我國(guó)豬流行性腹瀉流行現(xiàn)狀分析及變異毒株鑒別檢測(cè)方法研究進(jìn)展

祖立闖，謝金文，王金良，李 峰，沈志強(qiáng)，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

我國(guó)豬流行性腹瀉流行現(xiàn)狀分析及變異毒株鑒別檢測(cè)方法研究進(jìn)展

祖立闖1，謝金文2，王金良2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的以仔豬嘔吐、腹瀉、脫水、死亡為主要特征的一種急性、高度接觸性、病毒性腸道傳染病[1-2]。該病于1971年在英國(guó)被首次報(bào)道，隨后在日本、德國(guó)和比利時(shí)等許多國(guó)家均有報(bào)道，我國(guó)于1983年首次發(fā)現(xiàn)該病[3]，隨后開始在我國(guó)呈散發(fā)性、區(qū)域性流行，其流行和危害程度得到了一定的控制。但自2010年末開始，我國(guó)豬場(chǎng)陸續(xù)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的以新生仔豬嚴(yán)重嘔吐、水樣腹瀉、腸道出血和高病死率為主要特征的“頑固性腹瀉”疫情[4-5]，引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注，甚至普遍認(rèn)為變異型PED將是未來(lái)幾年內(nèi)危害仔豬最為嚴(yán)重的腹瀉病之一。為全面掌握目前我國(guó)豬群中PED流行現(xiàn)狀，筆者查閱2010年變異毒株開始流行以來(lái)我國(guó)在PEDV毒株分離鑒定、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、遺傳變異等方面研究資料，整理與分析出了目前我國(guó)PEDV的流行現(xiàn)狀與流行特點(diǎn)，并綜述了PEDV變異株的鑒別檢測(cè)方法，對(duì)目前我國(guó)PED的防控具有一定的參考價(jià)值。

1 病毒分離鑒定情況

如表1所示，對(duì)2010年至今國(guó)內(nèi)PEDV野毒株的分離鑒定情況進(jìn)行匯總分析，呈現(xiàn)出以下幾個(gè)顯著特點(diǎn)。

1.1 分離鑒定率高

2011—2016年，6年時(shí)間里國(guó)內(nèi)共分離鑒定出PEDV野毒株高達(dá)38株，平均6.33株/年，病毒分離鑒定率較高。

1.2 變異毒株成為優(yōu)勢(shì)毒株

在38株P(guān)EDV野毒株中有28株完成了毒株類型的鑒定，而這完成了毒株類型鑒定的28株均為變異毒株，變異株已成為當(dāng)前PEDV的流行優(yōu)勢(shì)毒株。

1.3 分離范圍廣

38株P(guān)EDV野毒株覆蓋了福建、江蘇、四川、上海、廣東、河北、山東、安徽、云南、新疆、內(nèi)蒙古、吉林、青海、貴州、北京、湖北、甘肅、山西、浙江、陜西、江西等21個(gè)省市，呈全國(guó)性流行。

1.4 由南向北、由沿海向內(nèi)陸逐步流行

病毒開始由福建、江蘇、四川、廣東向安徽、上海、山東、河北流行，隨后逐步流行至北京、吉林、內(nèi)蒙古。

表1 2010年以來(lái)PEDV野毒株分離鑒定情況匯總

2 流行病學(xué)監(jiān)測(cè)情況

隨著PEDV變異毒株的日益流行，以及我國(guó)對(duì)PEDV感染的逐步重視，我國(guó)研究學(xué)者對(duì)不同地區(qū)的PEDV感染情況進(jìn)行了大量的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。如表2所示，自2010年以來(lái)，我國(guó)豬場(chǎng)PEDV陽(yáng)性感染率一直居高不下，區(qū)域性流行特點(diǎn)顯著，如2012—2013年四川的感染率高達(dá)86.67%，2014—2015年山西的感染率達(dá)73.26%，2015—2016年黑龍江、吉林、遼寧等3省的感染率達(dá)74.62%。PEDV在我國(guó)豬群中已廣泛流行，且在個(gè)別地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴(yán)峻，應(yīng)加強(qiáng)重視。

