雞肉中假單胞菌的近紅外光譜快速識別

陳全勝 王名星 郭志明 范 沖 孫 浩 趙杰文

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮(zhèn)江 212013)

雞肉中假單胞菌的近紅外光譜快速識別

陳全勝 王名星 郭志明 范 沖 孫 浩 趙杰文

(江蘇大學食品與生物工程學院， 鎮(zhèn)江 212013)

假單胞菌是雞肉腐敗最主要的致腐菌，為了快速識別雞肉中的假單胞菌，首先從腐敗雞肉中分離并篩選出致腐菌，進一步利用聚合酶鏈反應技術對目標菌株進行生物學鑒別(分別為蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、莓實假單胞菌和熒光假單胞菌)；配置鑒定的4種假單胞菌和等體積混合的4種假單胞菌菌液，采集菌液近紅外透射光譜信息；然后運用標準正態(tài)變量變換對光譜進行預處理，利用聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法篩選出特征波段；最后有比較地運用K最近鄰法、最小二乘支持向量機和反向傳播人工神經網絡建立5種假單胞菌菌液的近紅外光譜分類識別模型。其中反向傳播人工神經網絡模型預測效果最佳，其訓練集和預測集的識別率分別為99.17%和95.00%。研究結果表明，近紅外光譜結合反向傳播人工神經網絡可以快速識別雞肉中的假單胞菌。

雞肉； 近紅外光譜； 假單胞菌； 主成分分析； 人工神經網絡

引言

雞肉在屠宰、包裝、運輸過程中極易受微生物的污染，使雞肉腐敗變質，破壞雞肉的食用安全以及營養(yǎng)價值[1]。假單胞菌是導致雞肉腐敗的最主要致腐菌，常用來作為肉制品有氧和真空包裝產品的加工衛(wèi)生、保存質量和貨架期預測的指示菌種[2-3]。因此研究監(jiān)控雞肉中致腐假單胞菌的組成及其動態(tài)變化情況，對雞肉食用安全的保障以及營養(yǎng)價值的發(fā)揮具有實際意義。

微生物鑒別方法主要有傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法[4]、分子生物學技術鑒定法[5]和免疫學分析技術[6]等。傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和免疫學技術鑒別法前處理繁瑣、鑒定結果準確率低，且鑒別的菌株種類有限；分子生物學技術鑒定法雖可準確鑒別相應菌株，但操作繁瑣、試劑昂貴、測定過程耗時長，更難以實現菌種的快速鑒別及判斷[7]。

近紅外光譜分析技術是一種通過光譜信息反映物質內部成分的物理測試技術，具有分析成本低、操作簡單、速度快、樣本無需前處理、樣本無損傷等特點，已被廣泛用于食品[8]、農產品[9]的定量分析和定性分類。在微生物檢測方面的應用也越來越廣泛[10-14]。本文利用聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)方法對雞肉中分離出的致腐目標菌株進行分子生物學鑒別后，采集菌體擴大培養(yǎng)得到的單菌種菌懸液以及混合菌懸液的近紅外透射光譜信息，并結合聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘法篩選出高相關性的特征波段，然后比較運用K最近鄰法(K-nearest neighbor， KNN)、最小二乘支持向量機 (Support vector machine，SVM)和反向傳播人工神經網絡 (Back propagation-artificial neural network，BP-ANN) 建立5種假單胞菌的近紅外光譜分類識別模型，以期得到一種可對雞肉中致腐假單胞菌快速分類識別的方法。

1 材料與方法

1.1 雞肉中假單胞菌分離篩選

1.1.1 雞肉樣品準備

實驗所用的雞肉均購于江蘇省鎮(zhèn)江市歐尚超市肉制品專柜，均為新鮮雞胸脯肉。購買后立即封裝于滅菌樣品袋中，運回實驗室后置于4℃冰箱保存。

1.1.2 雞肉致腐菌篩選

首先用已殺菌的剪刀從腐敗冷卻雞肉表面取樣10 g，剪碎后放入裝有玻璃珠和90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，封口后置于搖床120 r/min振搖30 min制成菌懸液。將菌懸液逐級進行10倍的稀釋，選取3個合適稀釋度(10-8～10-6)的菌液，各取100 μL涂布于CFC瓊脂選擇培養(yǎng)基[15]的平板上適溫培養(yǎng)，每個稀釋度做3個重復。然后挑取菌落典型特征不同的單菌落，進行平板劃線分離2次，得到純化的單菌落，轉接于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基斜面保存待用。

