現(xiàn)1 245 bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)1 245 bp擴(kuò)增帶為陽性，否則為陰性。

1.7.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果判定 陰性對(duì)照A（650）的平均值減去陽性對(duì)照A（650）的平均值必須大于或等于0.3，試驗(yàn)方能有效。如果S/N值（樣品/陰性對(duì)照比率）低于或等于0.60，樣品應(yīng)判定為PRV gE抗體陽性。如果S/N值大于0.60但小于或等于0.70，樣品應(yīng)重測(cè)。如果試驗(yàn)結(jié)果不變，間隔一定時(shí)間后重新采樣、檢測(cè)。如果S/N值大于0.70，樣品應(yīng)判定為PRV gE抗體陰性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1 2014年1月至2017年5月對(duì)28個(gè)省443個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)送檢的1 636份淋巴結(jié)和腦等組織樣品，進(jìn)行了PRV病原的檢測(cè)。結(jié)果顯示，2014年P(guān)RV陽性檢出率12.42%（41/330），2015年P(guān)RV陽性檢出率6.50%（24/369），2016年P(guān)RV陽性檢出率16.86%（100/593），2017年1—5月PRV陽性檢出率9.01%（31/344），2014年1月至2017年5月總體檢出率為11.98%（196/1 636）（如表2、圖1）。

表2 2014—2017年 PRV病原陽性率

圖1 2014—2017年P(guān)RV病原陽性率

2.1.2 病料樣品來自全國(guó)28個(gè)省市，其中黑龍江、遼寧、山東、福建、江西送檢占比相對(duì)較高，湖南、江蘇、青海等地PRV病原檢出率相對(duì)較高（表3）。如果按照地區(qū)統(tǒng)計(jì)，所有地區(qū)均存在不同程度的PRV野毒感染情況，其中西北和西南地區(qū)豬場(chǎng)的PRV病原陽性率較高（圖2）。

表3 病料來源及PRV病原陽性率

圖2 不同地區(qū)PRV gE病原陽性率和PRV gE抗體陽性率

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 應(yīng)用阻斷ELISA方法對(duì)2014年1月至2017年5月期間全國(guó)30個(gè)省市874個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的33 517份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果表明，PRV抗體陽性血清12 795份，總體抗體陽性率為38.17%；其中，2014年P(guān)RVgE抗體陽性率為26.70%（1721/6 446），2015年P(guān)RV gE抗體陽性率為38.07%（2 550/6 699），2016年P(guān)RV gE抗體陽性率為43.62%（5 722/13119），2017年1—5月PRV gE抗體陽性率為38.63%（2 802/7 253）（如表4，圖3）。

表4 2014—2017年P(guān)RV野毒抗體陽性率

圖3 2014—2017年P(guān)RV野毒抗體陽性率

2.2.2 血清樣品來自全國(guó)30個(gè)省市，其中廣東、遼寧、河北、北京送檢占比相對(duì)較高，河南、河北、天津、新疆等地PRV gE抗體陽性率相對(duì)較高（表5）。如果按照地區(qū)統(tǒng)計(jì)，華中和華北地區(qū)豬場(chǎng)的PRV gE抗體陽性率較高（圖2）。

表5 血清來源及PRV野毒抗體陽性率

3 討論

3.1 2014年1月至2017年5月通過對(duì)全國(guó)28個(gè)省市443個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的1 636份淋巴結(jié)和腦組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)PRV的樣品主要以發(fā)病豬腦為主，臨床上表現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀，如肌肉震顫、精神沉郁、口吐白沫等，以哺乳仔豬和保育豬發(fā)病為主。部分豬場(chǎng)暴發(fā)時(shí)以母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等，保育豬神經(jīng)癥狀和育成豬嚴(yán)重呼吸道病為典型臨床表現(xiàn)。剖檢后腦出血病變嚴(yán)重。選用合適的引物，采用PCR方法對(duì)PRV病原檢測(cè)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析得知，2014年P(guān)RV陽性檢出率12.42%（41/330），2015年P(guān)RV病原陽性檢出率下降為6.50%（24/369），2016年P(guān)RV病原陽性檢出率又有所上升，為16.86%（100/593），2017年1—5月PRV病原陽性檢出率9.01%（31/344），相比2016年有所下降。2014年1月至2017年5月總體病原檢出率為11.98%（196/1 636）。

3.2 2014年1月至2017年5月期間，對(duì)全國(guó)30個(gè)省市874個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)送檢的33 517份血清樣本通過ELISA方法進(jìn)行PRV gE抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示，2014年P(guān)RV gE抗體陽性率為26.70%（1 721/6 446），2015年P(guān)RV gE抗體陽性率上升為38.07%（2 550/ 6 699），2016年檢測(cè)PRV gE抗體陽性率繼續(xù)上升，達(dá)到43.62%（5 722/13 119），2017年1—5月PRV gE抗體陽性率略有下降，為38.63%（2 802/7 253），2014年1月至2017年5月總的PRV gE抗體陽性率為38.17%（12 795/33 517）。通過數(shù)據(jù)可以看出，我國(guó)豬場(chǎng)豬偽狂犬病野毒感染依然嚴(yán)重。

3.3 對(duì)不同地理分布豬場(chǎng)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，我國(guó)西北地區(qū)的偽狂犬病病原檢出率（25.00%）最高，其次為西南地區(qū)（16.44%）。而在PRV gE抗體檢測(cè)方面，華中地區(qū)（58.65%）和華北地區(qū)（51.46%）PRV gE抗體陽性率較高。不同地區(qū)檢出率的差異與區(qū)域內(nèi)豬場(chǎng)的疫苗防疫、飼養(yǎng)管理、生物安全等諸多因素有關(guān)。調(diào)查結(jié)果顯示檢測(cè)的874家豬場(chǎng)沒有偽狂犬病野毒gE抗體陰性場(chǎng)，對(duì)于豬偽狂犬病的防制甚至凈化，情況不容樂觀。

3.4 做好豬場(chǎng)偽狂犬病的控制與凈化包含疫苗免疫、生物安全和飼養(yǎng)管理等各個(gè)方面的工作。對(duì)于疫苗的免疫，針對(duì)如今的豬偽狂犬病流行情況，推薦種公豬/母豬1年普免3～4次，2頭份/頭，仔豬1～3日齡滴鼻1頭份/頭（PRV-gE抗體陰性的豬場(chǎng)可不滴鼻），45～55日齡二免2頭份/頭，90～100日齡三免2頭份/頭。由于存在種豬帶毒導(dǎo)致豬場(chǎng)暴發(fā)豬偽狂犬病，或者繼發(fā)其它疾病的危險(xiǎn)。因此，豬場(chǎng)要做好種豬場(chǎng)偽狂犬病的病原檢測(cè)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)。對(duì)于帶毒種豬要及時(shí)清除，凈化豬群。在疫苗免疫的同時(shí)，做好生物安全措施，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，才能很好地控制以及凈化豬偽狂犬病。

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0089-03

2017-07-03

牟 迪（1988-），男，吉林伊通人，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗技術(shù)服務(wù)工作.E-mail：281032446@qq.com