表2 2010—2017年P(guān)EDV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)情況匯總

3 遺傳變異分析情況

對(duì)病毒進(jìn)行遺傳變異分析可以從分子水平發(fā)現(xiàn)PEDV流行病毒株之間的差異以及遺傳和衍化規(guī)律，明確PEDV不同時(shí)間、不同地區(qū)流行毒株的基因亞型與變異情況，能夠?yàn)閷ふ也《镜膫鞑ヂ窂揭约盀椴煌貐^(qū)因地制宜的制定防控措施提供指導(dǎo)。吳旺霞等[5]對(duì)浙江省2011—2016年P(guān)EDV流行毒株與疫苗株的S基因和ORF3基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序，并對(duì)其序列變異、遺傳進(jìn)化和抗原位點(diǎn)進(jìn)行分析?；蜃儺惙治鼋Y(jié)果顯示，與國(guó)內(nèi)疫苗株CV777相比，流行毒株S基因存在15個(gè)核苷酸插入和6個(gè)核苷酸缺失，導(dǎo)致氨基酸序列存在5個(gè)氨基酸插入（58QGVN61和140N）和2個(gè)氨基酸缺失（163DI164），且在主要突變區(qū)S1區(qū)的2個(gè)中和表位（499-638和764-771 aa）有8處氨基酸突變，且ORF3基因有7處氨基酸變異。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，流行毒株S基因與亞洲主要疫苗株（國(guó)內(nèi)疫苗株CV777和韓國(guó)弱毒疫苗株DR13）的同源性僅為93.3%～94.9%，而與2011—2016年中國(guó)流行株（BJ-2011和Hu N）的同源性高達(dá)97.8%～99.9%，表明PEDV已呈現(xiàn)較大程度的遺傳變異。王飛等[53]對(duì)2014—2015年分離的9株P(guān)EDV毒株的S基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，并將其分別與疫苗株、中國(guó)2010年前經(jīng)典毒株、中國(guó)2010—2013年出現(xiàn)的毒株及韓國(guó)、美國(guó)近年來(lái)流行毒株進(jìn)行S基因序列比對(duì)、分析。結(jié)果顯示，9株P(guān)EDV S基因核苷酸同源性為98.4%～99.5%，與疫苗株和中國(guó)2010年前經(jīng)典毒株相比核苷酸同源性為93.4%～96.2%，與中國(guó)、韓國(guó)、美國(guó)近年來(lái)暴發(fā)的毒株相比核苷酸同源性為97.4%～99.2%，現(xiàn)階段PEDV S基因已發(fā)生較大變異，存在高度相似的缺失，插入和變異，且在中和表位區(qū)域存在多處變異。遺傳進(jìn)化樹顯示，我國(guó)常用的疫苗毒株CV777處于G1組，這9株毒株S基因均位于G2組，說(shuō)明我國(guó)當(dāng)前流行毒株與疫苗株和早期經(jīng)典毒株的親緣性相去較遠(yuǎn)。表明我國(guó)PEDV流行毒株以變異株為主，變異毒株的抗原位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)和跨膜螺旋較以往的疫苗株發(fā)生了較大變異，提示PEDV在近年呈現(xiàn)快速變異和進(jìn)化的趨勢(shì)，常規(guī)疫苗有可能無(wú)法提供良好的免疫保護(hù)，需要開發(fā)新型疫苗以及制定更具針對(duì)性的防控措施來(lái)控制PEDV的流行與暴發(fā)。

4 變異株鑒別檢測(cè)方法

通過(guò)對(duì)PEDV流行毒株的分離鑒定以及遺傳變異分析表明PEDV變異毒株目前是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)流行毒株，且其感染率較高。PEDV變異毒株感染應(yīng)該是造成我國(guó)目前PED疫苗免疫失敗和仔豬高致死率的主要原因，亟待建立可以準(zhǔn)確區(qū)分PEDV變異毒株的鑒別診斷方法。對(duì)于PEDV變異毒株的鑒別診斷，主要依靠基于PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、疫苗毒株核酸序列差異的分子生物學(xué)方法和基于高特異性單克隆抗體的血清學(xué)方法。本文綜述了PEDV變異株的鑒別診斷方法，以期對(duì)PEDV變異株感染進(jìn)行早期快速、準(zhǔn)確診斷，淘汰凈化變異毒株感染豬，為制定PED綜合防控措施提供依據(jù)。