1.1.3 雞肉致腐菌生物學鑒定

采用PCR技術對篩選的菌株進行16S rRNA擴增測定。首先取培養(yǎng)12 h的單菌落于30 μL無菌雙蒸水中制成菌懸液，置于PCR儀中100℃煮沸10 min破壁制得模板DNA。采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1541R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)擴增菌株的16S rRNA基因；然后以模板DNA 2 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上游引物27F(10.4 nmol/L)1 μL、下游引物1541R (9.9 nmol/L)1 μL和無菌雙蒸水 8.5 μL作為25 μL的PCR反應體系；設置PCR參數為95℃預變性5 min，95℃變性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸90 s(重復上述3個步驟35個循環(huán))，延伸72℃、10 min，最后10℃冷卻5 min；再用1×TAE配制1%的瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR擴增產物與定量的上樣緩沖液混合后進行瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳時間30 min；同時用凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳圖譜；最后將PCR擴增產物送至北京諾賽基因有限公司進行測序，登錄美國國立生物技術信息中心 (http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，所得序列與數據庫已知序列進行比對，獲得相似性99%以上的菌株序列，使用MEGA 5.0軟件構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2 假單胞菌菌液近紅外光譜采集

1.2.1 菌液樣品準備

將保藏備用的4種假單胞菌單菌落挑取出來，分別溶于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase soy broth, TSB) 中30℃培養(yǎng)12 h，分別取100 μL均勻菌液40管5 mL TSB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)12 h(達到細菌生長的穩(wěn)定期，菌體濃度為107CFU/mL)得到160個樣本；考慮到在實際雞肉樣本致腐菌檢測過程中，不僅存在單一的一種假單胞菌，而通常是多種類別假單胞菌同時存在，實驗分別將4種細菌等體積混合的菌液100 μL加入到40管5 mL TSB培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)作為第5種假單胞菌；由此共制得200個樣本。

1.2.2 菌液光譜采集和儀器參數設置

采用Antaris II型傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Fisher公司)進行實驗。光譜采集波數范圍4 000～10 000 cm-1，波數間隔為3.856 cm-1，含有1 557個變量。掃描次數16次，分辨率8 cm-1。實驗選用透射模式，以儀器內置背景為參比，采用儀器標配的光程為5 mm、容量約1 mL的標準管為樣品池。在實驗過程中，保持室溫25℃、相對濕度60%。每個菌液樣本分裝于4個標準管，平行采集光譜，4個光譜數據的均值作為該樣本對應的原始光譜數據。每種菌液配置40個樣本，經傅里葉變換近紅外測定后，總共得到200個樣本的光譜數據。數據處理采用Matlab R2009b(美國Mathworks公司)軟件完成。

1.3 光譜數據預處理

原始光譜數據存在干擾信息，如各種儀器噪聲、樣品背景以及雜散信號等，這些干擾信息對建立穩(wěn)定可靠的模型會有很大的影響；標準正態(tài)變量變換(Standardized normal variable transformation, SNV)、多元散射校正、標準分數校正、一階導數以及二階導數等方法可對原始光譜進行預處理，期望減弱甚至消除這些干擾信息。原始光譜有1 557個變量，其中存在與待測樣品無關的物質信息，比如菌液的大量水分子和大量有機成分的含氫基團(如O—H、C—H、N—H等)在近紅外光譜區(qū)產生的各級倍頻和合頻的吸收；這些非相關物質信息的光譜區(qū)間導致建模過程繁瑣、計算量大，也會導致模型的穩(wěn)定性和魯棒性不好。采用聯(lián)合偏最小二乘法(Synergy interval PLS，SiPLS)篩選變量，SiPLS的基本原則是將整個光譜劃分成若干較小的等距區(qū)間，然后將局部模型精度較高的2～4個子區(qū)間聯(lián)合起來預測樣本品質指標，利用交互驗證均方根誤差(Root mean square error of cross validation, RMSECV)來評價聯(lián)合區(qū)間的預測能力，RMSECV最小時為最佳的區(qū)間組合，根據結果提取出區(qū)間的全部變量，完成光譜變量的篩選[17]，剔除那些噪聲較大和非相關的光譜區(qū)域，篩選出高度相關的特定光譜區(qū)間和具有代表的有效變量；期望模型計算得到簡化，建立預測能力強、穩(wěn)健性好的識別模型。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定結果