4.1 RT-PCR方法

RT-PCR首先以病毒的基因組RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能檢測(cè)到病原體特有的核苷酸序列，是疾病病原檢測(cè)中最常用的一種分子生物學(xué)診斷技術(shù)。多重RT-PCR方法是在單一RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，可在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，可在一次PCR反應(yīng)過(guò)程中檢測(cè)到多個(gè)致病原。秦毅斌等[54]根據(jù)Gen－Bank中PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因，設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性擴(kuò)增引物，通過(guò)目的片段的數(shù)量和片段大小來(lái)判斷PEDV的毒株類型，建立了檢測(cè)不同PEDV毒株類型的雙重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法，該方法中PEDV變異毒株能同時(shí)擴(kuò)增出234 bp和826 bp的2條目的條帶，PEDV經(jīng)典毒株只能擴(kuò)增出1條234 bp的目的條帶，弱毒疫苗株只能擴(kuò)增出1條185 bp的目的條帶，該方法檢測(cè)A群豬輪狀病毒（PRoVA）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬嵴病毒（PKV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)環(huán)病毒（TTV）均為陰性，能檢測(cè)到的最低核酸濃度為2.3×10-4ng/μL，該方法檢測(cè)91份臨床腹瀉樣品，變異毒株陽(yáng)性感染率為62.64%（57/91），經(jīng)典毒株陽(yáng)性感染率為3.30%（3/91），弱毒疫苗株陽(yáng)性率為4.40%（4/91）。該多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法能特異性區(qū)分PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株和弱毒疫苗株，可用于PEDV經(jīng)典株、變異株和疫苗株的臨床快速鑒別檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。施開創(chuàng)等[55]針對(duì)PEDV S和ORF3基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分PEDV經(jīng)典株、變異株、疫苗株的三重RT-PCR方法，該方法中能同時(shí)擴(kuò)增429 bp和198 bp者為經(jīng)典株，能同時(shí)擴(kuò)增274 bp和198 bp者為變異株，能同時(shí)擴(kuò)增429 bp和148 bp者為疫苗株。該方法利用3對(duì)特異性引物實(shí)現(xiàn)了在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中鑒別檢測(cè)PEDV 3種不同毒株的目標(biāo)，為PEDV變異毒株的鑒別診斷與流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)手段。PCR方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)迅速、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，特別適合具有一般試驗(yàn)條件的基層實(shí)驗(yàn)室使用，將具有廣闊的開發(fā)與推廣應(yīng)用前景。

4.2 血清學(xué)方法

PEDV變異毒株、經(jīng)典毒株、疫苗株之間存在高度序列同源性和血清學(xué)交叉反應(yīng)性，因而難以用普通的血清學(xué)方法將PEDV變異毒株區(qū)分開。單克隆體抗體具有高度的特異性和敏感性，能夠識(shí)別病毒抗原結(jié)構(gòu)的微小差異，因此，獲得PEDV變異毒株的特異性單克隆體抗體成為建立區(qū)分PEDV變異毒株血清學(xué)診斷方法的關(guān)鍵。雷喜梅等[56]以純化的PEDV變異株（CH/ZMDZY/11）S蛋白N端高變區(qū)（22-380 aa）重組蛋白為抗原免疫BALB/C小鼠，以純化CH/ ZMDZY/11全病毒及帶His標(biāo)簽的重組蛋白分別為篩選抗原，利用淋巴瘤雜交技術(shù)獲得了一株穩(wěn)定分泌抗S蛋白特異性單克隆抗體細(xì)胞株，該單克隆抗體誘生小鼠產(chǎn)生的腹水抗體效價(jià)為1∶3 200，免疫球蛋白類型為IgM。ELISA檢測(cè)該單克隆抗體與PEDV變異毒株與疫苗株的反應(yīng)顯著差異，可區(qū)分變異毒株和疫苗毒株，有望成為PEDV變異株抗原檢測(cè)的特異性抗體。李加飛等[57]將含有PEDV變異株S1基因的1個(gè)抗原表位（83-276 aa）的重組蛋白免疫BALB/C小鼠，成功制備了2株能夠產(chǎn)生抗PEDV S蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為1E5和5B7。間接免疫熒光試驗(yàn)表明，5B7單克隆抗體可以識(shí)別天然狀態(tài)下的PEDV顆粒，與變異株和經(jīng)典毒株均發(fā)生反應(yīng)，而1E5單克隆抗體只與變異株發(fā)生特異性反應(yīng)，與經(jīng)典毒株不反應(yīng)。表明所制備的抗PEDV S蛋白的1E5單克隆抗體能夠有效檢測(cè)和區(qū)分PEDV變異株和經(jīng)典毒株，且對(duì)病原檢測(cè)具有較強(qiáng)的特異性，為研制基于單克隆抗體的PEDV變異毒株血清學(xué)鑒別診斷方法奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

5 結(jié)語(yǔ)

2010 年以來(lái)，我國(guó)PED流行現(xiàn)狀分析表明，PEDV變異毒株目前是我國(guó)PEDV流行的優(yōu)勢(shì)毒株，且其區(qū)域性流行特點(diǎn)顯著，部分地區(qū)感染率較高，感染情況比較嚴(yán)峻，變異毒株在我國(guó)豬群中的流行已不容忽視，應(yīng)加強(qiáng)重視。針對(duì)PEDV變異毒株鑒別診斷方法研究已經(jīng)有了突破性進(jìn)展，研究學(xué)者已陸續(xù)建立了能夠鑒別診斷PEDV變異株的RT-PCR方法，以及研制了針對(duì)PEDV變異毒株的單克隆抗體，這都將大幅有助于我國(guó)對(duì)PEDV變異毒株的鑒別診斷和有效防控。但RT-PCR方法敏感性有限，且擴(kuò)增后電泳檢測(cè)需要使用溴化乙錠（EB），對(duì)試驗(yàn)人員身體健康和生態(tài)環(huán)境均造成潛在威脅；具有高度特異性、能夠區(qū)分PEDV變異毒株的單克隆抗體只是建立PEDV變異毒株血清學(xué)鑒別檢測(cè)方法的物質(zhì)基礎(chǔ)，故對(duì)于PEDV變異毒株的鑒別檢測(cè)方法仍需進(jìn)一步完善。相信隨著PEDV變異毒株病原學(xué)和致病機(jī)制研究的不斷深入，高敏感性、高特異性PEDV變異毒株單克隆抗體的不斷獲得，以及分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)尤其是熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)在PEDV檢測(cè)中的不斷開發(fā)應(yīng)用，PEDV變異毒株熒光定量RT-PCR鑒別檢測(cè)方法和ELISA鑒別檢測(cè)方法將會(huì)陸續(xù)問(wèn)世，進(jìn)而為PEDV變異毒株的鑒別檢測(cè)提供敏感性更高、特異性更強(qiáng)、全封閉反應(yīng)、定量準(zhǔn)確、不需要電泳的新型分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)和操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、敏感、特異、高通量的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)PEDV變異毒株的準(zhǔn)確、快速、鑒別診斷，逐步實(shí)現(xiàn)PEDV變異毒株區(qū)域凈化，并最終達(dá)到全國(guó)凈化的目標(biāo)。

[1]劉政龍，王金良，沈志強(qiáng).豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（9）：2506-2511.

[2]張志，程小娜，樊雅婷，等.豬流行性腹瀉病毒流行毒株的致病性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（3）：170-172.

[3]宣華，邢德坤，王殿瀛，等.應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒的研究[J].獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1984，4（3）：202-208.

[4]施標(biāo)，董世娟，朱于敏，等.中國(guó)豬流行性腹瀉病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（20）：4362-4369.

[5]吳旺霞，王一成，吳潤(rùn)，等.2011—2016年浙江省豬流行性腹瀉病毒S基因與ORF3基因遺傳進(jìn)化分析 [J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29（3）：380-388.