凝膠成像系統(tǒng)拍攝記錄的電泳圖譜如圖1所示，可見4種篩選得到的致腐菌均得到了1.5 kb左右的條帶，于是將PCR擴增產物進行進一步的測序；待測菌株序列與NCBI中GenBank數據庫已知序列的比對，利用同源性在99%以上的菌株序列與目標菌株構建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出：P9與蓋氏假單胞菌(PseudomonasgessardiiIHBB 9179)親緣關系最近，P8與嗜冷假單胞菌(Pseudomonaspsychrophilastrain Den-03) 親緣關系最近，S2與莓實假單胞菌(Pseudomonasfragistrain PF04) 親緣關系最近，T3與熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescensstrain PF01)親緣關系最近。

圖1 4個菌株的16S rRNA PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Electropherogram of PCR amplification products of 16S rRNA

圖2 基于16S rRNA序列同源性的4株致腐菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of four strains based on 16S rRNA gene sequences

2.2 特征波段篩選結果

2.2.1 光譜預處理

5種假單胞菌的原始光譜數據如圖3a所示，可以看出假單胞菌光譜透射率具有相同的趨勢，而且相同的波數下吸收度不同，表明通過近紅外透射光譜信息能有效對菌株進行定性識別[18]。由于環(huán)境、儀器所帶來的噪聲以及菌液分子不斷運動的影響，所采集的光譜數據摻雜了一些無關信息，若直接用原始數據建模會降低模型的預測效率，影響模型的準確性和穩(wěn)定性。為了減少近紅外光譜隨機噪聲的不良影響，使用多種預處理方法對原始光譜進行預處理。經反復比較，發(fā)現使用SNV的處理效果最佳。圖3b為經過SNV預處理后的光譜，有效消除了光譜的背景和噪聲干擾。

圖3 5種假單胞菌的平均近紅外光譜及SNV預處理后的近紅外光譜Fig.3 Average original spectra and spectra processed by SNV of five Pseudomonas spp.

2.2.2 特征波段篩選

光譜數據變量篩選的結果如圖4所示，表明將全光譜數據劃分成16個子區(qū)間，主成分數為7時，聯(lián)合[1 5 8 9]4個子區(qū)間，獲得的模型最佳，RMSECV為0.19。[1 5 8 9]特征光譜區(qū)間所對應的波數區(qū)間為3 999.64～4 597.46 cm-1，6 406.37～7 004.19 cm-1，8 211.41～8 805.38 cm-1，8 809.24～9 403.20 cm-1，共622個變量。篩選的特征光譜區(qū)間中包含了假單胞菌細胞中核酸、蛋白質、脂肪和糖類等大分子物質含量、構型和構象等信息，可以很好地反映假單胞菌的特征性吸收，提高模型的穩(wěn)定性和準確性。

圖4 聯(lián)合區(qū)間偏最小二乘模型選擇的最佳子區(qū)間[1 5 8 9]Fig.4 Optimal spectral regions [1 5 8 9] selected by SiPLS

2.3 識別模型

2.3.1 主成分聚類分析

主成分分析是在盡量不丟失原特征變量的信息前提下，通過正交變換將可能存在相關性的變量轉換為一組線性不相關的變量(主成分)，使主成分盡可能多地表征原變量的數據特征，實現數據降維的多元統(tǒng)計方法[19]。研究采用主成分分析對原始光譜數據中的1 557個變量進行數據降維壓縮，去除光譜中的重疊信息以及與菌液內部化學成分不相關的信息。圖5為5種菌液的三維主成分得分圖。

圖5 三維主成分得分圖Fig.5 Three-dimensional projection of PCA results

圖5表明，主成分分析聚類效果顯著，蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、熒光假單胞菌都能很好地聚類分開；莓實假單胞菌分別與蓋氏假單胞菌以及嗜冷假單胞菌有重疊，原因可能是這3種菌在液體生存條件下內部細胞核酸、蛋白質、脂肪較熒光假單胞菌更為類似；混合生長的假單胞菌菌液集合了所有的4種假單胞菌的化學物質和代謝成分，其中與蓋氏假單胞菌的重疊最多，原因是蓋氏假單胞菌的核酸、蛋白質、脂肪含量較其他更高；還有可能是前3個主成分不能完全代表原始光譜數據的信息，需要進一步利用模式識別算法對其進行分類。如圖5所示，前3個主成分累計可信度已經達到99%，即前3個主成分基本能反映原始光譜數據的主要信息。