[6]陳如敬，吳學(xué)敏，車勇良，等.豬流行性腹瀉病毒FJ-11A株的分離與ORF3基因序列分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（6）：947-951.

[7]于曉明，陳瑾，侯立婷，等.豬流行性腹瀉病毒TX株的分離鑒定及毒力分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015（S1）：342-347.

[8]蔣梅，王印，楊澤曉，等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其M蛋白截段基因編碼氨基酸的生物學(xué)分析 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（2）：195-200.

[9]古洪浪，鄧勝朝，崔進(jìn)，等.豬流行性腹瀉病毒株的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（11）：22-25.

[10]田野，蘇丹萍，蔣偉，等.華南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其S基因抗原表位片段的遺傳變異分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：3-5.

[11]郝偉偉，邱文英，徐靜，等.豬流行性腹瀉病毒SZ株的分離與鑒定[J].福建畜牧獸醫(yī)，2012，34（6）：1-3.

[12]洪聲安.豬流行性腹瀉病病毒的分離鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2012，14（5）：20-21.

[13]肖賢，陳備娟，張風(fēng)時(shí)，等.上海地區(qū)新發(fā)豬流行性腹瀉病毒的鑒定及分析[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2013，31（1）：61-66.

[14]莊金秋，王金良，梅建國(guó)，等.豬流行性腹瀉病毒SDbz株的分離與鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（2）：122-126.

[15]朱衛(wèi)霞，郭海勇，陳立功，等.豬流行性腹瀉病毒HBMC2012株的分離鑒定及其致病性研究 [J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（12）：934-938.

[16]張小峰，涂玉蓉.2株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及ORF3基因的克隆與序列分析[J].養(yǎng)豬，2014（3）：98-101.

[17]何玲，唐滿華，梁桂益，等.豬流行性腹瀉病毒ShT株的分離及傳代培養(yǎng)[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47（3）：1-3.

[18]吳美洲，陳芳洲，李中華，等.豬流行性腹瀉病毒變異株（CH/ YNKM-8/2013）的分離鑒定和全基因組序列分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（4）：93-99.

[19]任玉鵬，陳弟詩(shī)，顏其貴，等.豬流行性腹瀉病毒的RT-PCR檢測(cè)及DY株的分離鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43（7）：672-677.

[20]劉小蘭，賀筍，陳蘭玲，等.豬流行性腹瀉病毒（XJ-DB2）株的分離鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016，52（1）：17-19.

[21]朱俊，高又文，張杰，等.豬流行性腹瀉病毒GD-A株的分離鑒定及S基因序列分析[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（4）：21-25.

[22]王康，王鑫，楊德強(qiáng)，等.豬流行性腹瀉病毒HeB10/2014株的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（4）：284-288.

[23]王飛，陳小芬，焦臣鵬，等.豬流行性腹瀉病毒SC-2014株的分離鑒定及繁殖條件的優(yōu)化[J].豬業(yè)科學(xué)，2016，33（5）：74-76.

[24]潘孝成，趙瑞宏，沈?qū)W懷，等.豬流行性腹瀉病毒SD株的分離與鑒定[J].養(yǎng)豬，2015（4）：102-104.

[25]張志，程小娜，樊雅婷，等.豬流行性腹瀉病毒變異株的鑒定和分子特征分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（7）：1654-1660.

[26]李亞龍，黃巖，吳艷麗，等.豬流行性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（9）：160-162.

[27]吳衛(wèi)杰，王強(qiáng)，丁峰，等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及其S基因序列分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（11）：165-169.

[28]張生祥，馬文瑞，包守泰，等.一例豬流行性腹瀉病毒的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（20）：102-103.

[29]代振江，梁海英，曾智勇，等.豬流行性腹瀉病毒的分離及其M基因的生物信息學(xué)分析[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：28-30.

[30]劉希紅，孟慶玉，王建舫，等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及N基因序列分析[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，31（4）：46-51.