主成分因子數對模型的訓練和預測都有一定的影響，研究依次選取前10個主成分對應的光譜數據為輸入變量(幾乎代表原始變量)，建立分類識別模型。實驗共采集200個樣本的近紅外光譜數據，采用隨機分組的方式將全部數據分為120個訓練集樣本，80個預測集樣本。

2.3.2 KNN識別模型

K最近鄰法是一種典型的基于類比的算法，基本思想是給定一個樣本，如果它與k個樣本距離最近，則判別這個樣本與k個樣本為一類[20]。研究通過優(yōu)化主成分數和k值，建立KNN識別模型，預測集識別率作為優(yōu)化結果的評判標準。

如圖6b所示，當主成分數為7，k為9時，KNN最佳預測集識別率為65.63%。當主成分數為8，參數k為7時，識別效果最優(yōu)，訓練集和預測集識別率分別為65.00%和63.75%。結果表明，KNN模型并不能很好地對5種假單胞菌進行分類識別。原因可能是5種假單胞菌的近紅外光譜數據并不是線性關系，嘗試用非線性的方法進行模型建立效果可能會更好。

圖6 KNN模式識別的訓練集和預測集Fig.6 Calibration and prediction results for identification of five bacilli based on KNN

2.3.3 SVM識別模型

支持向量機是一個有監(jiān)督功能的學習模型，基本原理是遵循結構風險最小化準則構造決策超平面，實現空間點的劃分，從而進行分類識別，具有結構簡單、適應性強、全局最優(yōu)等特點，用于線性和非線性的多元建模[21]。SVM的分類精度主要取決于核函數與參數的選取，先確定懲罰系數C，然后采用網格搜索法對參數進行2次尋優(yōu)計算，確定最優(yōu)的參數(γ,σ2)組合(γ表示正則化參數，σ表示基于RBF核函數的參數)。圖7為2次尋優(yōu)計算過程，尋找的最終組合參數為(1.722 39，38.667 9)(圖中以紅色五角星標記)，SVM訓練集和預測集識別率為91.67%和86.25%。結果表明，基于SVM的5種假單胞菌近紅外光譜分類識別模型效果顯著。

圖7 網格搜索法尋找的最優(yōu)參數組合(γ,σ2)Fig.7 Grid search method to find optimal parameters (γ,σ2)

2.3.4 BP-ANN識別模型

反向傳播神經網絡是一種多層前饋神經網絡算法，基本原理是通過迭代優(yōu)化網絡的權值使得輸入與輸出之間的實際映射關系與所期望的映射關系一致，采用梯度下降算法調整優(yōu)化各層權值，使目標函數最小化，具有很強的自學習性、自適應性、魯棒性以及容錯性等特點，是一種靈活的非線性建模算法[22]。依次選取前10個主成分對應的光譜數據為輸入層，模型的輸出層單元數設為1個(即菌株類別)，傳遞函數為雙曲正切函數(tanh)，初始權重為0.95，訓練過程中的學習因子和動量因子都為0.1，訓練迭代 100次，結果如圖8所示。當主成分為8時，BP-ANN的訓練集和預測集的識別率最高，分別為99.17%和95.00%。

圖8 基于BP-ANN的各主成分的識別率Fig.8 Identification rate of each principal component based on BP-ANN

2.3.5 3種模型比較分析

3種模式識別模型結果如表1所示，近紅外光譜分析技術結合BP-ANN方法識別5種致腐假單胞菌的效果最好。KNN 算法是一種線性的惰性學習方法，該方法不事先建立分類模型，主要靠周圍有限、鄰近的樣本，而不是靠判別類域的方法來確定所屬類別，對于同種不同株的假單胞菌效果不明顯；SVM和BP-ANN都是非線性監(jiān)督機制的學習方法，能有效對同種不同株的假單胞菌進行識別，2種算法能夠多維度地分析光譜信息特點，更適合對同種不同株的假單胞菌進行分類識別。因此，研究采用非線性的模式識別方法對5種假單胞菌進行分類識別，相較于SVM，BP-ANN利用誤差反向傳遞迭代建模，能更有效根據光譜信息區(qū)分種內菌液的化學成分和代謝產物。使用BP-ANN算法對菌種識別效果最好，識別率可以達到95.00%。

表1 基于KNN、SVM和BP-ANN模式的識別率Tab.1 Identification rates based on KNN，SVM and BP-ANN %

3 結論

利用近紅外光譜分析技術結合模式識別方法，實現了雞肉中5種致腐假單胞菌的快速識別：

(1)首先從腐敗雞肉中篩選分離出了相關致腐菌并利用PCR技術鑒定目標菌株分別為蓋氏假單胞菌、嗜冷假單胞菌、莓實假單胞菌和熒光假單胞菌。

(2)運用SNV和SiPLS對光譜預處理和特征波段篩選，篩選的波段為3 999.64～4 597.46 cm-1，6 406.37～7 004.19 cm-1，8 211.41～8 805.38 cm-1和8 809.24～9 403.20 cm-1，這些波段與假單胞菌細胞中核酸、蛋白質、脂肪和糖類等大分子物質含量、構型和構象等信息極相關。

(3)有比較地運用KNN、SVM和BP-ANN建立了5種假單胞菌的分類識別模型。結果表明，主成分為8時的BP-ANN模型預測效果最佳，對應的訓練集識別率為99.17%，預測集識別率為95.00%。

(4)研究表明近紅外光譜分析技術可以快速、準確、無損地識別雞肉中分離的4種致腐假單胞菌單菌種及其混合菌種菌液，將有效實現快速、準確地監(jiān)控雞肉中假單胞菌以及其他致腐微生物的群落組成及其動態(tài)變化，縮短檢測時間，為雞肉貨架期的延長提供了有效的參考。

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Rapid Identification ofPseudomonasspp. in Chicken by Near-infrared Spectroscopy

CHEN Quansheng WANG Mingxing GUO Zhiming FAN Chong SUN Hao ZHAO Jiewen

(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,China)

Pseudomonasspp. is the main bacteria involved chicken degradation which ultimately affects the meat quality and the potential of posing health public health threats. The use of near infrared spectroscopy (NIRS) for rapid identification and monitoring of four strains ofPseudomonasspp. in degrading chicken was attempted. Initially, fourPseudomonasstrains namelyPseudomonasgessardii,Pseudomonaspsychrophila,PseudomonasfragiandPseudomonasfluorescenswere isolated from samples of degrading chicken and identified via polymerase chain reaction (PCR) technology. The different isolatedPseudomonasspp. were cultured in trypticase soy broth (TSB) and incubated at 30℃ for 12 h to growth. The four isolates ofPseudomonasspp. and their combined mixture in equal proportions were all prepared from the incubated inoculum by using 100 mL∶5 mL and each replicated 40 times. The preprocessed data outcomes of the 200 samples using standard normal variable transformation (SNV) exhibited superiority compared with other deployed data preprocessing algorithms such as multiplicative scatter correction (MSC), calibration standard score, first derivative (DB1) and second derivative (DB2). Synergy interval partial least squares (SiPLS) was employed to select relevant characteristics wavelengths such as 3 999.64～4 597.46 cm-1, 6 406.37～7 004.19 cm-1, 8 211.41～8 805.38 cm-1and 8 809.24～9 403.20 cm-1. Principal component analysis (PCA) was performed prior to the model development with loadings of 97.02% in PC1, 2.47% in PC2 and 0.27% in PC3 which indicated the possibility of developing models for the classification of the different samples ofPseudomonasspp. The recognition rates for KNN (65.00%, 63.75%), SVM (91.67%, 86.25%) and BP-ANN (99.17%, 95.00%) were obtained in the training and prediction sets. The model results obtained for SVM was sufficiently high and may be combined with NIRS system for the possiblePseudomonasspp. classification. However, the best result was obtained with BP-ANN built model. These high recognition rates implied near-infrared spectroscopy combined with BP-ANN can be deployed for the rapid detection of differentPseudomonasspp. strains in chicken for the purpose of safeguarding its deteriorating chicken quality.

chicken; near-infrared spectroscopy;Pseudomonasspp.; principal component analysis; artificial neural network

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.08.039

2016-12-16

2017-01-09

國家自然科學基金面上項目(31371770)、江蘇省高校自然科學研究面上項目(16KJB550002)和江蘇大學高級人才基金項目(15JDG169)

陳全勝(1973—)，男，教授，博士生導師，主要從事食品、農產品快速無損檢測研究，E-mail: qschen@ujs.edu.cn

O657.33

A

1000-1298(2017)08-0328-07