[31]桂銳，郭銳，田永祥，等.豬流行性腹瀉病毒湖北株的分離鑒定及其S1基因進(jìn)化分析 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（6）：1506-1510.

[32]王貴華，于萍萍，滿坤，等.五株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及序列分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2016，50（7）：13-19.

[33]孫豐廷，史紅麗，高小聰，等.一株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定和遺傳進(jìn)化分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2016，50（10）：10-14.

[34]王淞，陳智，焦安琪，等.豬流行性腹瀉病毒變異株的分離鑒定及其S基因序列分析[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，48（2）：174-180.

[35]代洪波，岳豐雄，徐宏軍，等.豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗免疫保護(hù)效果研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2017，38（1）：50-55.

[36]杜曉莉，王一成，吳潤(rùn)，等.2010—2013年浙江省豬流行性腹瀉病毒臨床檢測(cè)及PEDV-S基因型分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（3）：581-587．

[37]師?？＃w津，張小敏，等.2011-2012年江蘇和安徽兩省部分豬場(chǎng)主要疫病流行病學(xué)調(diào)查 [J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（5）：69-71.

[38]盧冰霞，秦毅斌，何穎，等.2011年-2014年廣西豬流行性腹瀉病毒檢測(cè)及其M基因的序列分析 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42（3）：549-557.

[39]林裕勝，王隆柏，吳學(xué)敏，等.2012-2013年福建省豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].福建畜牧獸醫(yī)，2013，35（6）：16-18.

[40]杜鵑，韋海濤，周德剛，等.北京地區(qū)豬主要病毒性腹瀉疾病的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（3）：24-26.

[41]林裕勝，王隆柏，吳秋玉，等.福建省豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（35）：83-86.

[42]單玉平，王益軍，孫軍防，等.連云港市規(guī)模豬場(chǎng)豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2014，46（9）：96-97.

[43]陽(yáng)酉萍，黃小波，曹三杰，等.四川部分地區(qū)豬流行性腹瀉的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（5）：704-710.

[44]趙振鵬，楊振，林偉東，等.江蘇省豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（19）：125-127.

[45]薛瑞雪，田野，田夫林，等.山東省部分地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37（4）：254-257.

[46]胡興義，張雙翔，金志強(qiáng)，等.貴州地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（7）：542-545.

[47]常鐵城，陳建飛，馮力，等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38（4）：335-338.

[48]白小磊，崔進(jìn)，崔甜甜，等.廣東部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（11）：1823-1828.

[49]王娟萍，劉文俊，米瑞娟，等.山西省豬流行性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2016，48（9）：116-118.

[50]王瑤，吳義才，王珊，等.2014—2015年重慶市豬流行性腹瀉血清流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].養(yǎng)豬，2016（4）：99-100.

[51]王栓群，孫瑞芹，劉燕玲，等.華南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（6）：97-104.

[52]朱子健，閆麗輝，鞠妍，等.2015—2016年我國(guó)東北地區(qū)豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，39（5）：356-360.

[53]王飛，陳小芬，蘇丹萍，等.2014—2015年我國(guó)部分省份豬流行性腹瀉病毒S基因的遺傳變異分析 [J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（9）：1484-1488.

[54]秦毅斌，盧冰霞，段群棚，等.豬流行性腹瀉病毒變異毒株、經(jīng)典毒株及弱毒疫苗株多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，29（11）：2746-2751.

[55]施開創(chuàng)，龍飛翔，粟艷瓊，等.豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株和疫苗株多重RT-PCR鑒別檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2017，47（1）：1-8.

[56]雷喜梅，陳靜，楊盼盼，等.分泌抗豬流行性腹瀉病毒中國(guó)變異株S蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（2）：206-210.

[57]李加飛，陳智，孫文博，等.山東地區(qū)豬流行性腹瀉病毒遺傳變異分析及其單克隆抗體的制備[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，37（5）：769-775.

（編輯：郭玉翠）

S858.285.3

A

1002-1957(2017)04-0117-04

2017-06-29

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2016CM35）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-08-17）作者簡(jiǎn)介：祖立闖（1981-），男，黑龍江賓縣人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究工作.E-mail：zulichuang2008@126.com